L’objectif global de cette procédure est de préparer des tranches aiguës saines de la région dorsale intermédiaire de l’hippocampe pour les enregistrements à long terme et la reconstruction des neurones chez les souris adultes. De nombreux laboratoires comme le nôtre, étudiant l’hippocampe dorsale pour son rôle dans l’apprentissage spécial et la navigation. Les techniques courantes utilisées à cette fin sont les expériences comportementales, le traçage anatomique et les manipulations spécifiques régionales.
Nous avons développé une méthode de tranchage cérébral pour combiner l’électrophysiologie avec ces techniques pour permettre une corrélation directe des invivodata dans les enregistrements vidéo. L’avantage de ce protocole est qu’il combine une procédure simple pour obtenir des tranches transversales avec l’utilisation de la solution protectrice pour améliorer la viabilité du tissu cérébral. Cette approche est particulièrement adaptée lorsque les animaux matures sont utilisés comme dans les expériences comportementales.
Pour commencer cette procédure, préparez à côté de l’évier l’équipement nécessaire pour cette section. Préparer sur glace un bécher de 150 millilitres et deux boîtes de Verre Petri de 10 centimètres de diamètre chacune. Dessinez trois parties des lignes jusqu’au fond d’une boîte de Pétri en plastique et placez ce plat près du plateau de glace.
Vous aurez également besoin de colle et le porte-spécimen pour le vibratome. Équipez ensuite le banc de chirurgie de gros ciseaux, de petites ciseaux, de pinces à pointe arrondie, de pinces à pointe fine, d’une fine spatule métallique, d’une grande spatule métallique et de pipettes de transfert. Peler les boîtes de Pétri avec une solution de coupe.
Un plat pour effectuer la dissection de la tête et l’autre pour la dissection du cerveau. Dans ce dernier, placez également un morceau de papier filtre. Remplissez également le bécher avec une solution de coupe de 30 millilitres.
Cela sera nécessaire pour la perfusion transcardique. Remplissez le plateau vibratome d’une solution de coupe à froid glacée et gardez toute la solution oxygénée à l’assurance d’un dispositif de bouillonnement carbogen. Ajouter la glace concassée faite à partir du lot congelé de solution de coupe à la solution de découpe fraîche et froide pour maintenir la température à un bas.
Faites attention, pour garder la glace de la lame tout en coupant. Presque toutes les étapes après la capitation sont effectuées dans les solutions. Cela aide à maintenir la privation d’oxygène du métabolisme à un minimum.
Préparer une chambre d’incubation remplie d’une solution de coupe sous oxygénation constante. Placez la chambre dans un bain d’eau préchauffé à 35 degrés Celsius. Préparez une chambre de rangement en tranches avec plusieurs puits indépendants et remplissez-la d’une solution de rangement.
Gardez-le sous oxygénation constante à température ambiante. Dans le cas où le tissu exprime une protéine fluorescente ou une opsonine activée par la lumière. Il est recommandé de garder la chambre dans l’obscurité.
Par exemple, à l’intérieur de la boîte. Après avoir effectué la perfusion transcardique, placez la tête de la souris dans la boîte de Petri avec la solution de coupe à froid de glace. Ouvrez la peau avec un ciseaux fin pour exposer le crâne.
En commençant par le magnum foramen, couper le long de la suture sagittale jusqu’à atteindre la suture nasofrontale. Veillez à tirer légèrement vers le haut des ciseaux pour éviter des dommages du cerveau. Faire deux incisions latérales dans la base du crâne.
Utilisez les pinces à pointe arrondie pour tirer vers le haut des os pariétals. Veillez également à enlever les méninges. S’ils sont laissés, ils peuvent endommager le cerveau pendant l’extraction.
Utilisez la petite spatule pour détacher doucement le cerveau de la base du crâne. À l’aide d’une petite spatule, détachez le cerveau des nerfs crâniens et transférez le cerveau sur un petit morceau de papier filtre dans la deuxième boîte de Pétri. Couper le cerveau en deux le long de la fissure longitudinale à l’aide d’une lame pré-refroidie.
Séparez les deux hémisphères à l’aide de la plus petite spatule. Utilisez la plus grande spatule pour transférer un hémisphère dans la boîte de Pétri en plastique avec sa surface médiale face vers le bas. Alignez le cortex pariétal avec l’une des lignes parallèles pour avoir une référence pour la deuxième coupe.
Utilisez un morceau de papier filtre pour sécher l’excès de solution. Placez la lame en parallèle aux lignes et coupez la partie ventrale de l’hémisphère. Cette surface plane sera ensuite collée sur le porte-spécimen.
Remettre l’hémisphère dans la solution de coton oxygéné de la boîte de Pétri en verre et effectuer la même procédure sur le deuxième hémisphère. Placez une goutte de colle cyanoacrylate sur le porte-spécimen vibratome et étalez-la à l’aide d’une spatule pour créer une fine couche. Transférer l’hémisphère sur le support vibratome avec le côté ventral vers le bas en utilisant le côté arrondi de la spatule.
Le démarrage de ce tranchage à partir du cortex pariétal réduirait le temps nécessaire pour recueillir la région dorsale de l’hippocampe. Ajouter quelques gouttes de solution de coupe à froid pour solidifier la colle. Déplacez le porte-spécimen dans le plateau vibratome et, avec des réglages appropriés, tranchez le cerveau jusqu’à ce que la région de l’hippocampe dorsale soit visible.
Ensuite, recueillir les tranches à l’utilisation d’une pipette de transfert en plastique. Transférer chaque tranche dans la chambre d’incubation et laisser reposer pendant 12 minutes. Entre-temps, procéder à la coupe des tranches suivante.
Après les 12 minutes d’incubation, transférer les tranches dans la chambre de stockage. Et laissez-le reposer jusqu’au début de l’expérience. Pour démontrer la pureté de notre préparation, nous la comparons à une préparation coronale qui est couramment utilisée pour enregistrer de l’hippocampe dorsal.
Montré ici sont, micrographe de contraste d’interférence différentiel acquise à partir de la lame supérieure du gyrus bosselé dans les tranches aiguës de souris de deux mois. Dans la tranche transversale, les neurones montraient surtout des surfaces lisses et seulement des bordures probablement contrastées, indiquées par des flèches noires. Les neurones dans les tranches coronals cependant souvent apparu cours et affiché des contours fortement contrastés, indiqués par des flèches blanches.
Cela suggère une meilleure viabilité des neurones dans la tranche transversale. Conformément à cette impression, le temps moyen de formation des phoques pendant le patchage dans nos tranches transversales était beaucoup plus rapide que dans les tranches coronale. En tant que proxy général pour l’intégrité cellulaire, nous en génésions que les potentiels membranaires au repos des cellules granuleuses et des inter neurones positifs parvalbumine qui, là où significativement plus depolariser dans les deux types de cellules dans les tranches coronales par rapport transversales.
Ce qui, en fin de compte, a entraîné beaucoup plus de cellules qui ont dû être exclues dans la préparation coronale. Pendant que les axones de cellules de granule courent dans le plan transversal, la reconstruction des cellules enregistrées a eu comme conséquence la récupération de l’arborisation axonale complète dans notre préparation. Ce n’était pas le cas dans les tranches coronaires où les axones peuvent facilement avoir été sectionnés.
En outre, la reconstruction morphologique des neurones interséminaux positifs parvalbumin dans les tranches transversales a permis la représentation de l’arborisation axonale et dendritique étendue, y compris la visualisation d’un petit détail, tel que les épines dendritiques. Dans l’ensemble, nous avons présenté une méthode de tranchage pour obtenir des tranches transversales d’hippocampe avec une viabilité neuronale élevée pour les souris adultes. Cette méthode peut être utilisée pour mesurer l’investigation in vitro électrophysiologique avec des études anatomiques et comportementales se concentrant sur la partie dorsale intermédiaire de l’hippocampe.
