Name: a 3-d tail explant culture to study vertebrate segmentation in zebrafish
Uploaded: 2021-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish at JoVE.com

Agradecemos ao AECOM Zebrafish Core Facility e ao Serviço Veterinário Infantil de Cincinnati pela manutenção de peixes, ao Núcleo de Imagem Infantil de Cincinnati por assistência técnica, Didar Saparov pela assistência com a produção de vídeo e Hannah Seawall para a edição do manuscrito. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R35GM140805 a E.M.Ö. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Este protocolo envolve o uso de embriões vertebrados vivos com menos de 1 dia de fertilização. Todos os experimentos em animais foram realizados sob as diretrizes éticas do Centro Médico hospitalar infantil de Cincinnati; os protocolos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (Protocolo nº 2017-0048).
1. Coleção de embriões
<ol><li>Coloque pares de zebrafish em tanques de travessia na noite anterior ao dia da coleta de embriões. Pa...

<ol>
	<li>Assheton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Growth in length: Embryological Essays. , (1916).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition. , (1995).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (1700003), (2017).</li><li>Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+fold+change+of+Fgf+signaling+encodes+positional+information+for+segmental+determination+in+zebrafish.">Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish.</a> Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).</li><li>Dubrulle, J., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fgf8+mRNA+decay+establishes+a+gradient+that+couples+axial+elongation+to+patterning+in+the+vertebrate+embryo.">fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo.</a> Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).</li><li>Diez del Corral, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+FGF+and+Retinoid+Pathways+Control+Ventral+Neural+Pattern,+Neuronal+Differentiation,+and+Segmentation+during+Body+Axis+Extension.">Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension.</a> Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).</li><li>Stern, H. M., Hauschka, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tube+and+notochord+promote+in+vitro+myogenesis+in+single+somite+explants.">Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants.</a> Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).</li><li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).</li><li>Picker, A., Roellig, D., Pourqui&#233;, O., Oates, A. C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+micromanipulation+in+zebrafish+embryos.">Tissue micromanipulation in zebrafish embryos.</a> Methods in molecular biology. 546 (11), 153-172 (2009).</li><li>Manning, A. J., Kimelman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx16+and+Msgn1+are+required+to+establish+directional+cell+migration+of+zebrafish+mesodermal+progenitors.">Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors.</a> Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139, 3242-3247 (2012).</li></ol>

Este artigo apresenta um protocolo detalhado de uma técnica de explant de cultura de tecido que desenvolvemos e usamos recentemente5 para embriões de zebrafish. Nossa técnica baseia-se nos métodos anteriores de explantagem emfilhotes 8 e zebrafish9,10,11 organismos modelo. Explantas de cauda preparadas com este protocolo podem sobreviver desde >12 h em uma simples câmara de sl...

A segmentação metamérica de organismos é amplamente utilizada na natureza. Estruturas repetidas são essenciais para a funcionalidade de órgãos laterais como vértebras, músculos, nervos, vasos, membros ou folhas em um plano corporal1. Como resultado de tais restrições fisiológicas e geométricas da simetria axial, a maioria da phyla de Bilateria- como annelids, artrópodes e cordatas-exposição segmentação de seus tecidos embrionários (por exemplo, ectoderme, mesoderme) antero-posteriormente.
Embriões vertebrados segmentam sequencialmente seu mesoderme paraxial ao longo do eixo principal do corpo em somitas com intervalos específicos de espécies, contagens e distribuições de tamanho. Apesar de tal robustez entre embriões individuais dentro de uma espécie, a segmentação de somite é versátil entre espécies de vertebrados. A segmentação acontece em um vasto regime de intervalos de tempo (de 25 minutos em zebrafish a 5 h em humanos), tamanhos (de ~20 μm em somitas de cauda de zebrafish a ~200 μm em somitas tronco de camundongos) e conta (de 32 em zebrafish a ~300 em cobras de milho)2. O mais interessante é que os embriões de peixe podem desenvolver-se em uma ampla gama de temperaturas (de ~20,5 °C até 34 °C para zebrafish) mantendo seus somitas intactos com distribuições de tamanho adequado, compensando tanto os intervalos de segmentação quanto as velocidades de alongamento axial. Além dessas características interessantes, o zebrafish permanece como um organismo modelo útil para estudar a segmentação em vertebrados devido ao desenvolvimento externo, síncrono e transparente de uma plenitude de embriões irmãos, bem como suas ferramentas genéticas acessíveis. Adversamente a partir de uma perspectiva de microscopia, os embriões teleost desenvolvem-se em uma gema esférica volumosa, esticando e arredondando o tecido gastrulating ao seu redor(Figura 1A). Neste artigo, apresentamos uma cultura de explante de tecido 3D achatada para caudas de zebrafish. Este sistema de explant contorna as restrições esféricas da massa de gema, permitindo o acesso a imagens vivas de alta resolução de embriões de peixes para padronização de somite.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61981/61981fig01.jpg"> Figura 1: Sistema de Explantação de Câmara de Slides para Embriões de Zebrafish. (A) Os embriões de zebrafish têm vantagens para imagens vivas, como a transparência do tecido embrionário gastrulating (azul), mas o tecido se forma em torno de uma massa de gema esférica volumosa (amarela) que previne imagens quase objetivas e de alta resolução em embriões intactos. Explantas de cauda podem ser dissecadas começando com uma faca microcirúrgica (marrom) cortada do tecido anterior de somites (vermelho) e continuando na borda com a gema posteriormente. (B) Explantas traseiras dissecadas podem ser colocadas em um deslizamento (azul claro) dorsoventrally; mantendo tecido neural (cinza claro) em cima e notochord (cinza escuro) na parte inferior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61981/61981fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>REF 309597</td>
			<td>for dechorionating embryos and manipulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol, Anhydrous</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>for tissue dissection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous, Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td>for tissue dissection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>MIL4-411</td>
			<td>for preparing tape slide wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td>(optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A3160601</td>
			<td>additional for tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat#A-21145; RRID: AB_2535781</td>
			<td>secondary antibody for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21083-027</td>
			<td>for tissue dissection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade</td>
			<td>Surgical Specialties</td>
			<td>72-2863</td>
			<td>for tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-ppERK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#M8159; RRID:AB_477245</td>
			<td>for ppERK immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37106</td>
			<td>(optional) for live staining of cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>for fixation of samples for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen Coating Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122-20</td>
			<td>(optional) for chemically activating slide chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>tokai-hit-stxg</td>
			<td>(optional) for temperature control during live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Tape 3/4&#39;&#39;</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>S-9782</td>
			<td>for preparing tape slide wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP)</td>
			<td>Campbell et&#160;al., 2015</td>
			<td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4</td>
			<td>transgenic fish with nuclear localized EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)</td>
			<td>Cooper et&#160;al., 2005</td>
			<td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75</td>
			<td>transgenic fish with cell membrane localized EGFP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3-d tail explant culture to study vertebrate segmentation in zebrafish

Embriões vertebrados padronizam seu eixo corporal principal como somites repetitivos, os precursores de vértebras, músculos e pele. As somitas se segmentam progressivamente do mesoderme presomótico (PSM) à medida que a extremidade traseira do embrião alonga posteriormente. As somitas formam-se com periodicidade regular e escala em tamanho. O zebrafish é um organismo modelo popular, pois é geneticamente tratável e possui embriões transparentes que permitem imagens vivas. No entanto, durante a somitogênese, os embriões de peixe são enrolados em torno de uma grande gema arredondada. Esta geometria limita a imagem viva do tecido PSM em embriões de zebrafish, particularmente em resoluções mais altas que requerem uma distância de trabalho objetiva próxima. Aqui, apresentamos um método de cultura de tecido 3D achatado para imagens vivas de explants de cauda de zebrafish. Explantas de cauda imitam embriões intactos exibindo uma desaceleração proporcional do alongamento do eixo e encurtamento dos comprimentos de somite rostrocaudal. Ainda podemos parar a velocidade de alongamento do eixo através da cultura explant. Isso, pela primeira vez, nos permite desembaraçar a entrada química de gradientes de sinalização da entrada mecanicista do alongamento axial. Em estudos futuros, este método pode ser combinado com uma configuração microfluida para permitir perturbações farmacêuticas controladas pelo tempo ou triagem da segmentação de vertebrados sem qualquer preocupação com a penetração de medicamentos.

Este protocolo permite a colheita geométrica plana de explantes de cauda de zebrafish vivos. A cultura tecidual apresenta três grandes vantagens sobre embriões inteiros: 1) controle da velocidade de alongamento do eixo, 2) controle sobre várias fontes de sinalização (morfógeno) por dissecção simples, e 3) quase objetivo, alta ampliação e alta imagem viva na NA.
Câmaras de slides quimicamente não tratadas permitem que a explanta da cauda alongue seu eixo principal (<strong class="x...

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A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

Aqui, apresentamos o protocolo para a cultura tecidual 3D do eixo corporal posterior do zebrafish, possibilitando o estudo ao vivo da segmentação de vertebrados. Este modelo de explant fornece controle sobre o alongamento do eixo, alteração de fontes de morfógeno e imagem viva de nível de tecido de resolução subcelular.

Uma cultura de explanta de cauda 3D para estudar segmentação de vertebrados em zebrafish

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...

Explantas de cauda de zebrafish 3D vamos explorar a transparência dos embriões de zebrafish em toda a sua extensão durante o desenvolvimento de somite e segmentação de vertebrados. Encha um tanque de acasalamento vazio com água do sistema de peixes. Limpe o filtro com água do sistema.Levante as barreiras entre pares de acasalamento. Mova seletivamente o par de peixes para o reservatório de água doce. Colete embriões no coador através de transferências de água com um tanque vazio.Enxágüe os embriões coletados com água do sistema de peixes e vire em uma placa de Petri. Ferramentas de dissecção de esmalte de etanol. Faça duas camadas de fitas em slides.Corte os lados horizontais de câmaras profundas. Cortes completos da câmara com lados verticais. Tire a fita da superfície da câmara.Despeje a mídia da cultura celular em um tubo. Misture cloreto de cálcio 2,8 mililitros de concentração final. Adicione solução antibiótica.Mídia de dissecção de aliquot em um tubo separado. Elogie o soro bovino fetal para tornar a cultura tecidual meio. Embriões desarmados com agulhas.Enxágüe os embriões em um prato de água doce e colete-os para explanagem. Estabilize o embrião com agulha e comece a desobrilá-lo. Corte os tecidos que sobraram.Transfira as explantes para o deslizamento de cobertura. Achate o tecido e suge o excesso de mídia com pipeta. Coloque a mancha de cobertura no meio de crescimento contendo câmara de slides.Coloque o tecido da explanta em uma limpeza de tecido. Aplique óleo de imersão ao objetivo. Monte a câmara de slides no microscópio.Ajuste os canais laser para aquisição de imagens. Verifique os limites da camada z da amostra. Configuração de imagens de tempo e camadas z.O sistema de explant 3D mantém a integração celular ao broto da cauda e o excesso de alongamento intactos como embriões inteiros. Também é possível parar o excesso de alongamento ativando quimicamente a superfície com colágeno tipo um. O sistema de explanações de cauda de zebrafish 3D nos permite explorar a transparência dos embriões de zebrafish, permitindo-nos tirar imagens de microscopia de alta resolução e quase objetivas.Além disso, permite-nos desacoplar o excesso de alongamento da sinalização de morfógeno e também controlar as fontes de sinalização de morfógeno com métodos simples de dissecção.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Produção e Administração de Therapeutic-tronco mesenquimais / celular estromal (MSC) Spheroids condicionadas em culturas 3-D Sob Condições Xeno-livres

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Aplicação do sistema de cultura Aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

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Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

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Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

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Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Abordagens de visualização e análise tridimensional para estudar alongamento axial de vertebrados e segmentação

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