Name: a 3-d tail explant culture to study vertebrate segmentation in zebrafish
Uploaded: 2021-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish at JoVE.com

Vi takker AECOM Zebrafish Core Facility og Cincinnati Children's Veterinary Services for fiskevedligeholdelse, Cincinnati Children's Imaging Core for teknisk bistand, Didar Saparov for hjælp til videoproduktion og Hannah Seawall for at redigere manuskriptet. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under Award Number R35GM140805 til E.M.Ö. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de nationale sundhedsinstitutters officielle synspunkter.

Denne protokol indebærer brug af levende hvirveldyr embryoner yngre end 1 dag efter befrugtning. Alle dyreforsøg blev udført under de etiske retningslinjer fra Cincinnati Children's Hospital Medical Center; dyreprotokoller blev gennemgået og godkendt af Den Institutionelle Komité for Pasning og Anvendelse af Dyr (protokol nr. 2017-0048).
1. Indsamling af embryoner
<ol><li>Sæt par zebrafisk op i krydsende tanke natten før embryosamlingsdagen. For præcis iscenesættelse kontrol af embr...

<ol>
	<li>Assheton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Growth in length: Embryological Essays. , (1916).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition. , (1995).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (1700003), (2017).</li><li>Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+fold+change+of+Fgf+signaling+encodes+positional+information+for+segmental+determination+in+zebrafish.">Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish.</a> Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).</li><li>Dubrulle, J., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fgf8+mRNA+decay+establishes+a+gradient+that+couples+axial+elongation+to+patterning+in+the+vertebrate+embryo.">fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo.</a> Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).</li><li>Diez del Corral, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+FGF+and+Retinoid+Pathways+Control+Ventral+Neural+Pattern,+Neuronal+Differentiation,+and+Segmentation+during+Body+Axis+Extension.">Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension.</a> Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).</li><li>Stern, H. M., Hauschka, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tube+and+notochord+promote+in+vitro+myogenesis+in+single+somite+explants.">Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants.</a> Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).</li><li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).</li><li>Picker, A., Roellig, D., Pourqui&#233;, O., Oates, A. C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+micromanipulation+in+zebrafish+embryos.">Tissue micromanipulation in zebrafish embryos.</a> Methods in molecular biology. 546 (11), 153-172 (2009).</li><li>Manning, A. J., Kimelman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx16+and+Msgn1+are+required+to+establish+directional+cell+migration+of+zebrafish+mesodermal+progenitors.">Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors.</a> Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139, 3242-3247 (2012).</li></ol>

Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol over en vævskultur explant teknik, vi udviklede og brugte for nylig5 til zebrafisk embryoner. Vores teknik bygger på de tidligere explant metoder i chick8 og zebrafish9,10,11 model organismer. Hale explants udarbejdet med denne protokol kan overleve, så længe > 12 timer i en simpel dias kammer, fortsætter med at forlænge sin s...

Metamerisk segmentering af organismer er meget udbredt i naturen. Gentagne strukturer er afgørende for funktionaliteten af laterale organer som hvirvler, muskler, nerver, fartøjer, lemmer eller blade i en kropsplan1. Som et resultat af sådanne fysiologiske og geometriske begrænsninger af den aksiale symmetri udviser de fleste karinaer af Bilateria- såsom annelider, leddyr og akkordater-udstilling segmentering af deres embryonale væv (f.eks. ectoderm, mesoderm) antero-posteriorly.
Hvirveldyr embryoner sekventielt segment deres paraxial mesoderm langs de store organ akse i somites med artsspecifikke intervaller, tæller, og størrelse distributioner. På trods af en sådan robusthed blandt individuelle embryoner inden for en art er somitsegmentering alsidig mellem hvirveldyrarter. Segmentering sker i et stort regime af tidsintervaller (fra 25 min i zebrafisk til 5 timer hos mennesker), størrelser (fra ~ 20 μm i hale somites af zebrafisk til ~ 200 μm i trunk somites af mus) og tæller (fra 32 i zebrafisk til ~ 300 i majsslanger)2. Mere interessant er det, at fiskefostre kan udvikle sig i en lang række temperaturer (fra ~20,5 °C op til 34 °C for zebrafisk), samtidig med at deres somitter bevares med korrekt størrelsesfordeling ved at kompensere for både segmenteringsintervaller og aksiale forlængelseshastigheder. Ud over sådanne interessante træk forbliver zebrafisk som en nyttig modelorganisme til at studere segmentering i hvirveldyr på grund af den eksterne, synkrone og gennemsigtige udvikling af en mangfoldighed af søskendefostre samt deres tilgængelige genetiske værktøjer. Fra mikroskopisk perspektiv udvikler teleostembryoner sig på en voluminøs sfærisk æggeblomme, der strækker sig og afrunder det gastrulerende væv omkring det(figur 1A). I denne artikel præsenterer vi en flad 3-D vævsudgravningskultur til zebrafiskhaler. Dette strålesystem omgår æggeblommemassens sfæriske begrænsninger, hvilket giver adgang til levende billeddannelse af fiskeembryoner i høj opløsning med henblik på somite-mønstre.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61981/61981fig01.jpg"> Figur 1: Slide Chamber Explant System for Zebrafish Embryos. (A) Zebrafiskembryoner har fordele for levende billeddannelse, såsom gennemsigtigheden af gastrulerende embryonalt væv (blåt), men vævet dannes omkring en voluminøs sfærisk æggeblommemasse (gul), som forhindrer næsten objektiv billeddannelse i høj opløsning i intakte embryoner. Hale explants kan dissekeres begyndende med en mikrokirurgisk kniv (brun) skåret fra vævet foran somites (rød) og fortsætter ved grænsen til æggeblommen posteriorly. (B) Dissekerede hale explants kan placeres på en coverslip (lyseblå) dorsoventrally; holde neuralt væv (lysegrå) på toppen og notochord (mørkegrå) i bunden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61981/61981fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>REF 309597</td>
			<td>for dechorionating embryos and manipulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol, Anhydrous</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>for tissue dissection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous, Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td>for tissue dissection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>MIL4-411</td>
			<td>for preparing tape slide wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td>(optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A3160601</td>
			<td>additional for tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat#A-21145; RRID: AB_2535781</td>
			<td>secondary antibody for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21083-027</td>
			<td>for tissue dissection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade</td>
			<td>Surgical Specialties</td>
			<td>72-2863</td>
			<td>for tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-ppERK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#M8159; RRID:AB_477245</td>
			<td>for ppERK immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37106</td>
			<td>(optional) for live staining of cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>for fixation of samples for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen Coating Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122-20</td>
			<td>(optional) for chemically activating slide chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>tokai-hit-stxg</td>
			<td>(optional) for temperature control during live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Tape 3/4&#39;&#39;</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>S-9782</td>
			<td>for preparing tape slide wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP)</td>
			<td>Campbell et&#160;al., 2015</td>
			<td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4</td>
			<td>transgenic fish with nuclear localized EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)</td>
			<td>Cooper et&#160;al., 2005</td>
			<td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75</td>
			<td>transgenic fish with cell membrane localized EGFP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3-d tail explant culture to study vertebrate segmentation in zebrafish

Hvirveldyr embryoner mønster deres vigtigste krop akse som gentagne somites, forløberne for ryghvirvler, muskler og hud. Somites gradvist segment fra den presomitiske mesoderm (PSM) som enden af embryoet forlænger posteriorly. Somites form med regelmæssig periodicitet og skala i størrelse. Zebrafisk er en populær modelorganisme, da den er genetisk tractable og har gennemsigtige embryoner, der giver mulighed for levende billeddannelse. Ikke desto mindre er fiskefostre viklet rundt om en stor, afrundende æggeblomme under somitogenese. Denne geometri begrænser levende billeddannelse af PSM-væv i zebrafiskembryoner, især ved højere opløsninger, der kræver en tæt objektiv arbejdsafstand. Her præsenterer vi en flad 3D-vævskulturmetode til levende billeddannelse af zebrafiskhale explants. Hale explants efterligne intakte embryoner ved at vise en proportional afmatning af aksen forlængelse og afkortning af rostrocaudal somite længder. Vi er yderligere i stand til at stall akse forlængelse hastighed gennem explant kultur. Dette gør det for første gang muligt for os at udrede den kemiske tilførsel af signalgradienter fra den mekanistiske tilførsel af aksial forlængelse. I fremtidige undersøgelser kan denne metode kombineres med en mikrofluidisk opsætning for at muliggøre tidskontrollerede farmaceutiske miksninger eller screening af segmentering af hvirveldyr uden problemer med lægemiddelindtrængning.

Denne protokol muliggør flad geometrisk dyrkning af levende zebrafisk hale explants. Vævskultur præsenterer tre store fordele i forhold til hele embryoner: 1) kontrol af akse forlængelse hastighed, 2) kontrol over forskellige signalering (morfogen) kilder ved simpel dissektion, og 3) næsten objektiv, høj forstørrelse og høj NA levende billeddannelse.
Kemisk ubehandlede diaskamre gør det muligt for haleekspeditret at forlænge sin hovedakse (Figur 2A) ved ...

Watch this Scientific Journal Video about A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish at JoVE.com

A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

Her præsenterer vi protokollen for 3D-vævskulturen af zebrafiskens bageste kropsakse, der muliggør levende undersøgelse af hvirveldyrsegmentering. Denne explant model giver kontrol over akse forlængelse, ændring af morfogen kilder, og subcellulær opløsning væv-niveau levende billeddannelse.

En 3D Tail Explant Kultur til undersøgelse hvirveldyr Segmentering i zebrafisk

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...

3-D zebrafisk hale explants lad os udnytte gennemsigtigheden af zebrafisk embryoner i fuldt omfang under somite udvikling og hvirveldyr segmentering. Fyld en tom parringstank med fiskesystemvand. Rengør si med systemvand.Hæv barriererne mellem parringspar. Flyt selektivt fiskeparret ind i ferskvandstanken. Saml embryoner i si gennem vandoverførsler med en tom tank.Skyl indsamlede embryoner med fiskesystem vand og flip på en petriskål. Ethanol-glasur dissektion værktøjer. Lav to lag bånd på dias.Skær de vandrette sider af dybe kamre. Komplet kammer nedskæringer med lodrette sider. Skræl tapen af kammeroverfladen.Hæld cellekultur medier i et rør. Bland calciumchlorid 2,8 millimolar endelige koncentration. Tilsæt antibiotisk opløsning.Aliquot dissektion medier i et separat rør. Kompliment føtal kvæg serum at gøre væv kultur medium. Dekorriner embryoner med nåle.Skyl embryonerne i en ferskvandsskål og saml dem til explanting. Stabilisere embryoet med nål og begynde at de-yoking. Trim resterne væv off.Overfør explants til coverslip. Flad vævet og suge overskydende medier ud med pipette. Sæt coverlip på vækst medium, der indeholder dias kammer.Sæt det ydre væv på en vævsservietter. Påfør nedsænkningsolie på målet. Monter slidekammeret på mikroskop.Juster laserkanaler til billedopsamling. Kontroller prøvens z-laggrænser. Opsætning af tidsafbildninger og z-lag.3-D hale explant system holder celle integration til hale opløbet og overskydende forlængelse intakt som hele embryoner. Det er også muligt at stoppe overskydende forlængelse ved kemisk aktivering af overfladen med type 1 kollagen. 3-D zebrafisk hale explants system giver os mulighed for at udnytte gennemsigtigheden af zebrafisk embryoner ved at lade os til at tage høj opløsning og næsten objektiv mikroskopi billeder.Derudover giver det os mulighed for at afkoble overskuddet af forlængelse fra morfogensignalering og også kontrollere morfogensignalkilderne med enkle dissektionsmetoder.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocyt-specifik Ablation i Zebrafisk til Studieinformationen Biliær drevet Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolering og dyrkning af Adult Zebrafisk Brain-afledte Neurosfærer

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Produktion og administration af terapeutiske mesenchymstamceller / Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed i 3-D kulturer Under Xeno-frie betingelser

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Brug af In Vivo og væv og celle eksplantat tilgange til at studere morfogenese og patogenese af embryonale og Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Anvendelse af Aorta-gonade-mesonephros eksplantat kultur System i udviklingsmæssige bloddannelsen

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metode til at studere udviklingen af embryonale kylling væv

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Kultur og Transfektion af zebrafisk primærelementer

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridization i Zebrafish Embryoner og Tube Formation Assay i iPSC-ECs at studere den rolle, Endoglin i vaskulær udvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

En co-kultur metode til at studere Neurite Udvækst som reaktion på Dental Pulp Paracrine Signaler

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Tre- og firedimensionelle visualiserings- og analysemetoder til undersøgelse af hvirveldyrs aksiale forlængelse og segmentering

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...