This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer&#8217;s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.

NOTE: Des expériences ont été menées en conformité avec les normes éthiques approuvés par le Comité de la recherche animale au système de soins de santé Anciens Combattants Palo Alto. 1. Golgi-Cox Coloration <ol><li> l&#39;extraction du cerveau et de la coloration <ol><li> Le 1er jour, anesthésier profondément souris avec 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine avant euthanasie par exsanguination. </li><li> Retirez délicatement la calotte crânienne et disséquer le cerveau. <ol><li> Première enlever la peau sur le dessus du crâne, en plaçant une paire de ciseaux courbes sur le dessus du cervelet et doucement couper à travers la calotte crânienne parallèle au sillon central avec la pointe du ciseau tourné vers l&#39;extérieur, se déplaçant dans la direction vers le bulbe olfactif. Répétez ce processus sur les deux côtés. </li><li> Utilisez un pincet chirurgicale pour soulever la calotte crânienne en le tournant vers les bulbes olfactifs et rompre. Ensuite, retournez le crâne à l&#39;envers et utiliser une pioche pour couper à travers l&#39;optiquenerfs et desserrer le cerveau. Enfin, utilisez le choix de séparer le cerveau de la moelle épinière au niveau du foramen magnum. </li></ol></li><li> Immédiatement immerger le cerveau dans 15 ml de disponible dans le commerce, solution non diluée Golgi-Cox. Rangez le cerveau en solution dans un appareil de Golgi plafonné, 20 ml bouteille en verre à la température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Au 2ème jour, versez lentement la solution et le remplacer par 15 ml de solution fraîche Golgi-Cox. Reboucher la bouteille contenant le cerveau et laisser reposer pendant encore neuf jours dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> Sectionnement et de scellement <ol><li> Sur le 11e jour, placez le cerveau en solution de saccharose à 30%, préparés ddH 2 O pour la déshydratation. Changer la solution fraîchement préparée avec 30% de saccharose après 12 heures. Incuber le cerveau dans une solution de saccharose à 30% pendant 3 jours à 4 ° C. </li><li> Le 14e jour, remplir le réservoir de la vibratome avec une solution de saccharose à 30% jusqu&#39;à ce que la lame est couvert. Réglez la vitesse à 1 mm / s avec une amplitude de 0,95 mm. </li><li> Éponger les cerveaux avec un Kimwipe pour enlever l&#39;excès d&#39;humidité et retirez le cervelet en utilisant une lame de rasoir pour couper coronaire. </li><li> Fermement monter l&#39;ensemble du cerveau sur la plate-forme de vibratome utilisant superglue et laisser reposer pendant 2-4 min. Insérer la plate-forme avec le cerveau collée dans le réservoir et régler la lame à la partie supérieure du cerveau. </li><li> Utilisation du vibratome, découper le cerveau en 150 sections um d&#39;épaisseur à la température ambiante, sans oublier de changer la lame après chaque 3ème cerveau. </li><li> Ramassez les sections du réservoir à l&#39;aide d&#39;une petite brosse à pointe et plongez-les dans une boîte de Pétri contenant 0,3% de gélatine faite en ddH 2 O. Bien que les sections restent dans la boîte de Pétri, ajouter 0,5 ml de 0,3% de gélatine sur chaque diapositive et utilisez une brosse à se répandre et enduire les SuperFrost + diapositives. </li><li> Prendre doucement les sections immergées de la boîte de Pétri et placez-les sur les lames gélatinisées. Orienter les sections de cerveau parles toucher uniquement sur leurs côtés et non sur les sommets. </li><li> Après environ dix minutes, enrober les sections avec 30% de saccharose avant que le tissu sèche complètement. Puis sécher à l&#39;air les lames préparées dans un endroit sombre dans un rack coulissant pour trois jours. </li><li> Diluer disponible dans le commerce 10x solution de développement à 1x utilisant ddH 2 O. Plonger les lames dans la solution de développement pour les 7-10 min. Rincer les lames trois fois en ddH 2 O. </li></ol></li><li> Déshydration <ol><li> Préparer 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, et des solutions d&#39;éthanol 95% en utilisant distillée ddH 2 O. </li><li> Faire tremper les lames dans des solutions d&#39;éthanol plus en plus élevés pendant 10 minutes chacun. </li><li> Faire tremper les lames dans une solution d&#39;éthanol à 100% trois fois pendant 10 min à chaque fois. </li><li> Faire tremper les lames dans 100% xylène trois fois de suite à 5 min chacun, en gardant les sections dans la solution finale jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient couvercle-glissé. </li><li> Placez une quantité généreuse de DPX (phtalate de di-n-butyle dans le xylène) milieu de montage (absur 1 à 1,5 ml) sur chaque diapositive à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert en plastique. Placez délicatement lamelles pour éviter les bulles. </li><li> Couverture sèche-Air glissé cerveau sections horizontalement pour trois jours. </li></ol></li></ol> 2. Doublecortin coloration <ol><li> Profondément anesthésier (voir l&#39;étape 1.1.1) les animaux. </li><li> Effectuer perfusion cardiaque avec fraîchement préparé paraformaldéhyde à 4% faite dans un tampon phosphate 12. </li><li> Extraire le cerveau (voir 1.1.2) et entreposer dans 45 ml de paraformaldéhyde 4% à 4 ° C pendant la nuit sur un agitateur à bascule. </li><li> Transférez les cerveaux à une solution de saccharose à 30% et d&#39;attendre déshydratation complète pendant 48 heures à 4 ° C. Retirez les cerveaux à partir de saccharose et de les placer directement sur des blocs de cuivre placés sur de la glace sèche. </li><li> Remplir le bloc à température de coupe optimale (OCT) et composé marquer l&#39;orientation du cerveau en utilisant le bulbe olfactif comme point de repère. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un cryostat, couper 70 sections microns d&#39;épaisseur à -20 ºC et placez-lesdans une solution de cryoprotecteur (25% d&#39;éthylèneglycol, 25% de glycerol, dans un tampon de phosphate de sodium 0,05 M, pH 7,4) et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Ajouter une solution de methanol à 50% et 50% cryoprotecteur. Ajouter à cette solution 0,5% de peroxyde d&#39;hydrogène (vol / vol). Incuber les coupes flottantes pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Sections chaudes à 37 ° C dans du TBS (solution saline tamponnée au Tris) pour 30 à 40 min en les plaçant dans un four histologique. </li><li> Incuber les sections avec 0,3% de Triton et 3% de sérum de cheval normal à 45 min à température ambiante avant immunocoloration. Incuber les sections pendant une nuit à 4 ° C dans 3 ml de solution de l&#39;anticorps DCX dilué à 1: 500 dans du TBS avec 0,3% de Triton et 1% de sérum normal de cheval. </li><li> Le lendemain, laver les sections 3 fois de suite dans du TBS (10 min chacun). </li><li> Incuber les coupes avec un anti-chèvre de cheval biotinylé (1: 200 dans du TBS) pendant deux heures à la température ambiante. Laver les sections 3 fois de suite dans du TBS (10 min chacun). </li><li> Incuber tourlet avec ABC Lite (1: 1000) pendant 1,5 heure à température ambiante. </li><li> Ajouter 5 ul de 30% de H 2 O 2 à un comprimé de 10 mg de DAB (3,3 &quot;-Diaminobenzidine) solution dissous dans 15 ml de 1 M de Tris-HCl (pH 7,6). Incuber les sections immédiatement dans cette solution pendant 5 min. </li><li> Terminer la réaction en les lavant avec de la glace froide SCT trois fois suivi par un lavage dans du TBS à la température ambiante. </li><li> Déshydrater sections en utilisant une série de solutions d&#39;éthanol (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 minutes chacun), clarifier dans le xylène, puis lamelle en utilisant DPX comme dans l&#39;étape 1.3. </li></ol> 3. Visualisation <ol><li> Après séchage complet des sections, enlever l&#39;excès de DPX au-dessus des lames avec une lame tranchante, et placez-les sur la scène du microscope à balayage. Le système est composé d&#39;un microscope équipé d&#39;étape de balayage, manette de jeu, et une caméra couleur de 12 bits. </li><li> Démarrez le programme. Ouvrez un nouveau fichier de données. </li><li> Lieuun point sur l&#39;écran de référence en cliquant avec le pointeur de la souris à ne importe quel endroit. Cela permettra d&#39;activer toutes les icônes de la palette d&#39;outils de la fenêtre de programme. </li><li> Cliquez sur l&#39;icône &quot;Joystick gratuit&quot; sur la barre d&#39;outils, puis utilisez le joystick pour localiser le gyrus denté de l&#39;hippocampe dans la première section. </li><li> Dans l&#39;onglet &quot;Outils&quot; de la fenêtre de programme, sélectionnez &quot;chef de section de série&quot;. Cliquez sur l&#39;icône &quot;Nouvelle section&quot; dans le coin inférieur gauche de la fenêtre. Cela va ouvrir la fenêtre &quot;Section de configuration de série&quot;. </li><li> Sélectionnez la fenêtre Section de configuration de série, puis entrez le nombre total de sections qui contiennent des régions de l&#39;hippocampe. Sélectionnez l&#39;intervalle d&#39;évaluation. Entrez l&#39;épaisseur section de coupe (70 um pour DCX et 150 um pour les sections Golgi colorées). </li><li> Commencer à tracer la région de gyrus denté en cliquant sur l&#39;icône &quot;Freehand Dessin des contours&quot; dans la barre d&#39;outils. Décrire la couche de cellules granulaires dentées. &lt;/ Li&gt; <li> Sélectionnez &quot;100X&quot; dans le menu &quot;Agrandissement&quot;. Ajouter une goutte d&#39;huile d&#39;immersion sur la section et passer l&#39;objectif de 100X. Repérez les organismes et les dendrites des cellules granulaires dentés cadre de cet objectif. </li><li> Focus sur un neurone sélectionné et cliquez sur l&#39;icône &quot;Neuron Tracing&quot; sur la barre d&#39;outils. Trace de la circonférence du corps de cellules granulaires dentées. Lorsque vous avez terminé le traçage, cliquez sur la droite pour sélectionner &quot;Terminer cellulaire du corps&quot;. </li><li> Commencer à tracer les dendrites manuellement en X, Y et Z et suivre chaque branche en utilisant le bouton du joystick et z-moteur. À un noeud de bifurcation ou trifurcation, sélectionnez l&#39;option correspondante dans le menu déroulant sur clic-droit. Trace chacune des branches qui découlent de ces noeuds. À la fin de chaque branche clic droit et sélectionnez &quot;Ending&quot; dans le menu déroulant. </li><li> En utilisant les icônes des touches fléchées dans la fenêtre du logiciel de sélectionner au hasard un autre cellules granulaires dentées et suivez la même procédure que described à l&#39;étape 3/9 à 3/10. Enregistrer l&#39;ensemble du tracé. </li><li> Démarrez le logiciel de traçage neuronale. </li><li> Ouvrir le premier fichier de données à partir de la première NRX souris du groupe expérimental. Ajoutez le fichier NRX de la deuxième souris du groupe expérimental. Continuez jusqu&#39;à ce que tous les fichiers NRX de ce groupe sont ajoutés. </li><li> Sous l&#39;onglet Analyse, sélectionnez &quot;Fan Dans diagramme&quot;. Cela ouvre la fenêtre Dans Fan-analyse. Coche «dendrites» et cliquez sur Affichage, qui représente les longueurs et une ramification de dendrites pour ce groupe de souris (Figure 1). </li></ol> 4. EDFI Remarque: cette méthode permet à l&#39;utilisateur d&#39;enregistrer rapidement un grand nombre d&#39;images à travers l&#39;axe des z de chaque champ et de générer une image 2D qui contient tous les pixels focalisés à travers l&#39;axe z. Le résultat sera une image composite qui contient tous les pixels ciblées à partir d&#39;images collectées. <ol><li> Connectez le microscope à une caméra numériqueépoque. Placez les premières sections sur la scène de balayage connecté au microscope, puis passer à un objectif 10X. Déplacez la scène pour la zone d&#39;intérêt. </li><li> Lancer un programme de capture vidéo. </li><li> Appuyez sur le bouton d&#39;enregistrement. Dès que le bouton d&#39;enregistrement est pressée, utilisez le bouton macro-focus de passer du haut vers le bas de la section pour un total de 4 sec. Enregistrez le fichier vidéo résultant. </li><li> Utilisez ImageJ freeware pour convertir les fichiers vidéo AVI dans un format non compressé en ouvrant le fichier et de les enregistrer au format de fichier non compressé. </li><li> Lancer un programme d&#39;analyse d&#39;images et ouvrir le fichier AVI. Aller au menu &quot;Processus&quot; et cliquez sur &quot;profondeur de champ étendue». Sélectionnez le fichier vidéo correspondant. Dans options &quot;de sortie&quot;, sélectionnez &quot;Générer Composite Meilleur-Focus Image&quot;. </li><li> Dans options &quot;Analyse bref&quot;, sélectionnez &quot;normalisé Illumination&quot; et les options &quot;Max&quot; de contraste local. Ensuite, sélectionnez &quot;Cremangé &quot;. L&#39;image résultante représente l&#39;ensemble des pixels focalisés à travers l&#39;axe z (figure 2). </li><li> Enregistrer l&#39;image résultante. </li></ol> 5. Génération Résolution Images très haute NOTE: Cette méthode permet à l&#39;utilisateur de générer automatiquement un faible grossissement et images de très haute résolution à partir d&#39;images à fort grossissement à haute résolution d&#39;une manière automatisée. <ol><li> Placer les sections de la première étape de balayage connecté au microscope. Le microscope est connecté à un appareil photo numérique. Déplacez la scène pour la zone d&#39;intérêt. </li><li> Lancer un programme d&#39;acquisition d&#39;image. </li><li> Utilisez un objectif 10X et d&#39;acquérir et sauvegarder haute résolution (4076 x 3116) des images de la région d&#39;intérêt en se assurant d&#39;avoir au moins 10% de chevauchement. </li><li> Image d&#39;exécution Composite Editor d&#39;assembler des images. </li><li> Allez dans le menu Fichier, puis cliquez sur &quot;Nouveau Panorama&quot;. Sélectionnez le dossier dans lequel les images sont stORed. Sélectionnez les images qui appartiennent à la même région et appuyez sur &quot;ok&quot;. </li><li> Appuyez sur le bouton &quot;Exporter sur le disque&quot; et enregistrer l&#39;image. Cette image représente une image de très haute résolution de la zone d&#39;intérêt qui pourrait être utilisé pour l&#39;analyse et / ou de démonstration (Figure 3). </li></ol>

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Publication frais pour cet article sont parrainés par MBF Bioscience.

Ici, deux méthodes ont été décrites pour quantifier l&#39;ampleur de l&#39;arborisation dendritique dans les neurones matures et les nouveaux-nés en utilisant des méthodes classiques de coloration en collaboration avec RTI et EDFI. L&#39;acquisition d&#39;images haute résolution de neurones fournit une méthode extrêmement utile pour tester les effets délétères des troubles neurodégénératifs et, à son tour, fournit un moyen d&#39;évaluer les stratégies thérapeutiques qui ciblent les neurones de l&#39;h...

Modifications dynamiques dans le nombre et la structure des synapses sont les caractéristiques de développement, le vieillissement, et de nombreux troubles neurodégénératifs 1-3. La capacité des neurones à recevoir et à intégrer l&#39;information synaptique dépend de la morphologie dendritique et modifications dynamiques dans les connexions synaptiques. En effet, une corrélation positive existe entre épines dendritiques et le nombre de synapses, qui à la fois un impact fonction cognitive 4. Ainsi, il ne est pas surprenant que les dégradations de nombre d &#39;épines dendritiques ont été associés à un dysfonctionnement cognitif dans un certain nombre de troubles neurologiques 5-7, incitant un grand intérêt pour la quantification des épines dendritiques. Cependant, la quantification de la densité de la colonne vertébrale reste un temps long et fastidieux qui ne parvient pas à générer des informations utiles concernant la topographie et la distribution des synapses à travers l&#39;arbre dendritique. Heureusement, les méthodes de coloration (par exemple, l&#39;appareil de Golgi-Cox et doublecortine (DCX)) en conjonctionavec des techniques d&#39;imagerie sophistiquées peuvent être utilisées pour surmonter les obstacles actuels et produire des images haute résolution de l&#39;arborisation dendritique d&#39;une manière fiable et rapide. Alors que méthode de coloration de Golgi-Cox peut être déployée pour évaluer l&#39;état de l&#39;arborisation dendritique dans tous les neurones 8, DCX peut être déployé pour étiqueter neurones nouveau-nés en particulier dans le gyrus denté et la zone sous-ventriculaire 9, une considération importante étant donné que la neurogenèse se produit à la fois ces régions tout au long de la durée de vie 10,11. Après la coloration, deux méthodes d&#39;imagerie ont été déployés pour évaluer les caractéristiques dendritiques: i) l&#39;imagerie en temps réel (RTI) et ii) la profondeur de l&#39;imagerie de champ (EDFI) étendu. La technique RTI fournit un moyen de retracer et de quantifier la longueur et l&#39;ordre des arborisation le long des segments et des branches dendritiques individuelles. Ainsi il permet une estimation de la surface totale et le volume occupé par chaque arbre dendritique. Plus de specifically, dans le procédé RTI l&#39;utilisateur identifie de façon continue les segments et recentre itérative comme le neurone traçage logiciel recueille les x, y et z des coordonnées de la structure dendritique et reconstitue la trajectoire de la structure dendritique en 3D. En comparaison, la méthode EDFI fournit un moyen assez simples et rapides pour évaluer la densité dendritique dans des échantillons de tissus assez épaisses en générant une image composite, fournissant des informations sur l&#39;ensemble de l&#39;axe z. Pour ce faire, l&#39;utilisateur enregistre des fichiers vidéo à haute définition sur toute l&#39;épaisseur de la section puis utilise un logiciel pour rechercher les images vidéo pour identifier les points dans lequel un pixel est entièrement mis au point. Par la suite, les pixels ciblées sont fusionnés et intégrés dans une haute résolution, image 2D composite. Cette image composite contient tous les pixels qui sont de mise au point quelle que soit leur position dans l&#39;axe z. L&#39;analyse qualitative et quantitative de ces images en 2D peut être utilisé par la suite pour déterminer la densitéramification dendritique de chaque zone. Enfin, nous présentons une méthode pour générer panoramique images de très haute résolution pour l&#39;analyse et l&#39;évaluation des dendrites dans toute une région d&#39;intérêt. Cette technique peut être déployé pour surmonter le manque d&#39;accès à très haute résolution et les appareils photo numériques coûteux. En utilisant cette méthode, permet de capturer des images en série à différents endroits le long du x et y axes et ensuite automatiquement des points les ensemble en utilisant un logiciel (par exemple, Image Composite Editor). En particulier, ce procédé peut être utilisé pour l&#39;évaluation qualitative et quantitative de l&#39;arborisation dendritique dans un assez large domaine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="960">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:272px;">Name</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:267px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Modified Golgi-cox staining solution&#160;</td>
			<td style="width:263px;">Weill Cornell Medical College</td>
			<td style="width:267px;">NA</td>
			<td style="width:159px;">store at 4&#176;C till use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">1x Developing Solution (Stock 10x)</td>
			<td style="width:263px;">Weill Cornell Medical College</td>
			<td style="width:267px;">NA</td>
			<td style="width:159px;">store at 4&#176;C till use</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:272px;">30% Sucrose,</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 57-50-1</td>
			<td style="width:159px;">make fresh &#160;in ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">0.3% Gelatin</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 9000-70-8</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:272px;">Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS 603-003-00-5</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Xylene</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS # 1330-20-7</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DPX Medium</td>
			<td style="width:263px;">EMS&#160;</td>
			<td style="width:267px;">#13510</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost (+) white</td>
			<td style="width:263px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:267px;">71869-10</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)</td>
			<td style="width:263px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:267px;">#4811-703</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DCX Antibody</td>
			<td style="width:263px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:267px;">sc-8066</td>
			<td style="width:159px;">4 C</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">DAB</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS Number 91-95-2 &#160;</td>
			<td style="width:159px;">-20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">OCT</td>
			<td style="width:263px;">Tissue-tek</td>
			<td style="width:267px;">4583</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Tris</td>
			<td style="width:263px;">Sigma</td>
			<td style="width:267px;">CAS Number 77-86-1 &#160;</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">ABC Lite</td>
			<td style="width:263px;">Vector</td>
			<td style="width:267px;">PK4000</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:272px;">Name</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:267px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">DS-Ri1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">12 bit Camera&#160;</td>
			<td style="width:263px;">QImaging&#160;</td>
			<td>01 MBF2000RF-CLR-12</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Neurolucida System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td style="width:267px;">V.10</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Image Composite Editor</td>
			<td style="width:263px;">Microsoft</td>
			<td>1.4.4.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">NIS Elements</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:267px;">F 3.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Image Pro Plus</td>
			<td style="width:263px;">Mediacy</td>
			<td>Versin 7.00</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of dendritic arborization in the dentate gyrus of the hippocampal region in mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

L&#39;étendue de l&#39;arborisation résultant de cellules granulaires du dentate existants et nouveaux-nés a été analysée chez des souris de type sauvage en utilisant soit Golgi-Cox ou DCX coloration (figure 1). Segments de cellules dendritiques DCX-positifs ont été trouvés pour être de 13 à 36 microns de long. La distribution normale de longueur dendritique a été testé en utilisant le test de Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p &lt;0,01, Liliefors p &lt;0,001; les figures 4...

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Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Évaluation de l&#39;arborisation dendritique dans le gyrus denté de la région de l&#39;hippocampe chez la souris

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

assessment-dendritic-arborization-dentate-gyrus-hippocampal-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.2K vues.  VA Palo Alto Health Care System. We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

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Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisation des propriocepteurs dans<em&gt; Drosophila</emLes larves&gt; et pupes

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Recherche

Neurosciences

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

L’utilisation de Trace Eyeblink conditionnement de classique pour évaluer le dysfonctionnement hippocampique dans un modèle de Rat de Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Évaluation de la complexité dendritique de l&#39;hippocampe chez les souris vieillies utilisant la méthode de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

An Invasive Method for the Activation of the Mouse Dentate Gyrus by High-frequency Stimulation

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for various neurological and psychiatric disorders. HFS in the deep region of the brain, also named deep-brain stimulation (DBS), is becoming increasingly important in clinical trials. Recent progress in the field of high-frequency DBS (HF-DBS) surgery has begun to spread the possibility of utilizing this invasive technique to other situations, such as treatment for major depression disorder (MDD), obsessive-compulsive disorder (OCD), and so on. 
Despite these expanding indications, the underlying mechanisms of the beneficial effects of HF-DBS remain enigmatic. To address this question, one approach is to use implanted electrodes that sparsely activate distributed subpopulations of neurons by HFS. It has been reported that HFS in the anterior nucleus of the thalamus could be used for the treatment of refractory epilepsy in the clinic. The underlying mechanisms might be related to the increased neurogenesis and altered neuronal activity. Therefore, we are interested in exploring the physiological alterations by the detection of neuronal activity as well as neurogenesis in the mouse dentate gyrus (DG) before and after HFS treatment. 
In this manuscript, we describe methodologies for HFS to target the activation of the DG in mice, directly or indirectly and in an acute or chronic manner. In addition, we describe a detailed protocol for the preparation of brain slices for c-fos and Notch1 immunofluorescent staining to monitor the neuronal activity and signaling activation and for bromodeoxyuridine (BrdU) labeling to determine the neurogenesis after the HF-DBS induction. The activation of the neuronal activity and neurogenesis after the HF-DBS treatment provides direct neurobiological evidence and potential therapeutic benefits. Particularly, this methodology can be modified and applied to target other interested brain regions such as the basal ganglia and subthalamic regions for specific brain disorders in the clinic.

This protocol shows how to set up a reliable HFS method in mice. Neurons throughout the hippocampal dentate gyrus are electrically stimulated by HFS directly and indirectly in vivo. Neuronal activity and molecular signaling are examined by c-fos and Notch1 immunofluorescent staining, respectively; neurogenesis is quantified by bromodeoxyuridine labeling assay.

Une méthode Invasive pour l’Activation du Gyrus denté souris par Stimulation haute fréquence

Electrical high-frequency stimulation (HFS), using implanted electrodes targeting various brain regions, has been proven as an effective treatment for ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

La puissance de l’intervalle Interstimulus pour l’évaluation du traitement temporel chez les rongeurs

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

Préparation de tranches aiguës de l’hippocampe dorsal pour l’enregistrement des cellules entières et la reconstruction neuronale dans le gyrus bosselé de souris adultes