Name: preparation of acute slices from dorsal hippocampus for whole-cell recording and neuronal reconstruction in the dentate gyrus of adult mice
Uploaded: 2021-04-03T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice at JoVE.com

ونشكر كيرستن كرونبيتر وديدير غريميل على المساعدة التقنية. نشكر أومبرتو موريلي على المساعدة في برامج الجرافيك وماتياس هوب لفيديو التصوير، وتحرير الفيديو. تم دعم العمل في مختبرنا من قبل دويتشه Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143 ، SFB 1461 (Project-ID 434434223) وGK2154 ، ومنحة مجلس البحوث الطبية G1100546 /2 وجامعة كييل.

<ol>
	<li>Amaral, D. G., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+organization+of+the+hippocampal+formation:+a+review+of+anatomical+data.">The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data.</a> Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).</li><li>Fanselow, M. S., Dong, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+the+dorsal+and+ventral+hippocampus+functionally+distinct+structures.">Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures.</a> Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).</li><li>David, A., Pierre, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+Neuroanatomy.">Hippocampal Neuroanatomy.</a> The Hippocampus Book. , 37-114 (2006).</li><li>Dong, H. W., Swanson, L. W., Chen, L., Fanselow, M. S., Toga, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic-anatomic+evidence+for+distinct+functional+domains+in+hippocampal+field+CA1.">Genomic-anatomic evidence for distinct functional domains in hippocampal field CA1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (28), 11794-11799 (2009).</li><li>Royer, S., Sirota, A., Patel, J., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+representations+and+theta+dynamics+in+dorsal+and+ventral+hippocampus.">Distinct representations and theta dynamics in dorsal and ventral hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 30 (5), 1777-1787 (2010).</li><li>Lisman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viewpoints:+how+the+hippocampus+contributes+to+memory,+navigation+and+cognition.">Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition.</a> Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).</li><li>Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiny+and+Non-spiny+Parvalbumin-Positive+Hippocampal+Interneurons+Show+Different+Plastic+Properties.">Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties.</a> Cell Rep. 27 (13), 3725-3732 (2019).</li><li>Cembrowski, M. S., Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+within+classical+cell+types+is+the+rule:+lessons+from+hippocampal+pyramidal+neurons.">Heterogeneity within classical cell types is the rule: lessons from hippocampal pyramidal neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20 (4), 193-204 (2019).</li><li>Moser, M. B., Moser, E. I., Forrest, E., Andersen, P., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+learning+with+a+minislab+in+the+dorsal+hippocampus.">Spatial learning with a minislab in the dorsal hippocampus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9697-9701 (1995).</li><li>Pothuizen, H. H., Zhang, W. N., Jongen-Relo, A. L., Feldon, J., Yee, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+function+between+the+dorsal+and+the+ventral+hippocampus+in+spatial+learning+abilities+of+the+rat:+a+within-subject,+within-task+comparison+of+reference+and+working+spatial+memory.">Dissociation of function between the dorsal and the ventral hippocampus in spatial learning abilities of the rat: a within-subject, within-task comparison of reference and working spatial memory.</a> European Journal of Neuroscience. 19 (3), 705-712 (2004).</li><li>Fredes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventro-dorsal+Hippocampal+Pathway+Gates+Novelty-Induced+Contextual+Memory+Formation.">Ventro-dorsal Hippocampal Pathway Gates Novelty-Induced Contextual Memory Formation.</a> Current Biology. 31 (1), 25-38 (2021).</li><li>Schwartzkroin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+CA1+neurons+recorded+intracellularly+in+the+hippocampal+in+vitro+slice+preparation.">Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation.</a> Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).</li><li>Andersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+facilitation+of+synaptic+transmission.">Long-lasting facilitation of synaptic transmission.</a> Ciba Foundation Symposium. (58), 87-108 (1977).</li><li>Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+dentate+gyrus+granule+cells:+comparison+of+sharp+microelectrode+and+whole-cell+recordings.">Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings.</a> Journal of Neurophysiology. 67 (5), 1346-1358 (1992).</li><li>Walther, H., Lambert, J. D., Jones, R. S., Heinemann, U., Hamon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptiform+activity+in+combined+slices+of+the+hippocampus,+subiculum+and+entorhinal+cortex+during+perfusion+with+low+magnesium+medium.">Epileptiform activity in combined slices of the hippocampus, subiculum and entorhinal cortex during perfusion with low magnesium medium.</a> Neurosci Lett. 69 (2), 156-161 (1986).</li><li>Rafiq, A., DeLorenzo, R. J., Coulter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+propagation+of+epileptiform+discharges+in+a+combined+entorhinal+cortex/hippocampal+slice.">Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex/hippocampal slice.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (5), 1962-1974 (1993).</li><li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+(P25-30)+rats.">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li><li>Davie, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+patch-clamp+recording.">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).</li><li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices.">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).</li><li>Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+Synaptic+Plasticity+in+Acute+Hippocampal+Slices+Maintained+in+a+Small-volume+Recycling-,+Perfusion-,+and+Submersion-type+Chamber+System.">Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e55936 (2018).</li><li>Dougherty, K. A., Islam, T., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+excitability+of+CA1+pyramidal+neurones+from+the+rat+dorsal+and+ventral+hippocampus.">Intrinsic excitability of CA1 pyramidal neurones from the rat dorsal and ventral hippocampus.</a> Journal of Physiology. 590 (22), 5707-5722 (2012).</li><li>Tidball, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ability+of+the+dorsal+and+ventral+rat+hippocampus+to+exhibit+group+I+metabotropic+glutamate+receptor-dependent+synaptic+and+intrinsic+plasticity.">Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity.</a> Brain and Neuroscience Advances. 1 (1), (2017).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system.">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Archives. 414 (5), 600-612 (1989).</li><li>Djurisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+Hypoxia+in+Hippocampal+Slices+from+Adult+and+Aging+Mice.">Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61377 (2020).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols, 2nd Edition. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).</li><li>Booker, S. A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+patch-clamp+recordings+from+morphologically-+and+neurochemically-identified+hippocampal+interneurons.">Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51706 (2014).</li><li>Norenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+nonuniform+cable+properties+optimize+rapid+and+efficient+activation+of+fast-spiking+GABAergic+interneurons.">Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 894-899 (2010).</li><li>Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+Biocytin-filled+and+Processed+Sections+for+Neurochemical+Markers.">Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54880 (2016).</li><li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage.">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Murray, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory.">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 297-299 (2011).</li><li>Otis, T. S., Staley, K. J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perpetual+inhibitory+activity+in+mammalian+brain+slices+generated+by+spontaneous+GABA+release.">Perpetual inhibitory activity in mammalian brain slices generated by spontaneous GABA release.</a> Brain Research. 545 (1-2), 142-150 (1991).</li><li>Varela, C., Llano, D. A., Theyel, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+in+vitro+slice+approaches+for+the+study+of+neuronal+circuitry.">An introduction to in vitro slice approaches for the study of neuronal circuitry.</a> Neuromethods. 67, 103-125 (2012).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

وقد تمت دراسة الحصين الظهري على نطاق واسع لدوره في التعلم المكاني والملاحة أساسا من خلال التجارب السلوكية، وتتبع التشريحية، والتلاعب منطقة محددة. للجمع بين شريحة electro-الفسيولوجية الاستفسارات مع هذه التقنيات، قمنا بتجميع بروتوكول يستخدم زاوية مماثلة من قسم كما تشريح الأفقي المعدلة للمنطقة المتوسطة ventral من قرن آمون، ولكن يستخدم ترتيب تشريح مقلوب للحصول على شرائح في وقت مبكر من المنطقة الظهرية المتوسطة. هذا النهج يقلل من الوقت اللازم لشريحة وجمع منطقة الظهر من قرن آمون، وبالتالي تعزيز الشرائح قابلية البقاء.
باستخدام هذه الطريقة، ونحن قادرون على استرداد نحو 3 شرائح في نصف الكرة الأرضية من منطقة الحصين الظهرية بين 1.4 مم-2.4 مم من سطح بسال، كما هو مبين في الشكل 1C. على الرغم من أنه من غير الممكن مع هذا الإجراء للحصول على شرائح عرضية من القطب الحاجز جدا من قرن آمون، فمن الممكن لجمع حوالي اثنين من شرائح غير قابلة للحياة في نصف الكرة الأرضية من القطب الحاجز(الشكل 1C الثاني، iii). إذا كان القطب الحاجز من قرن آمون هو التركيز البحث الأولية، بروتوكولات أخرى، والتي تسمح بجمع شرائح عرضية، وخاصة من القطب الحاجز جدا من الحصين، قد تكون أكثر ملاءمة21،32. ويفضل إجراء التجارب السلوكية على الملاحة المكانية والتعلم في الفئران الناضجة مع اتصال الخلايا العصبية المتقدمة بالكامل. وبالتالي، قمنا بتحسين إجراءاتنا الخاصة بالتقطيع للتطبيق على أدمغة الحيوانات البالغة (الموضحة هنا لمدة ثلاثة أشهر من الفئران)، والتي هي أكثر حساسية للإجهاد من إعداد الأحداث المرن. وتحقيقا لهذه الغاية قمنا الجمع بين العديد من الاستراتيجيات التي تقلل من الإجهاد نقص الأكسجة المخ يتعرض في الوقت بين استخراج ووضع شرائح في ACSF المؤكسج. الحل هو الواقية من قطع ACSF25,27,28 مع منخفضة Na+ و Ca2+ ولكن عالية ملغ2 + للحد من الضرر excitotoxic وتورم الخلية بسبب تنشيط مستقبلات NMDA. بالإضافة إلى ذلك، يوفر HEPES التخزين المؤقت المستقر والمركبات مثل أسكوربات و بيروفات يقلل من الإجهاد التأسدي. القذف عبر cardial مع المبردة والأكسجين حل قطع واقية يستفيد من شبكة شعرية كثيفة للغاية تزويد الدماغ للحد بسرعة ومتجانس الطلب الأيضي والغلوتامات الناجمة عن exciticicity في أنسجة الدماغ. في وقت لاحق ما يقرب من جميع الخطوات التالية لقطع الرأس يتم تنفيذها داخل حلول مبردة والأكسجين للحفاظ على التمثيل الغذائي والحرمان من الأكسجين إلى الحد الأدنى خلال الإجراء بأكمله. وهناك استراتيجيات أخرى للحد من تلف الدماغ أثناء تشريح موجودة، ويمكن أن تكون صالحة على قدم المساواة38. لإظهار جودة إعدادنا ، قارناها بإعداد شريحة إكليلية ، والذي يستخدم عادة للتسجيل من الحصين الظهري. على الرغم من أن شرائح الإكليلية يمكن استخدامها للحصول على تسجيل جيد رقعة المشبك في gyrus dentate, عدد الخلايا العصبية غير صحية وقطع أعلى مما كانت عليه في شريحة عرضية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم الحفاظ على سلامة ال arborizations محور عصبي وتشعب أفضل في شريحة عرضية. كما واقع الأمر سلامة محاور العجلة الخلية الحبيبية (الشكل 3A) ، والتي تعمل متعامد إلى المحور الطولي من الحصين بمثابة مؤشر على طائرة التقطيع عرضية1.
لملء الخلايا العصبية المصححة، نقترح مقاومة القطب بين 3 و 5 MΩ. قطر من غيض من حوالي 1 ميكرومتر، يسمح إنجاز المقاومة ختم جيدة أثناء التسجيل وجيدة إعادة الختم عند التراجع القطب. التفاصيل الأكثر أهمية هي تجنب شفط أجزاء من سوما أو نواة في ماص. لهذا السبب، نقترح تضمين صبغة أليكسا في الحل داخل الخلايا عندما يكون ذلك ممكناً. تسمح الصبغة بمراقبة شكل الخلية أثناء التسجيل وإعادة الختم. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح لتقييم سلامة الخلية المصححة بعد التثبيت، والتي يمكن أن توفر الوقت المناعة الستويستوتيستري، في حالات الحشوات غير الناجحة. بسبب صبغات اليكسا هي إخماد مع وقت التثبيت الطويل، ونحن نقترح تثبيت قصيرة إذا كان ذلك ممكنا.
بالنسبة للمناعة اللاحقة، نستخدم بروتوكولًا لا يتطلب إعادة تقطيع الشريحة. نقترح جعل تلطيخ في غضون أسبوع واحد بعد التثبيت. كلما طالت مدة بقاء الشرائح في الثلاجة، كلما ارتفعت فرصة تدهور الأنسجة. إذا تعذر تجنب التخزين الطويل، نقترح زيادة تركيز NaN3 في برنامج تلفزيوني إلى 0.05٪ وتحديثه أسبوعيًا. مناعة من شريحة كاملة يعني أن أوقات الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية زيادة. عادة، للكشف biocytin، حضانة واحدة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية يكفي، ولكن إذا جنبا إلى جنب مع تلطيخ للبروتينات الأخرى، يمكن أن تستمر عملية تلطيخ كامل لفترة أطول من ذلك بكثير. يجب تحسين منع التجوّل وحضانة الجسم المضادة بشكل فردي. عادة، بالنسبة للجسم المضاد الأساسي، يومين كافية في حين أن يوم واحد يمكن أن يكون كافيا للثانوي. نوصي بزيادة مدة الغسيل الخطوات جنبا إلى جنب مع حضانات الأجسام المضادة أطول لتجنب زيادة الخلفية.
في هذا البروتوكول قد قدمنا طريقة تشريح للحصول على شرائح فرس النهر عرضية أو تقريبا عابرة الحفاظ على صلاحية الخلايا العصبية من الأنسجة البالغة ونهج عملي لاستعادة مورفولوجيا والهوية الكيميائية العصبية من الخلايا العصبية مصححة. يمكن إجراء هذه الطريقة بسهولة لمطابقة النتائج الكهرو فسيولوجية مع الدراسات التشريحية والسلوكية التي تركز على الجزء المتوسط الظهري من قرن آمون.

وقد درس الحصين على نطاق واسع لدوره المحوري في جوانب مختلفة من التعلم والذاكرة، والملاحة المكانية، فضلا عن العاطفة. إن الدوائر الأساسية في الحصين، والتي تسمى عادة "الدائرة الثلاثية" هي شبكة من اللاميكار في المحور العرضي، والتي يتم الحفاظ عليها إلى حد كبير على طول المحور الطولي1. من المحتمل أن تنشأ مساهمات قرن آمون في مختلف السلوكيات المعرفية والعاطفية من الاتصالات المتنوعة التي تقوم بها هذه الدوائر الأساسية على طول محور دورسوفينرال مع العديد من مناطق الدماغ الأخرى2,3. ولكن إلى جانب الاتصال المُتَوَّر والمُرَكَّر، يشير عدد متزايد من الدراسات إلى مزيد من الاختلافات على طول المحور الزمني الحاجز في الحصين. هذه الاختلافات تتعلق العمارة الداخلية والاتصال وكذلك الاختلافات في أنماط التعبير الجيني ومورفولوجيا الخلايا العصبية4،5،6،7،8.
وبالنظر إلى وجود هذه الاختلافات في الدوائر الأساسية، فمن المعقول أن تختار الدائرة الفرعية الخاصة بحصان النهر التي سيتم التحقيق فيها وفقاً للأسئلة التي يتم تناولها. إذا كان على سبيل المثال مسألة تتعلق آليات الخلايا العصبية المشاركة في المعالجة المكانية, دورسال بدلا من الحصين البطني هو من الفائدة, على الرغم من أن اثنين لا تعمل بشكل مستقل في الجسم الحي بسبب اتصال طولي داخل فرس النهر9,10,11. وعلى هذا المنوال، لا يتعين النظر في الاختلافات على طول المحور الطولي فحسب، بل يلزم أيضاً توخي العناية للحفاظ على الدوائر المحلية والبعيدة المدى بقدر الإمكان. للحفاظ على مسارات الألياف والاتصال الزاوية التي سيتم تقسيم الدماغ أمر ضروري.
الطريقة الأولى التي ذكرت في الأدب لتشمل الدائرة trysinaptic أولا عزل الحصين من الدماغ ثم جعل شرائح عرضية (عمودي على المحاور الطولية) باستخدام المروحية الأنسجة12 وهزاز13. في وقت لاحق فضلت علم وظائف الأعضاء للحصول على شرائح من كتلة الدماغ بأكمله للحفاظ أيضا على هياكل الدماغ المجاورة المتصلة قرن آمون. لهذه الاستعدادات كتلة، وقد وضعت زوايا اقسام مختلفة فيما يتعلق قرن آمون، مثل إعداد شريحة الإكلال14 أو إعداد شريحة أفقية اسمه شريحة HEC للحفاظ على اتصالات قشرة فرس النهر entorhinal15،16،17.
في إعداد الأخير يتم قطع الفص الجداري بزاوية 0 درجة أو 12 درجة فيما يتعلق بالطائرة الأفقية على طول محور rostro-caudal لتشكيل قاعدة الكتلة. ثم يتم جمع شرائح بدءا من السطح البطني للدماغ، مما يسمح أساسا الحصاد من منطقة فرس النهر المتوسط البطني. وقد أصبح هذا الأسلوب الخيار الأكثر شعبية للدراسات الفسيولوجية ويمكن القيام به بشكل موثوق بعد عدة بروتوكولات منشورة18,19,20.
ومع ذلك، إذا كانت الاهتمامات البحثية تتعلق بجوانب محددة من التعلم المكاني، قد يكون الحصين الظهري منطقة أكثر ملاءمة للتحقيق وسيكون من المفيد العثور على إجراء تشريح من نوعية مماثلة لهذه المنطقة فرس النهر. وقد تم تطوير بروتوكولات قليلة، والتي تركز على القطب التاجي جدا، التي يمكن أن تلبي هذا الطلب 21،22.
في هذا البروتوكول ، بدلا من ذلك ، ونحن وصف نهج للحصول على شرائح عرضية قابلة للتطبيق من الحصين الظهر المتوسطة التي تستخدم زاوية القسم التي سبق وصفها للتحضيرات الأفقية18،19 ( الشكل1A& B). نحن نبرهن على جودة هذا البروتوكول من خلال مقارنة التسجيلات الكهربائية والفيزيولوجية وإعادة البناء المورفولوجية في هذا الإعداد لتلك التي تم الحصول عليها في شرائح الإكل. هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للدمج مع التجارب التشريحية والسلوكية في الفئران البالغة (عمرها ثلاثة أشهر في حالتنا).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1mL syringes Omnifix-F</td>
			<td>Braun melsungen AG</td>
			<td>9161406V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multiwells</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>8,33,922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>81x criogenic vial storage box</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>15-350-107B</td>
			<td>storage chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Hydrazide dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big scissor</td>
			<td>Fine science tool</td>
			<td>14010-15</td>
			<td>graefe forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>IRIS biotech.</td>
			<td>LS3510.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass capillaries</td>
			<td>Science products</td>
			<td>GB150TF-10</td>
			<td>storage chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush 5</td>
			<td>Leonhardy</td>
			<td>241</td>
			<td>Micro double spatula, L 150 mm, blade width 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel microtome blade</td>
			<td>feather</td>
			<td>C35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloridric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K025.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880</td>
			<td>with Airyscan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>509141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, n-butyl-ester VetBond</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td>fiji.sc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper 113A</td>
			<td>ROTILABO Roth</td>
			<td>AP180.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip tweezer</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0245fo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass becker (150 ml)</td>
			<td>ROTILABO Roth</td>
			<td>X690.1</td>
			<td>incubation chamber and dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dishes (10 cm dia.)</td>
			<td>ROTILABO Roth</td>
			<td>0690.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X997.2</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd</td>
			<td>SUB14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluoran</td>
			<td>baxter</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large spatula</td>
			<td>Roth</td>
			<td>E286.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate heptahydrate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8793.2</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>MF34G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>566380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh kit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0198</td>
			<td>incubation chamber and storage chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldeyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline 10X</td>
			<td>Panbiotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>7,07,62,211</td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic box for syringe filters</td>
			<td>SUPELCO</td>
			<td>54135-U</td>
			<td>storage chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Gluconate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenbecker becker (100 ml)</td>
			<td>ROTILABO Roth</td>
			<td>HT85.1</td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rounded tip tweezers</td>
			<td>Fine science tool</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sainless steel blade</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>Vibratome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissor</td>
			<td>Fine science tool</td>
			<td>14010-10</td>
			<td>mayo scissor straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3149.2</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6885.1</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K021.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasicdihydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K300.1</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8793.2</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjiugated Alexa 488</td>
			<td>Invitogen</td>
			<td>s11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin spatula</td>
			<td>Roth</td>
			<td>E286.1</td>
			<td>Double spatula, L 150 mm, blade width 9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Microm HM650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter device for ultrapure water</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of acute slices from dorsal hippocampus for whole-cell recording and neuronal reconstruction in the dentate gyrus of adult mice

على الرغم من أن العمارة العامة لحصان آمون مماثلة على طول محورها الطولي، فقد كشفت الدراسات الحديثة عن اختلافات بارزة في المعايير الجزيئية والتشريحية والوظيفية التي تشير إلى انقسام إلى دوائر فرعية مختلفة على طول مدىها الوردي- الcaudal. ونظراً لتباين الاتصال والوظيفة، فإن التمييز الأساسي هو التمييز بين الحصين الظهري وحصين البطني، اللذين يشتركان بشكل تفضيلي في المعالجة المكانية والعاطفية، على التوالي. وبناء على ذلك، في العمل الجسم الحي فيما يتعلق تشكيل الذاكرة المكانية قد ركزت على الحصين الظهرية.
وعلى النقيض من ذلك، تم إجراء التسجيلات الكهروفسية في المختبر بشكل تفضيلي على قرن آمون متوسط البطني، مدفوعًا إلى حد كبير بعوامل مثل قابلية الشريحة للحياة وسلامة الدوائر. للسماح للارتباط المباشر من البيانات في الجسم الحي على المعالجة المكانية مع البيانات في المختبر قمنا بتكييف أساليب اقسام سابقة للحصول على شرائح الدماغ العرضية قابلة للحياة للغاية من الحصين الظهري الوسيط للتسجيلات طويلة الأجل للخلايا الرئيسية والدراجات في gyrus دنت. كما يتم تحليل السلوك المكاني بشكل روتيني في الفئران البالغة، قمنا بدمج هذا الإجراء تشريح عرضية مع استخدام حلول وقائية لتعزيز صلاحية أنسجة الدماغ من الحيوانات الناضجة. نحن نستخدم هذا النهج للفئران من حوالي 3 أشهر من العمر. طريقة يوفر بديلا جيدا لإعداد التاجية التي تستخدم في كثير من الأحيان للدراسات في المختبر على الحصين الظهرية. نحن نقارن بين هذين الاستعدادين من حيث جودة التسجيلات والحفاظ على الميزات المورفولوجية للخلايا العصبية المسجلة.

في هذا البروتوكول نحن وصف كيفية إعداد شرائح قرن آمون حادة من الجزء الظهري الوسيط من قرن آمون (الشكل 1A). البروتوكول هو مناسبة خاصة للتجارب التي تحقق في الآليات المشاركة في التعلم المكاني ويمكن الجمع بين العمل السلوكي أو وضع العلامات الفيروسية أو استراتيجيات التلاعب في الحصين الظهرية35. تطبيق إجراء اقسام الموصوف هنا للحيوانات حقن مع العقيد تعتمد GFP التعبير عن الفيروس المرتبطة adeno (AAV-FLEX-GFP) في الحصين الظهري من الفئران Pvalb-IRES-Cre في مختلف إحداثيات AP-1.94 مم، ML ± 0.5-2 مم، عمق 1.25-2.25 ملم لاستهداف مناطق مختلفة من تشكيل فرس النهر36 تمكنا من الحصول على ما لا يقل عن ثلاث شرائح عرضية تحتوي على المناطق المصابة(الشكل 1A تلوين أخضر فاتح على النموذج ثلاثي الأبعاد من قرن آمون). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على شرائح غير مُنْعَدة ولكن صحية من الأجزاء الأكثر روعة من الحصين الظهري (الشكل 1C).
لإثبات جودة وحيوية شرائح لدينا قمنا بتسجيل المعلمات الأساسية الكهربائية الفسيولوجية والمورفولوجية من الخلايا الحبيبية و tdTomato المسمى Parvalbumin-positive (PV +) interneurons في الجيروسكوبات في الزاويات من Pvalb-IRES-Cre؛ Ai9 الفئران المعدلة وراثيا (7-12 أسبوعا من العمر) وقارنت هذه التسجيلات إلى تسجيلات من شرائح الإكليل من نفس المنطقة التي تم الحصول عليها مع بروتوكول قياسي.
عند الفحص البصري تحت المجهر على تباين التداخل التفاضلي تحت الحمراء (IR-DIC)، لاحظنا بالفعل اختلافات واضحة بين شريحة عرضية وشريحة الإكلال. في حين أن الخلايا العصبية من طبقة الخلية الرئيسية في شرائح الإكليل غالبا ما ظهرت الخشنة وعرض الخطوط العريضة المتناقضة بقوة، وأظهرت الخلايا العصبية في شريحة عرضية في الغالب الأسطح الملساء والحدود المتناقضة طفيفة فقط، مما يدل على حيوية الخلوية أفضل(الشكل 2A). قد يكمن سبب هذه الاختلافات في قابلية الخلية للحياة بين الشرائح التاجية وشرائح عرضية في اتجاه الطائرة المقطع فيما يتعلق بمساحات الألياف. وبما أن هذه ليست متوازية في الأجزاء التاجية ، سيتم قطع المحاور والتشعبات. وتمشيا مع هذا الافتراض، وجدنا أن داخل شرائح المستويات السطحية من طبقة الخلية الحبيبية و hilus أظهرت انقطاع أكبر في التاجية من شريحة عرضية (حجم الخطوة في المستويات السطحية: 41.40 ± 3.28 ميكرومتر مقابل 25.60 ± 2.94 ميكرومتر، متوسط ± SEM، غير مسدد t-test P = 0.023)، مما يشير إلى درجة أكبر من انفصال الأنسجة في شريحة الإكليل(الشكل 2B). وهذا يعني أن الخلايا المناسبة للتسجيلات رقعة رقعة سيتم العثور عليها فقط في مستويات أعمق من طبقة الخلايا الحبيبية لشرائح الإكليل، والتي بدورها قد تقلل من إنتاجية التسجيلات التصحيح المشبك. في الواقع، كان متوسط الوقت لختم تشكيل في شريحة عرضية لدينا أكثر سرعة من لشرائح الإكليل (الخلايا الحبيبية: 12.64± 1.50 s، n=11 في الإكليلي مقابل 8.40 ± 0.75 s, n=14 في شرائح عرضية, متوسط ± SEM, P = 0.0335 اختبار مان-ويتني؛ PV+ interneurons: 31.11 ± 2.60 s, n= 9 في الإكلال مقابل 22.00 ± 2.18, n=7 في شرائح عرضية, متوسط ± SEM, P = 0.0283 اختبار مان - ويتني )الشكل 2C). وكيلا لسلامة الخلايا والصحة ثم سجلنا إمكانات غشاء يستريح (RMP) من الخلايا الحبيبية وDydeurons PV + ، والتي كانت أكثر بكثير depolarized في كل من الخلايا الحبيبية وDd interneurons PV + في الإكلال مقابل. شرائح عرضية (خلايا الحبيبية:-62.55 ± 3.54 mV، n = 11 في الإكلالي مقابل-71.06 ± 2.31 mV، n= 14 في شرائح عرضية، متوسط ± SEM، P = 0.0455 اختبار مان-ويتني؛ PV+ interneurons:-52.75 ± 1.66 mV، n= 7 في الإكلالي vs.-59.36 ± 2.25 mV، n =6 في شرائح عرضية متوسط ± SEM،، P = 0.0271 اختبار مان-ويتني )(الشكل 2D). تشير هذه البيانات إلى وجود عدد أكبر من الخلايا العصبية الصحية في إعداد شريحة الإكلينيلية مقابل. في الواقع، أدى إدخال قطع لRMP مقبولة (-55 mV للخلايا الحبيبية؛-45 mV لـ PV + interneurons) في نسبة أعلى من الخلايا المستبعدة في الإكليلية من في شرائح عرضية (39.67 ± 8.37٪، ن = 3 جلسات تجريبية مقابل. 23.00 ± 3.85 ٪، ن = 4 جلسات تجريبية) (الشكل 2E). وعلاوة على ذلك، فإن إعادة بناء مورفولوجيا الخلايا العصبية من الخلايا الحبيبية المسجلة أشارت إلى أنه كما كان من المتوقع أن تكون الفرص أفضل بكثير لاسترداد ال arborization كاملة لخلايا الحبيبية في شريحة عرضية(الشكل 3A،B). وبالإضافة إلى ذلك، فإن إعادة البناء المورفولوجية للضانع الضوئية + في شرائح عرضية سمح تصوير مناطق البور واسعة المحورة والتجريد بما في ذلك التصور من التفاصيل الصغيرة مثل العمود الفقري التشعب35(الشكل 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61980/61980fig01.jpg"> الشكل 1: توضيح لإجراء اقسام للحصول على شرائح من الحصين الظهري الوسيط. (أ) تمثيل ثلاثي الأبعاد لتكوين قرن آمون يظهر اتجاهه المكاني في الدماغ (معدلة من مستكشف الدماغ، معهد ألن)37. 18- يشار إلى الانقسامات الظهرية والوسيطة والبينيترالية في قرن آمون (dHPC, iHPC, vHPC) وفقاً لدونغ وآخرون (2009)7. يشار إلى الجزء من الحصين الظهري الوسيط الذي سيتم شرائح باللون الأخضر الفاتح. يظهر الداخلي على اليمين اتجاه محاور المرجع. (ب) الرسوم المتحركة لنصف الكرة الدماغ يصور محاذاة القشرة الجدارية مع خطوط متوازية على طبق بيتري. يشير الخط الأحمر المنقط إلى مكان إجراء قطع التشذيب (النقطة 3.9 في البروتوكول) لإنشاء السطح لإلتصاق نصف الكرة الأرضية على حامل العينة. تشير الخطوط المنقطة السوداء إلى مكان تجميع الشرائح. (C) مشرق سلسلة صور الميدان من شرائح فرس النهر التي تم الحصول عليها بعد هذا الإجراء. من سطح البسال، الظهر إلى البطن: '1' 0.70 ملم، '2' 1.05 ملم، '3' 1.40 ملم، '4' 1.75 ملم، '5' 2.10 ملم، '6' 2.45 ملم '7' 2.80 ملم، '8' 3.15 ملم. شريط مقياس = 1 مم (D) صورة غرفة التخزين والمواد اللازمة لتجميعها. 1. فيال شبكة المسافة من مربع تخزين قارورة 81x المبردة، 2. علبة بلاستيكية من السيليندريك. 3. شبكة النايلون، 4. تلميح الماصة. الداخلي. عرض الجانبي للشبكة و أنبوب حامل لإدراجها في مربع أسطواني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61980/61980fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61980/61980fig02.jpg"> الشكل 2: تظهر شريحة عرضية تعزيز صلاحية شريحة بالمقارنة مع شريحة الإكليل. (أ) DIC-IR micrographs تظهر صحية (السهام السوداء) وغير صحية (السهام البيضاء) أمثلة من سوماتا الخلايا العصبية في شرائح عرضية والإكليلية. Hil = hilus، gcl = طبقة الخلايا الحبيبية، مل = طبقة الجزيئية. شريط مقياس = 50 ميكرومتر (B) كلا إجراءات القطاعات تنتج خطوة بين سطح طبقة الخلية الحبيبية وهلوس (المشار إليها من قبل رؤوس الأسهم). ارتفاع الخطوة يدل على مدى انقطاع الأنسجة وأقل بكثير في المقاطع العرضية مما كانت عليه في الإكلال (n = 5 عرضية و n = 5 شرائح الإكل، Mean±SEM، P = 0.0238 اختبار مان ويتني). (C) وقت تشكيل الختم giga-ohm في الخلايا الحبيبية (n = 14 خلية في عرضية، ن = 11 خلايا إكلية؛ Mean±SEM، P= 0.0355، اختبار مان-ويتني) و PV+ INs (n= 7 خلايا في عرضية، n= 9 خلايا في شرائح الإكل، متوسط±SEM، P = 0.0283 اختبار مان-ويتني). (D) إمكانية الراحة غشاء (RMP) من الخلايا مصححة (على التوالي، ن = 14 و n = 11 خلايا الحبيبية. متوسط±SEM، P = 0.0455 اختبار مان ويتني. n= 7 PV+ INs و n= 10 PV+ INs، P= 0.0271 اختبار مان ويتني). (E) النسبة المئوية للخلايا المهملة في جلسة تجريبية ، (n = 3 جلسات مع شريحة الإكليل ، n = 4 مع شريحة عرضية ، Mean±SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61980/61980fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61980/61980fig03.jpg"> الشكل 3: الحفاظ على المورفولوجية من الخلايا الحبيبية والدريورونات في شريحة عرضية. صور كونفوكال تظهر خلايا حبيبات مملوءة بالبيوتين في شريحة عرضية(A)وفي شرائح إكلية(B)من Pvalb-IRES-Cre؛ Ai9 الفئران المعدلة وراثيا. وقد أعيد بناء المحاور ذات الصلة باللون الرمادي والرمادي الفاتح. لاحظ الفرق في طول محور عصبي والتعقيد بين التحضيرات. شريط مقياس = 100 μm. (C1) صورة Confocal تظهر tdTomato- تعبئة biocityn-positive interneuron. Hil = hilus، gcl = طبقات الخلايا الحبيبية، مل = طبقة جزيئية. شريط مقياس = 50 ميكرومتر (C2) تكبير المنطقة في C1، تظهر العمود الفقري التشعب. شريط مقياس = 2 ميكرومتر (D) إعادة بناء مورفولوجية من المحاور و dendrites من الدراجات الحيوية شغل في C1 (محور عصبي في الرمادي، سوما و dendrites في الأسود). (E) عن قرب من سوماتا من الخلايا يصور في C1 تظهر الكولوكية من biocytin وParvalbumin المناعي (PVir). شريط مقياس = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61980/61980fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice at JoVE.com

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

نقدم بروتوكولًا لإعداد شرائح حادة من قرن آمون الظهر الوسيط للفئران. نحن نقارن هذا الإعداد عرضية مع تشريح التاجي من حيث جودة التسجيلات والحفاظ على الميزات المورفولوجية للخلايا العصبية المسجلة.

إعداد شرائح حادة من الحصين دورسال لتسجيل الخلية الكاملة وإعادة بناء الخلايا العصبية في Gyrus Dentate من الفئران الكبار

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

الهدف العام لهذا الإجراء هو إعداد شرائح حادة صحية من منطقة متوسطة الظهرية من قرن آمون للتسجيلات طويلة الأجل وإعادة بناء الخلايا العصبية في الفئران الكبار. العديد من المختبرات مثل لنا، ودراسة الحصين الظهري لدورها في التعلم الخاصة والملاحة. التقنيات الشائعة المستخدمة لهذا الغرض هي التجارب السلوكية، والتعقب التشريحي، والتلاعبات الإقليمية المحددة.لقد طورنا طريقة تشريح الدماغ للجمع بين الفيزيولوجيا الكهربائية مع هذه التقنيات للسماح للارتباط المباشر من invivodata داخل تسجيلات الفيديو. وميزة هذا البروتوكول هو أنه يجمع بين إجراء بسيط للحصول على شرائح عرضية مع استخدام محلول حماية لتعزيز صلاحية أنسجة الدماغ. هذا النهج مناسب بشكل خاص عندما يتم استخدام الحيوانات الناضجة كما هو الحال في التجارب السلوكية.لبدء هذا الإجراء، إعداد بجوار بالوعة المعدات اللازمة لهذا القسم. إعداد على الجليد منقار 150 ملليلتر واثنين من الأطباق بيتري الزجاج قطر كل 10 سنتيمترا. رسم ثلاثة أجزاء من خطوط حتى الجزء السفلي من طبق بيتري البلاستيكية ووضع هذا الطبق على مقربة من صينية الجليد.سوف تحتاج أيضا الغراء وحامل العينة لهزومي. ثم تجهيز مقاعد البدلاء عملية جراحية مع مقص كبير، مقص صغير، مدورة تلميح ملاقط، والملاقط تلميح غرامة، ملعقة معدنية رقيقة، ملعقة معدنية كبيرة، والماصات نقل. قشر أطباق بيتري مع حل القطع.طبق واحد لإجراء تشريح الرأس والآخر لتشريح الدماغ. في هذا الأخير، أيضا وضع قطعة من ورقة مرشح. أيضا ملء beaker مع 30 مللي حل القطع.وسوف تكون هناك حاجة لهذا ل perfusial. ملء علبة هزاز مع الجليد الباردة حل القطع والحفاظ على جميع حل أكسجين مع جهاز carbogen محتدما. إضافة الثلج المسحوق المصنوع من دفعة المجمدة من حل قطع إلى الباردة الطازجة قطع في حل للحفاظ على درجة الحرارة إلى أسفل.انتبه، للحفاظ على الجليد من النصل أثناء تقطيع. يتم تنفيذ جميع الخطوات تقريبا بعد كابيتيشن ضمن الحلول. وهذا يساعد على الحفاظ على الحرمان من الأكسجين الأيضي إلى أدنى حد ممكن.إعداد غرفة حضانة مليئة بمحلول القطع تحت الأكسجين المستمر. ضع الغرفة في حمام مائي مُدفأ قبل ذلك عند درجة حرارة 35 درجة مئوية. إعداد غرفة تخزين شريحة مع العديد من الآبار المستقلة وملء مع حل التخزين.يبقيه تحت الأوكسجين المستمر في درجة حرارة الغرفة. في حالة أنّ النسيج عبّر عن بروتين فلورسنت أو ضوء تنشيط opsonin. فمن المستحسن للحفاظ على الغرفة في الظلام.على سبيل المثال، داخل المربع. بعد أداء الذجّر عبر القلب، ضع رأس الفأر في طبق بيتري مع محلول القطع البارد. افتح الجلد بمقص ناعم لفضح الجمجمة.بدءا من ماغنوم الحصيفة، وقطع على طول خياطة القوس حتى الوصول إلى خياطة الأنف والصفة. كن حذراً لسحب قليلاً حتى مقص لتجنب تلف الدماغ. قم بعمل شقين في قاعدة الجمجمة.استخدام ملاقط تلميح مقربة لسحب ما يصل العظام الجدارية. كن حذراً لإزالة السحايات أيضا. إذا تركت فإنها يمكن أن تلحق الضرر الدماغ أثناء الاستخراج.استخدم الملعقة الصغيرة لتخفيف الدماغ بلطف من قاعدة الجمجمة. مع ملعقة صغيرة، افصل الدماغ عن الأعصاب القحفية ونقل الدماغ على قطعة صغيرة من ورق التصفية في طبق بيتري الثاني. قطع الدماغ في النصفين على طول الشق الطولي باستخدام شفرة ما قبل المبردة.فصل نصفي الكرة باستخدام أصغر ملعقة. استخدام أكبر ملعقة لنقل نصف الكرة الأرضية واحد إلى طبق بيتري البلاستيك مع سطحها الوسيطة التي تواجه أسفل. محاذاة القشرة الجدارية مع واحد من الخطوط المتوازية أن يكون مرجعا لقطع الثاني.استخدام قطعة من ورقة مرشح لتجفيف حل الزائدة. ضع النصل بالتوازي مع الخطوط وقطع الجزء البطني من نصف الكرة الأرضية. سيتم لصق هذا السطح المُسطح لاحقًا على حامل العينة.العودة نصف الكرة الأرضية في حل القطن المؤكسج من طبق بيتري الزجاج وتنفيذ نفس الإجراء في نصف الكرة الثاني. ضع قطرة من الغراء سيانوكريلات على حامل العينة هزاز ونشرها مع ملعقة لخلق طبقة رقيقة. نقل نصف الكرة إلى حامل هزاز مع الجانب البطني إلى أسفل باستخدام الجانب مدورة من ملعقة.بدء هذا التقطيع من القشرة الجدارية من شأنه أن يقلل من الوقت اللازم لجمع المنطقة الظهرية من قرن آمون. إضافة بضع قطرات من حل قطع الباردة لترسيخ الغراء. حرك حامل العينة في صينية الاهتزاز ومع الإعدادات المناسبة، شريحة الدماغ حتى منطقة الحصين الظهري مرئية.ثم، وجمع شرائح مع استخدام ماصة نقل البلاستيك. نقل كل شريحة في غرفة الحضانة والسماح لها بقية لمدة 12 دقيقة. في هذه الأثناء، المضي قدما في قطع الشرائح التالية.بعد 12 دقيقة من الحضانة، قم بنقل الشرائح إلى غرفة التخزين. واتركه يرتاح حتى بداية التجربة لإثبات نقاء إعدادنا، قارنا ذلك بإعداد إكليالي والذي يستخدم عادة للتسجيل من الحصين الظهري.هو مبين هنا، التداخل التفاضلي التباين ميكروجراف المكتسبة من شفرة العلوي من gyrus دنت في شرائح حادة من الفئران عمرها شهرين. في شريحة عرضية أظهرت الخلايا العصبية في الغالب الأسطح الملساء والحدود المتناقضة المرجحة فقط، التي تشير إليها الأسهم السوداء. الخلايا العصبية في شرائح كورونال ولكن في كثير من الأحيان ظهرت بالطبع وعرض الخطوط العريضة المتناقضة بقوة، المشار إليها من قبل السهام البيضاء.وهذا يشير إلى تحسين صلاحية الخلايا العصبية في شريحة عرضية. وفقا لهذا الانطباع، كان متوسط الوقت لختم تشكيل أثناء التصحيح في شرائح عرضية لدينا بشكل ملحوظ أكثر سرعة مما كانت عليه في شرائح الإكليلية. باعتبارها وكيلا عاما لسلامة الخلية، ونحن نسجل أن غشاء بقية إمكانات الخلايا الحبيبية وparvalbumin الخلايا العصبية بين إيجابية التي حيث أكثر بكثير من إزالة القطب في كلا النوعين الخلية في شرائح الإكليلي مقابل عرضية.الذي أدى في النهاية في خلايا أكثر بكثير التي كان لا بد من استبعادها في إعداد التاجية. كما المحاور خلية الحبيبية تشغيل في الطائرة عرضية، وإعادة بناء الخلايا المسجلة أدى إلى استرجاع ال arborization محور عصبي كاملة في إعدادنا. لم يكن هذا هو الحال في شرائح الإكلال حيث قد تكون المحاور قد قطعت بسهولة.بالإضافة إلى ذلك ، سمح إعادة البناء المورفولوجية للخلايا العصبية البينية الإيجابية البارفالبوين في الشرائح العرضية بتصوير ال arborization واسعة النطاق وتشعب ، بما في ذلك تصور تفاصيل صغيرة ، مثل العمود الفقري التشعبي. على كل شيء، وقد قدمنا طرق تشريح للحصول على شرائح قرن آمون عرضية مع جدوى الخلايا العصبية العالية للفئران الكبار. يمكن استخدام هذه الطريقة لقياس الفيزياء الكهربائية في المختبر مع الدراسات التشريحية والسلوكية مع التركيز على الجزء الظهري الوسيط من قرن آمون.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

إعداد شرائح الحصين الحادة من الجرذان والفئران المعدلة وراثيا لدراسة التعديلات متشابك وامراض الشيخوخة خلال اميلويد

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

إعداد شرائح الحاد المنطقة Subventricular للتصوير الكالسيوم

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

تقييم شجيري تشجر في التلفيف المسنن من منطقة الحصين في الفئران

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

تسجيل اللدونة متشابك في شرائح هيبوكامبال الحاد تحتفظ في صغيرة الحجم-إعادة التدوير، ونضح-، وغمر من نوع نظام الدائرة

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

تسجيل مكانياً مقيد التذبذبات في قرن آمون التصرف الفئران

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

إعداد شرائح الحبل الشوكي الحاد لتسجيل كامل الخلية التصحيح-المشبك في الخلايا العصبية جيلاتينوسا الدماغ

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...