Name: preparation of acute slices from dorsal hippocampus for whole-cell recording and neuronal reconstruction in the dentate gyrus of adult mice
Uploaded: 2021-04-03T13:00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice at JoVE.com

Мы благодарим Керстин Кроненбиттер и Дидье Гремель за техническую помощь. Мы благодарим Умберто Морелли за помощь в графическом программном обеспечении и Матиаса Хоппе за видеосъемку и редактирование видео. Работа в нашей лаборатории была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FOR2143, SFB 1461 (Проект-ID 434434223) и GRK2154, Совет медицинских исследований грант G1100546/2 и Кил университета.

<ol>
	<li>Amaral, D. G., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+organization+of+the+hippocampal+formation:+a+review+of+anatomical+data.">The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data.</a> Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).</li><li>Fanselow, M. S., Dong, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+the+dorsal+and+ventral+hippocampus+functionally+distinct+structures.">Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures.</a> Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).</li><li>David, A., Pierre, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+Neuroanatomy.">Hippocampal Neuroanatomy.</a> The Hippocampus Book. , 37-114 (2006).</li><li>Dong, H. W., Swanson, L. W., Chen, L., Fanselow, M. S., Toga, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic-anatomic+evidence+for+distinct+functional+domains+in+hippocampal+field+CA1.">Genomic-anatomic evidence for distinct functional domains in hippocampal field CA1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (28), 11794-11799 (2009).</li><li>Royer, S., Sirota, A., Patel, J., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+representations+and+theta+dynamics+in+dorsal+and+ventral+hippocampus.">Distinct representations and theta dynamics in dorsal and ventral hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 30 (5), 1777-1787 (2010).</li><li>Lisman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viewpoints:+how+the+hippocampus+contributes+to+memory,+navigation+and+cognition.">Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition.</a> Nature Neuroscience. 20 (11), 1434-1447 (2017).</li><li>Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiny+and+Non-spiny+Parvalbumin-Positive+Hippocampal+Interneurons+Show+Different+Plastic+Properties.">Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties.</a> Cell Rep. 27 (13), 3725-3732 (2019).</li><li>Cembrowski, M. S., Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+within+classical+cell+types+is+the+rule:+lessons+from+hippocampal+pyramidal+neurons.">Heterogeneity within classical cell types is the rule: lessons from hippocampal pyramidal neurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20 (4), 193-204 (2019).</li><li>Moser, M. B., Moser, E. I., Forrest, E., Andersen, P., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+learning+with+a+minislab+in+the+dorsal+hippocampus.">Spatial learning with a minislab in the dorsal hippocampus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9697-9701 (1995).</li><li>Pothuizen, H. H., Zhang, W. N., Jongen-Relo, A. L., Feldon, J., Yee, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+function+between+the+dorsal+and+the+ventral+hippocampus+in+spatial+learning+abilities+of+the+rat:+a+within-subject,+within-task+comparison+of+reference+and+working+spatial+memory.">Dissociation of function between the dorsal and the ventral hippocampus in spatial learning abilities of the rat: a within-subject, within-task comparison of reference and working spatial memory.</a> European Journal of Neuroscience. 19 (3), 705-712 (2004).</li><li>Fredes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventro-dorsal+Hippocampal+Pathway+Gates+Novelty-Induced+Contextual+Memory+Formation.">Ventro-dorsal Hippocampal Pathway Gates Novelty-Induced Contextual Memory Formation.</a> Current Biology. 31 (1), 25-38 (2021).</li><li>Schwartzkroin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+CA1+neurons+recorded+intracellularly+in+the+hippocampal+in+vitro+slice+preparation.">Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation.</a> Brain Research. 85 (3), 423-436 (1975).</li><li>Andersen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+facilitation+of+synaptic+transmission.">Long-lasting facilitation of synaptic transmission.</a> Ciba Foundation Symposium. (58), 87-108 (1977).</li><li>Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+properties+of+dentate+gyrus+granule+cells:+comparison+of+sharp+microelectrode+and+whole-cell+recordings.">Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings.</a> Journal of Neurophysiology. 67 (5), 1346-1358 (1992).</li><li>Walther, H., Lambert, J. D., Jones, R. S., Heinemann, U., Hamon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptiform+activity+in+combined+slices+of+the+hippocampus,+subiculum+and+entorhinal+cortex+during+perfusion+with+low+magnesium+medium.">Epileptiform activity in combined slices of the hippocampus, subiculum and entorhinal cortex during perfusion with low magnesium medium.</a> Neurosci Lett. 69 (2), 156-161 (1986).</li><li>Rafiq, A., DeLorenzo, R. J., Coulter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+propagation+of+epileptiform+discharges+in+a+combined+entorhinal+cortex/hippocampal+slice.">Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex/hippocampal slice.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (5), 1962-1974 (1993).</li><li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+(P25-30)+rats.">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li><li>Davie, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+patch-clamp+recording.">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).</li><li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices.">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1 (4), 2075-2081 (2006).</li><li>Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+Synaptic+Plasticity+in+Acute+Hippocampal+Slices+Maintained+in+a+Small-volume+Recycling-,+Perfusion-,+and+Submersion-type+Chamber+System.">Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e55936 (2018).</li><li>Dougherty, K. A., Islam, T., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+excitability+of+CA1+pyramidal+neurones+from+the+rat+dorsal+and+ventral+hippocampus.">Intrinsic excitability of CA1 pyramidal neurones from the rat dorsal and ventral hippocampus.</a> Journal of Physiology. 590 (22), 5707-5722 (2012).</li><li>Tidball, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ability+of+the+dorsal+and+ventral+rat+hippocampus+to+exhibit+group+I+metabotropic+glutamate+receptor-dependent+synaptic+and+intrinsic+plasticity.">Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity.</a> Brain and Neuroscience Advances. 1 (1), (2017).</li><li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).</li><li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system.">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Archives. 414 (5), 600-612 (1989).</li><li>Djurisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+Hypoxia+in+Hippocampal+Slices+from+Adult+and+Aging+Mice.">Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61377 (2020).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals:+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics.">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols, 2nd Edition. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).</li><li>Booker, S. A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+patch-clamp+recordings+from+morphologically-+and+neurochemically-identified+hippocampal+interneurons.">Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51706 (2014).</li><li>Norenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+nonuniform+cable+properties+optimize+rapid+and+efficient+activation+of+fast-spiking+GABAergic+interneurons.">Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 894-899 (2010).</li><li>Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+Biocytin-filled+and+Processed+Sections+for+Neurochemical+Markers.">Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54880 (2016).</li><li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage.">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1977-1986 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Murray, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory.">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 297-299 (2011).</li><li>Otis, T. S., Staley, K. J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perpetual+inhibitory+activity+in+mammalian+brain+slices+generated+by+spontaneous+GABA+release.">Perpetual inhibitory activity in mammalian brain slices generated by spontaneous GABA release.</a> Brain Research. 545 (1-2), 142-150 (1991).</li><li>Varela, C., Llano, D. A., Theyel, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+in+vitro+slice+approaches+for+the+study+of+neuronal+circuitry.">An introduction to in vitro slice approaches for the study of neuronal circuitry.</a> Neuromethods. 67, 103-125 (2012).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Спинной гиппокамп был широко изучен за его роль в пространственном обучении и навигации в основном с помощью поведенческих экспериментов, анатомических трассировки и специфических для региона манипуляций. Чтобы объединить срез-электро-физиологические запросы с этими методами, мы собрали протокол, который использует аналогичный угол секционирования, как модифицированная горизонтальная нарезка для промежуточной вентальной области гиппокампа, но использует перевернутый порядок нарезки для получения ранних ломтиков из спинной промежуточной области. Такой подход сокращает время, необходимое для нарезки и сбора спинной области гиппокампа, тем самым повышая жизнеспособность ломтиков.
Используя этот метод, мы можем регулярно получать около трех ломтиков в полушарии спинного гиппокампа области между 1,4 мм-2,4 мм от поверхности пиала, как показано на рисунке 1C. Хотя это не возможно с помощью этой процедуры, чтобы получить поперечные ломтики от самого полюса перегородки гиппокампа, можно собрать около двух дополнительных жизнеспособных не поперечных ломтиков в полушарии от полюса перегородки (Рисунок 1C ii,iii). Если септальный полюс гиппокампа является основным направлением исследований, другие протоколы, которые позволяют сбор поперечных ломтиков, особенно с самого полюса перегородки гиппокампа, может быть лучше подходит21,32. Поведенческие эксперименты по пространственной навигации и обучению предпочтительно проводятся у зрелых мышей с полностью развитой нейрональной связью. Следовательно, мы оптимизировали нашу процедуру нарезки для применения к мозгу взрослых животных (показано здесь в течение трех месяцев мышей), которые более чувствительны к стрессу, чем устойчивый препарат для несовершеннолетних. С этой целью мы объединили несколько стратегий, которые уменьшают гипоксический стресс мозга подвергается в период между извлечением и размещением ломтиков в кислородом ACSF. Защитное решение резки является NMDG основе ACSF25,27,28 с низким Наз и Ca2 ", но высокий Mg2", чтобы уменьшить возбудимые повреждения и отек клеток из-за активации NMDA рецепторов. Кроме того, HEPES обеспечивает стабильную буферизации и соединений, таких как аскорбат и пируват уменьшить окислительный стресс. Транскардиальная перфузия с охлажденным и оксигенированным защитным режущей раствором использует чрезвычайно плотную капиллярную сеть, снабжающая мозг быстро и однородно снижает метаболический спрос и глутамат-индуцированную возбудимость в тканях мозга. Впоследствии почти все шаги после обезглавливания выполняются в охлажденных и оксигенированных растворов, чтобы сохранить метаболизм и лишение кислорода до минимума в течение всей процедуры. Другие стратегии для уменьшения повреждения мозга во время нарезки существуют и могут быть одинаково действительны38. Чтобы продемонстрировать качество нашего препарата, мы сравниваем его с препаратом коронального ломтика, который обычно используется для записи из спинного гиппокампа. Несмотря на то, что корональные ломтики могут быть использованы для получения хорошей записи патч-зажима в зубной извилины, количество нездоровых и отключенных нейронов выше, чем в поперечном срезе. Кроме того, целостность аксональных и дендритных беседок лучше сохраняется в поперечном срезе. На самом деле целостность гранулы клеточных аксонов(рисунок 3A), которые работают ортогонал к продольной оси гиппокампа служит индикатором поперечной нарезки плоскости1.
Для заполнения исправленных нейронов, мы предлагаем сопротивление электрода между 3 и 5 МЗ. Диаметр кончика около 1 мкм, позволяет выполнение хорошего сопротивления уплотнения во время записи и хорошее повторное уплотнение на электрод опровержение. Наиболее важной деталью является, чтобы избежать всасывания частей сомы или ядра в пипетку. По этой причине мы предлагаем включить краситель Alexa во внутриклеточный раствор, когда это возможно. Краситель позволяет контролировать форму клетки во время записи и повторного уплотнения. Кроме того, это позволяет оценить целостность исправленной клетки после фиксации, что может сэкономить время иммуногистохимии, в случаях неудачных пломбы. Из-за Alexa красители утоляются с длинным временем фиксации, мы предлагаем короткую фиксацию, если это возможно.
Для последующего иммуностимтирования мы используем протокол, который не требует повторного сечения ломтика. Мы предлагаем сделать окрашивание в течение одной недели после фиксации. Чем дольше ломтики остаются в холодильнике, тем выше вероятность деградации тканей. Если длительного хранения не избежать, мы предлагаем увеличить концентрацию NaN3 в PBS до 0,05% и обновлять ее еженедельно. Иммуностепенирование всего ломтика означает, что инкубационые времена с первичными и вторичными антителами увеличиваются. Как правило, для выявления биоцитина достаточно одной ночной инкубации при 4 градусов по Цельсию, но если в сочетании с окрашиванием других белков, вся процедура окрашивания может длиться гораздо дольше. Перемеабилизация блокировки и анти-тела инкубации должны быть оптимизированы индивидуально. Как правило, для первичного антитела, два дня достаточно, а один день может быть достаточно для вторичного. Мы рекомендуем увеличить продолжительность мытья шагов вместе с более длительными инкубациями антител, чтобы избежать увеличения фона.
В этом протоколе мы представили метод нарезки для получения поперечных или почти поперечных ломтиков гиппокампа сохранения нейронной жизнеспособности взрослой ткани и практический подход к восстановлению морфологии и нейрохимической идентичности исправленных нейронов. Этот метод может быть легко выполнен в матче электро-физиологических результатов с анатомическими и поведенческими исследованиями упором на промежуточно-спинной части гиппокампа.

Гиппокамп был широко изучен за его ключевую роль в различных аспектах обучения и памяти, пространственной навигации, а также эмоции. Основной схемой гиппокампа, обычно называемой «трисинаптической цепью», является ламеллярная сеть в поперечной оси, которая в значительной степени сохраняется вдольпродольной оси 1. Вклад гиппокампа в различные когнитивные и эмоциональные поведения, вероятно, возникает из различных связей, что эта основная схема делает вдоль спинной оси с несколькими другимиобластями мозга 2,3. Помимо афферентных и эфферентных подключения, однако, все большее число исследований указывают на дальнейшие различия вдоль септо-временной оси гиппокампа. Такие различия касаются внутренней архитектуры и подключения, а также различий в моделях экспрессии генови нейрональной морфологии 4,5,6,7,8.
Учитывая наличие таких различий в основных схемах, разумно выбрать конкретные гиппокампа подзарядки, которые будут исследованы в соответствии с вопросами, которые рассматриваются. Если, например, вопрос касается нейронных механизмов, участвующих в пространственной обработке, спинной, а не брюшнойгиппокамппредставляет интерес, хотя два не действуют независимо in vivo из-за внутригиппокампа продольной связи9,10,11. В этом направлении необходимо учитывать не только различия вдоль продольной оси, но и заботиться о сохранении как можно более локальных и дальних схем. Для сохранения волоконных путей и подключения угол, под которым мозг будет секционные имеет важное значение.
Первый метод сообщил в литературе, чтобы включить trysinaptic цепи сначала изолированы гиппокампа из мозга, а затем сделал поперечные ломтики (перпендикулярно продольных осей) с помощьюткани измельчитель 12 и вибром13. Позже физиологи предпочитали получать ломтики от всего блока мозга, чтобы сохранить также соседние структуры мозга, связанные с гиппокампом. Для этих блоков подготовки, различные углы сечения в отношении гиппокампа были разработаны, такие как короналсрез подготовки 14 или горизонтальной подготовки ломтик называется HEC ломтик для сохранения гиппокампа-энторинальной корысоединения 15,16,17.
В последней подготовке теменной доли разрезают с углом 0 "или 12" по отношению к горизонтальной плоскости вдоль розтро-каудальной оси, чтобы сформировать основание блока. Фрагменты затем собираются, начиная с брюшной поверхности мозга, что позволяет в основном урожай промежуточного брюшного гиппокампа области. Этот метод стал самым популярным выбором для физиологических исследований и может быть надежно выполнен после несколькихопубликованных протоколов 18,19,20.
Однако, если интерес исследования касается конкретных аспектов пространственного обучения, спинной гиппокамп может быть более подходящим регионом исследования, и было бы полезно найти нарезки процедуры аналогичного качества для этого гиппокампа области. Немногие протоколы, которые сосредоточены на самом ростральном полюсе, были разработаны, которые могут удовлетворить этот спрос 21,22.
В этом протоколе, вместо этого, мы описываем подход к получению жизнеспособных поперечных ломтиков от спинно-промежуточного гиппокампа, который использует угол сечения, ранееописанный для горизонтальныхпрепаратов 18 ,19 ( Рисунок 1Aи B). Мы демонстрируем качество этого протокола, сравнивая электрофизиологические записи и морфологические реконструкции в этом препарате с теми, которые получены в корональных ломтиках. Этот протокол особенно подходит для сочетания с анатомическими и поведенческими экспериментами у взрослых мышей (три месяца в нашем случае).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1mL syringes Omnifix-F</td>
			<td>Braun melsungen AG</td>
			<td>9161406V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multiwells</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>8,33,922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>81x criogenic vial storage box</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>15-350-107B</td>
			<td>storage chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Hydrazide dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big scissor</td>
			<td>Fine science tool</td>
			<td>14010-15</td>
			<td>graefe forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocytin</td>
			<td>IRIS biotech.</td>
			<td>LS3510.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass capillaries</td>
			<td>Science products</td>
			<td>GB150TF-10</td>
			<td>storage chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush 5</td>
			<td>Leonhardy</td>
			<td>241</td>
			<td>Micro double spatula, L 150 mm, blade width 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel microtome blade</td>
			<td>feather</td>
			<td>C35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloridric acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K025.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880</td>
			<td>with Airyscan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>509141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, n-butyl-ester VetBond</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3054.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td>fiji.sc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper 113A</td>
			<td>ROTILABO Roth</td>
			<td>AP180.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip tweezer</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0245fo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass becker (150 ml)</td>
			<td>ROTILABO Roth</td>
			<td>X690.1</td>
			<td>incubation chamber and dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dishes (10 cm dia.)</td>
			<td>ROTILABO Roth</td>
			<td>0690.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X997.2</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated water bath</td>
			<td>Grant Instruments Ltd</td>
			<td>SUB14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9105.4</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluoran</td>
			<td>baxter</td>
			<td>5239.2</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large spatula</td>
			<td>Roth</td>
			<td>E286.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate heptahydrate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8793.2</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>MF34G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-GTP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-methyl-D-glucamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>566380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh kit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0198</td>
			<td>incubation chamber and storage chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldeyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline 10X</td>
			<td>Panbiotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter instrument</td>
			<td>P-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>7,07,62,211</td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic box for syringe filters</td>
			<td>SUPELCO</td>
			<td>54135-U</td>
			<td>storage chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Gluconate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenbecker becker (100 ml)</td>
			<td>ROTILABO Roth</td>
			<td>HT85.1</td>
			<td>incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rounded tip tweezers</td>
			<td>Fine science tool</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sainless steel blade</td>
			<td>Gillette</td>
			<td>Vibratome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissor</td>
			<td>Fine science tool</td>
			<td>14010-10</td>
			<td>mayo scissor straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Ascorbate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3149.2</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6885.1</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K021.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasicdihydrat</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K300.1</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8793.2</td>
			<td>aCSF&#160; solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin conjiugated Alexa 488</td>
			<td>Invitogen</td>
			<td>s11223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin spatula</td>
			<td>Roth</td>
			<td>E286.1</td>
			<td>Double spatula, L 150 mm, blade width 9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>861171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Microm HM650V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter device for ultrapure water</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>Milli-Q IQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of acute slices from dorsal hippocampus for whole-cell recording and neuronal reconstruction in the dentate gyrus of adult mice

Хотя общая архитектура гиппокампа схожа по продольной оси, недавние исследования выявили значительные различия в молекулярных, анатомических и функциональных критериях, предполагающих разделение на различные подзамыки вдоль его ростро-каудальной степени. Благодаря дифференциальной связи и функции проводится самое фундаментальное различие между спинным и желудочковый гиппокамп, которые преимущественно участвуют в пространственной и эмоциональной обработке, соответственно. Соответственно, работа in vivo относительно формирования пространственной памяти была сосредоточена на спинной гиппокампе.
В отличие от этого, электрофизионые записи in vitro были преимущественно выполнены на промежуточно-вентальный гиппокамп, в значительной степени мотивированы такими факторами, как жизнеспособность ломтика и целостность цепи. Для того, чтобы обеспечить прямую корреляцию данных in vivo о пространственной обработке данными in vitro, мы адаптировали предыдущие методы сечения для получения высоко жизнеспособных поперечных срезов мозга из спинно-промежуточного гиппокампа для длительных записей основных клеток и интернейронов в извилины дентата. Поскольку пространственное поведение регулярно анализируется у взрослых мышей, мы объединили эту поперечную процедуру нарезки с использованием защитных решений для повышения жизнеспособности тканей мозга у зрелых животных. Мы используем этот подход для мышей около 3 месяцев. Метод предлагает хорошую альтернативу корональному препарату, который часто используется для исследований in vitro на спинной гиппокампе. Мы сравниваем эти два препарата с точки зрения качества записей и сохранения морфологических особенностей записанных нейронов.

В этом протоколе мы описываем, как подготовить острые ломтики гиппокампа из спинной-промежуточной части гиппокампа(рисунок 1A). Протокол особенно подходит для экспериментов, которые исследуют механизмы, участвующие в пространственном обучении и могут быть объединены с поведенческой работы или вирусной маркировки или манипуляции стратегии в спиннойгиппокамп 35. Применяя описанную здесь процедуру секции к животным, введенным с cre-зависимым GFP, выражают адено-ассоциированный вирус (AAV-FLEX-GFP) в спинной гиппокамп мышей Pvalb-IRES-Cre в различных координатах Bregma AP-1.94 мм, ML ± 0,5-2 мм, глубина-1,25-2,25 мм для целевой различных областяхгиппокампа формирования 36 мы смогли получить по крайней мере три поперечных ломтиков, содержащих зараженных регионов(рисунок 1A светло-зеленая окраска на 3D-модели гиппокампа). Кроме того, несколько не поперечных, но здоровых ломтиков могут быть получены из более ростральных частей спинного гиппокампа(рисунок 1C).
Чтобы продемонстрировать качество и жизнеспособность наших ломтиков, мы зафиксировали основные электрофизиологические и морфологические параметры гранулированных клеток и интернейроны с маркировкой tdTomato Parvalbumin-positive (PV) в дентатной извилине Pvalb-IRES-Cre; Ай9 трансгенных мышей (7-12 недель) и сравнил их с записями из корональных ломтиков той же области, полученных со стандартным протоколом.
При визуальном осмотре под инфракрасным дифференциально-интерференционным контрастом (IR-DIC) микроскопом мы уже заметили явные различия между поперечной и корональной ломтиками. В то время как нейроны основного слоя клеток в корональных ломтиках часто казались грубыми и отображали сильно контрастные очертания, нейроны в поперечном срезе в основном показывали гладкие поверхности и только слегка контрастные границы, что свидетельствует о лучшей клеточнойжизнеспособности (рисунок 2A). Причина этих различий в жизнеспособности клеток между корональными и поперечными ломтиками может лежать в ориентации секционной плоскости по отношению к волокнам. Поскольку они не параллельны в корональных секциях, аксоны и дендриты будут разорваны. В соответствии с этим предположением, мы обнаружили, что в пределах ломтиков поверхностные плоскости слоя гранулы клеток и hilus показали большую разрывность в короне, чем поперечный срез (размер шага в поверхностных плоскостях: 41,40 ± 3,28 мкм против 25,60 ± 2,94 мкм, Среднее ± SEM, Неспаренные t-test P 0.023), предлагая большую степень отключения ткани в корональной срезе(рисунок 2B). Это означает, что подходящие клетки для записи патч-зажима будут найдены только в более глубоких плоскостях слоя гранулы клеток для корональных ломтиков, что, в свою очередь, может уменьшить пропускную способность записей патч-зажима. Действительно, среднее время для уплотнения образования в нашем поперечном ломтике было более быстрым, чем для корональных ломтиков (гранулевых клеток: 12,64± 1,50 с, n-11 в корональных против 8,40 ± 0,75 с, n-14 в поперечных ломтиках, Средний ± SEM, ПЗ 0,0335 Манн-Уитни тест; Интернейроны ПВЗ: 31,11 ± 2,60 с, n-9 в корональных против 22,00 ± 2,18, n-7 в поперечных ломтиках, средний ± SEM, ПЗ 0,0283 Манн-Уитни тест) (Рисунок 2C). В качестве прокси для целостности клеток и здоровья мы затем записали потенциалы покоя мембраны (RMP) гранул клеток и ПВЗ интернейронов, которые были значительно более деполяризованы как в грануле клеток и ПВЗ интернейроны в коронал против. поперечные ломтики (гранулевые клетки:-62.55 ± 3.54 mV, n'11 в корональных против-71.06 ± 2.31 mV, n'14 в поперечных ломтиках, Средний ± SEM, P'0.0455 Mann-Whitney test; Интернейроны ПВЗ:-52.75 ± 1,66 мВ, n-7 в корональных против-59,36 ± 2,25 мВ, n-6 в поперечных срезах Средний ± SEM,, ПЗ 0,0271 Манн-Уитни тест) (Рисунок 2D). Эти данные свидетельствуют о большем количестве здоровых нейронов в поперечном против коронального среза подготовки. Действительно, введение отрезка для приемлемого RMP (-55 мВ для гранульных клеток;-45 мВ для интернейронов ПВЗ) привело к более высокому проценту исключенных клеток в коронале, чем в поперечных срезах (39,67 ± 8,37%, n'3 экспериментальных сессий против. 23.00 ± 3.85%, n'4 экспериментальных сессий) (Рисунок 2E). Кроме того, реконструкция нейрональной морфологии из записанных гранул клеток показали, что, как и ожидалось, шансы были гораздо лучше, чтобы получить полную аксональной беседки для гранул клеток в поперечном срезе(рисунок 3A,B). Кроме того, морфологическая реконструкция интернейронов ПВЗ в поперечных срезах позволила изобразить обширные аксональные и дендритные беседки, включая визуализацию мелких деталей, таких как дендритные шипы35(рисунок 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61980/61980fig01.jpg"> Рисунок 1: Иллюстрация процедуры секционирования для получения ломтиков спинно-промежуточного гиппокампа.(A)Трехмерное представление образования гиппокампа, показывающее его пространственную ориентацию в головном мозге (изменено из Brain Explorer, Институт Аллена)37. Дорсальные, промежуточные и брюшной отделы гиппокампа (dHPC, iHPC, vHPC) указаны, в соответствии с Dong et al. (2009)7. Часть спинного-промежуточного гиппокампа, которая будет нарезана, показана светло-зеленым цветом. Вставка справа показывает ориентацию эталонных осей. (B)Мультфильм полушария мозга, изображающий выравнивание теменной коры с параллельными линиями на чашке Петри. Красная пунктирная линия указывает, где выполнить обрезку разреза (точка 3.9 в протоколе), чтобы создать поверхность для склеивания полушария на держатель образца. Черные пунктирные линии указывают, где собираются ломтики. (C) Яркие поля изображения серии гиппокампа ломтики, полученные после этой процедуры. От поверхности пиала, спинной до брюшной: i) 0,70 мм, (ii) 1,05 мм, (iii) 1,40 мм, (iv) 1,75 мм, (v) 2,10 мм, (vi) 2,45 мм (vii) 2,80 мм, (viii) 3,15 мм. Масштабная планка 1 мм.(D)Фото камеры хранения и материала, необходимого для его сборки. 1. Vial spacer сетки из 81x криогенных флакон хранения коробки, 2. Цилиндрическая пластиковая коробка. 3. Нейлоновая сетка, 4. Пипетт чаевые. вкладка. Боковой вид сетки и трубки-держателя для вставки в цилиндрическую коробку. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61980/61980fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61980/61980fig02.jpg"> Рисунок 2: Поперечный срез показывает повышенную жизнеспособность ломтика по сравнению с ломтиком коронала. (A) микрографы DIC-IR, показывающие здоровые (черные стрелки) и нездоровые (белые стрелки) примеры нейрональной сомата в поперечных и корональных ломтиках. Хилехилус, слой клеток гклю гранул, молекулярный слой мл. Шкала бар No 50 мкм. (B) Обе процедуры секционирования производят шаг между поверхностью слоя гранулы ячейки и хилус (указывается стрелками головки). Высота шага свидетельствует о степени отключения тканей и значительно ниже в поперечных секциях, чем в корональных (n'5 поперечных и n'5 корональных ломтиков, средний±SEM, P±0.0238 Манн-Уитни тест). (C)Время формирования гига-ом уплотнения в гранулированных клетках (n-14 клеток в поперечных, n'11 клеток коронала; Средние±SEM, ПЗ 0,0355, Манн-Уитни тест) и ПВЗ INs (n'7 клеток в поперечных, n'9 клеток в корональных ломтиков, средний±SEM, P 0,0283 Манн-Уитни тест) ломтиками. (D) Потенциал мембраны отдыха (RMP) клеток, исправленных (соответственно, n' 14 и n'11 гранул. Средний±SEM, тест Пз 0,0455 Манн-Уитни. N-7 PV- INs и n'10 PV- INs, тест 0,0271 Манн-Уитни). (E)Процент отбрасываемых клеток в рамках экспериментальной сессии, (n'3 сеансов с корональным ломтиком, n-4 с поперечным ломтиком, средний±SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61980/61980fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61980/61980fig03.jpg"> Рисунок 3: Морфологическое сохранение гранулных клеток и интернейронов в поперечном срезе. Конфокальные изображения, показывающие биоцитин заполненные гранулы клеток в поперечномсрезе( A ) и в корональныхломтиков( B ) из Pvalb-IRES-Cre; Ай9 трансгенных мышей. Соответствующие аксоны были реконструированы серым и светло-серым цветом. Обратите внимание на разницу в длине аксона и сложности между препаратами. Масштабная бар-100 мкм. (C1) Конфокальные изображения, показывающие биоситинов заполненные tdTomato-положительный интернейрон. Хилехилус, слои клеток гклю гранулы, молекулярный слой млз. Масштабная планка 50 мкм. (C2) Увеличение коробчатой области в C1, показывающее дендритные шипы. Масштабная бар-2 мкм(D)Морфологическая реконструкция аксонов и дендритов биоцитина, наполненного интернейроном в С1 (аксон серого цвета, сома и дендриты в черном). (E) Крупным планом сомата клеток, изображенных в C1 показаны колокализации биоцитина и парвалбумина-иммунореактивности (PVir). Масштабная планка 20 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61980/61980fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice at JoVE.com

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Представляем протокол по подготовке острых ломтиков спинного и промежуточного гиппокампа мышей. Мы сравниваем этот поперечный препарат с корональной нарезкой с точки зрения качества записей и сохранения морфологических особенностей записанных нейронов.

Подготовка острых ломтиков из спинного гиппокампа для записи целых клеток и нейрональной реконструкции в Дентате Извилина взрослых мышей

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in ...

Общей целью этой процедуры является подготовка здоровых острых ломтиков спинной промежуточной области гиппокампа для длительных записей и реконструкции нейронов у взрослых мышей. Многие лаборатории, как наша, изучение спинного гиппокампа за его роль в специальном обучении и навигации. Общие методы, используемые для этой цели являются поведенческие эксперименты, анатомические трассировки, и региональные конкретные манипуляции.Мы разработали метод нарезки мозга, чтобы объединить электрофизиологию с этой техникой, чтобы обеспечить прямую корреляцию invivodata в видеозаписях. Преимущество этого протокола заключается в том, что он сочетает в себе простую процедуру получения поперечных срезов с использованием защитного раствора для повышения жизнеспособности тканей мозга. Этот подход особенно подходит, когда зрелые животные используются как в поведенческих экспериментах.Чтобы начать эту процедуру, подготовь рядом с раковиной необходимое оборудование для этого раздела. Приготовьте на льду стакан 150 миллилитров и две стеклянные чашки Петри диаметром 10 сантиметров каждая. Нарисуйте три части линий до нижней части пластиковой чашки Петри и распоите эту тарелку близко к ледяному подносу.Вам также понадобится клей и держатель образца для вибромы. Затем оснастить хирургическое скамейку большими ножницами, маленькими ножницами, закругленным кончиком пинцета, тонкой кончиком пинцета, тонким металлическим шпателем, большим металлическим шпателем и переносным пипеткой. Очистите блюда Петри с режущей раствором.Одно блюдо для выполнения вскрытия головы, а другое для вскрытия мозга. В последнем также поместите лист фильтровальной бумаги. Также заполните стакан с 30 миллилитров резки раствора.Это будет необходимо для перфузии транскардиального. Заполните вибром лоток с ледяной резки раствора и сохранить все решения кислородом с карбогеном восходящей устройства. Добавьте измельченный лед из замороженной партии режущей раствора в холодный свежий раствор для резки, чтобы снизить температуру.Обратите внимание, чтобы держать лед от лезвия во время нарезки. Почти все шаги после на душу населения выполняются в рамках решений. Это помогает сать метаболизм кислорода лишения до минимума.Подготовь инкубационный зал, наполненный режущей раствором при постоянной оксигенации. Поместите камеру в предварительно разогретую водяную баню при 35 градусах Цельсия. Подготовьте камеру хранения ломтика с несколькими независимыми скважинами и заполните ее раствором для хранения.Держите его под постоянной оксигенацией при комнатной температуре. В случае, если ткань выражает флуоресцентный белок или легкий активированный опсонин. Рекомендуется держать камеру в темноте.Например, внутри коробки. После выполнения перфузии транскардиального, поместите голову мыши в чашку Петри с ледяным раствором резки. Откройте кожу мелкими ножницами, чтобы разоблачить череп.Начиная с foramen magnum, вырезать вдоль sagittal шва до достижения насофронтальный шов. Будьте осторожны, чтобы слегка подтянуть ножницы, чтобы избежать повреждения мозга. Сделайте два бокового разреза в основание черепа.Используйте закругленный кончик пинцета, чтобы подтянуть теменные кости. Будьте осторожны, чтобы также удалить околивания. Если оставить они могут повредить мозг во время извлечения.Используйте небольшой шпатель, чтобы мягко ослабить мозг от основания черепа. С помощью небольшого шпателя отсоедините мозг от черепных нервов и перенесите мозг на небольшой кусочек фильтровальной бумаги во второй чашке Петри. Разрежьте мозг пополам вдоль продольной трещины с помощью предварительно охлажденного лезвия.Разделите два полушария, используя самый маленький шпатель. Используйте самый большой шпатель, чтобы перенести одно полушарие в пластиковую чашку Петри с ее медиальной поверхностью лицом вниз. Выровнять теменной коры с одной из параллельных линий, чтобы иметь ссылку на второй разрез.Используйте лист фильтровальной бумаги, чтобы высушить избыток раствора. Распорежьте лезвие параллельно линиям и разрежьте вентраловую часть полушария. Эта плоская поверхность будет позже приклеена к держателю образца.Верните полушарие в кислородный хлопчатобумажный раствор стеклянной чашки Петри и выполните ту же процедуру на втором полушарии. Поместите каплю цианоакрилатного клея на держатель образца вибромы и распределите его шпателем, чтобы создать тонкий слой. Перенесите полушарие на держатель вибромы с брюшной стороной вниз, используя округлую сторону шпателя.Начиная эту нарезку из теменной коры сократит время, необходимое для сбора спинной области гиппокампа. Добавьте несколько капель холодного раствора для затвердения клея. Переместите держатель образца в поднос с вибромой и при соответствующих настройках нарежьте мозг до тех пор, пока не будет видна область спинного гиппокампа.Затем соберите ломтики с помощью пластиковой трубы передачи. Перенесите каждый кусочек в инкубационую камеру и дайте ему отдохнуть в течение 12 минут. В то же время, приступить к сокращению следующих ломтиков.После 12 минут инкубации перенесите ломтики в камеру хранения. И дайте ему отдохнуть до начала эксперимента. Чтобы продемонстрировать чистоту нашего препарата, мы сравниваем его с корональным препаратом, который обычно используется для записи из спинного гиппокампа.Здесь показаны дифференциальные интерференционные контрастные микрографы, приобретенные из верхнего лезвия зубной извилины острыми ломтиками у двухмесячных мышей. В поперечном срезе нейроны в основном показывали гладкие поверхности и только вероятные контрастные границы, обозначенные черными стрелками. Нейроны в coronal ломтиками однако часто появлялись курс и показали сильно контрастные очертания, указанные белыми стрелками.Это говорит о лучшей жизнеспособности нейронов в поперечном срезе. В соответствии с этим впечатлением, среднее время, чтобы запечатать образование во время исправления в наших поперечных ломтиков было значительно быстрее, чем в корональных ломтиков. Как общий прокси для целостности клеток, мы записываем, что упокоения мембранных потенциалов гранул клеток и парвалбумин положительные интер нейроны, которые, где значительно больше деполяризировать в обоих типах клеток в корональных по сравнению с поперечных ломтиков.Что в конечном итоге привело к значительно больше клеток, которые должны были быть исключены в корональной подготовки. По мере того как аксоны гранулы клетки бегут в поперечной плоскости, реконструкция записанных клеток привела к извлечению вполне axonal arborization в нашей подготовке. Это было не так в корональных ломтиков, где аксоны, возможно, легко были разорваны.Кроме того, морфологическая реконструкция парвалбумина положительные межвальные нейроны в поперечных ломтиков позволило изображение обширной аксональной и дендритической беседки, в том числе визуализации мелких деталей, таких как дендритные шипы. В целом, мы представили методы нарезки для получения поперечных ломтиков гиппокампа с высокой нейрональной жизнеспособности для взрослых мышей. Этот метод может быть использован для измерения электрофизиологических исследований in vitro с анатомических и поведенческих исследований упором на промежуточной спинной части гиппокампа.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Подготовка острого срезах гиппокампа крыс и трансгенных мышей для изучения Synaptic Изменения в процессе старения и амилоида патологии

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Всего Запись сотовый от органотипической Подготовка Кусочек Неокортекс

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Покадровый Визуализация нейробластов миграции в остром ломтики мозга взрослых мышей

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Подготовка Острый субвентрикулярной фрагменты зона для кальция изображений

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Парные Целые Записи Сотовые в Органотипической срезов гиппокампа

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Оценка ветвления дендритов в зубчатой ​​извилине гиппокампа области у мышей

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Запись синаптической пластичности в острой гиппокампа ломтики в малообъемной рециркуляции-, перфузии и погружения типа камерная система

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

Запись пространственно ограниченный колебания в гиппокампе поведение мышей

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Подготовка острого спинного фрагменты записи поклеточного патч зажим в Substantia Gelatinosa нейронов

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...