Name: a 3-d tail explant culture to study vertebrate segmentation in zebrafish
Uploaded: 2021-06-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish at JoVE.com

Agradecemos a la AECOM Zebrafish Core Facility y Cincinnati Children's Veterinary Services por el mantenimiento de peces, al Cincinnati Children's Imaging Core por la asistencia técnica, a Didar Saparov por la asistencia con la producción de video y a Hannah Seawall por editar el manuscrito. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Número de Premio R35GM140805 a E.M.Ö. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Este protocolo implica el uso de embriones de vertebrados vivos menores de 1 día después de la fertilización. Todos los experimentos con animales se realizaron bajo las pautas éticas del Cincinnati Children's Hospital Medical Center; los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Protocolo # 2017-0048).
1. Recolección de embriones
<ol><li>Configure pares de peces cebra en tanques de cruce la noche antes del día de reco...

<ol>
	<li>Assheton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Growth in length: Embryological Essays. , (1916).</li><li>Gomez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+segment+number+in+vertebrate+embryos.">Control of segment number in vertebrate embryos.</a> Nature. 454 (7202), 335-339 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 3rd edition. , (1995).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (1700003), (2017).</li><li>Simsek, M. F., Ozbudak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+fold+change+of+Fgf+signaling+encodes+positional+information+for+segmental+determination+in+zebrafish.">Spatial fold change of Fgf signaling encodes positional information for segmental determination in zebrafish.</a> Cell Reports. 24 (1), 66-78 (2018).</li><li>Dubrulle, J., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fgf8+mRNA+decay+establishes+a+gradient+that+couples+axial+elongation+to+patterning+in+the+vertebrate+embryo.">fgf8 mRNA decay establishes a gradient that couples axial elongation to patterning in the vertebrate embryo.</a> Nature. 427 (6973), 419-422 (2004).</li><li>Diez del Corral, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+FGF+and+Retinoid+Pathways+Control+Ventral+Neural+Pattern,+Neuronal+Differentiation,+and+Segmentation+during+Body+Axis+Extension.">Opposing FGF and Retinoid Pathways Control Ventral Neural Pattern, Neuronal Differentiation, and Segmentation during Body Axis Extension.</a> Neuron. 40 (1), 65-79 (2003).</li><li>Stern, H. M., Hauschka, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tube+and+notochord+promote+in+vitro+myogenesis+in+single+somite+explants.">Neural tube and notochord promote in vitro myogenesis in single somite explants.</a> Developmental Biology. 167 (1), 87-103 (1995).</li><li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 464-474 (2003).</li><li>Picker, A., Roellig, D., Pourqui&#233;, O., Oates, A. C., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+micromanipulation+in+zebrafish+embryos.">Tissue micromanipulation in zebrafish embryos.</a> Methods in molecular biology. 546 (11), 153-172 (2009).</li><li>Manning, A. J., Kimelman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx16+and+Msgn1+are+required+to+establish+directional+cell+migration+of+zebrafish+mesodermal+progenitors.">Tbx16 and Msgn1 are required to establish directional cell migration of zebrafish mesodermal progenitors.</a> Developmental Biology. 406 (2), 172-185 (2015).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139, 3242-3247 (2012).</li></ol>

Este artículo presenta un protocolo detallado de una técnica del explant de la cultura del tejido que desarrollamos y utilizamos recientemente5 para los embriones del pez cebra. Nuestra técnica se basa en los métodos de explantación anteriores en el polluelo8 y el pez cebra9,10,11 organismos modelo. Los explantes de cola preparados con este protocolo pueden sobrevivir hasta >1...

La segmentación metamérica de organismos es ampliamente utilizada en la naturaleza. Las estructuras repetidas son esenciales para la funcionalidad de órganos laterales como vértebras, músculos, nervios, vasos, extremidades u hojas en un plan corporal1. Como resultado de tales restricciones fisiológicas y geométricas de la simetría axial, la mayoría de los filos de Bilateria-tales como anélidos, artrópodos, y cordados-exhiben la segmentación de sus tejidos embrionarios (e.g., ectodermo, mesodermo) antero-posteriorly.
Los embriones de vertebrados segmentan secuencialmente su mesodermo paraxial a lo largo del eje principal del cuerpo en somitas con intervalos específicos de la especie, recuentos y distribuciones de tamaño. A pesar de tal robustez entre embriones individuales dentro de una especie, la segmentación de somita es versátil entre las especies de vertebrados. La segmentación ocurre en un vasto régimen de intervalos de tiempo (de 25 min en el pez cebra a 5 h en humanos), tamaños (de ~20 μm en somitas de cola de pez cebra a ~200 μm en somites de tronco de ratones) y recuentos (de 32 en pez cebra a ~300 en serpientes de maíz)2. Más interesante aún, los embriones de peces pueden desarrollarse en un amplio rango de temperaturas (desde ~ 20.5 ° C hasta 34 ° C para el pez cebra) mientras mantienen sus somitas intactas con distribuciones de tamaño adecuadas al compensar tanto los intervalos de segmentación como las velocidades de elongación axial. Más allá de estas interesantes características, el pez cebra se mantiene como un organismo modelo útil para estudiar la segmentación en vertebrados debido al desarrollo externo, síncrono y transparente de una plenitud de embriones hermanos, así como sus herramientas genéticas accesibles. Negativamente desde una perspectiva de microscopía, los embriones de teleósteo se desarrollan en una yema esférica voluminosa, estirando y redondeando el tejido gastrulante a su alrededor (Figura 1A). En este artículo, presentamos un cultivo de explantes de tejido 3-D aplanado para colas de pez cebra. Este sistema de explantes evita las restricciones esféricas de la masa de yema, lo que permite el acceso a imágenes vivas de alta resolución de embriones de peces para el modelado de somita.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61981/61981fig01.jpg"> Figura 1:Sistema de explante de cámara deslizante para embriones de pez cebra. (A) Los embriones de pez cebra tienen ventajas para la obtención de imágenes vivas, como la transparencia del tejido embrionario gastrulado (azul), pero el tejido se forma alrededor de una masa de yema esférica voluminosa (amarillo) que impide obtener imágenes casi objetivas y de alta resolución en embriones intactos. Los explantes de cola se pueden diseccionar comenzando con un cuchillo microquirúrgico (marrón) cortado del tejido anterior de somitas (rojo) y continuando en el borde con la yema posterior. (B) Los explantes de cola disecados pueden colocarse en un cubrebocas (azul claro) dorsoventralmente; mantener el tejido neural (gris claro) en la parte superior y la notocorda (gris oscuro) en la parte inferior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61981/61981fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Sub-Q Syringe with PrecisionGlide Needle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>REF 309597</td>
			<td>for dechorionating embryos and manipulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 Proof Ethanol, Anhydrous</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>for tissue dissection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous, Powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td>for tissue dissection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel, #10 Stainless Steel</td>
			<td>Integra-Miltex</td>
			<td>MIL4-411</td>
			<td>for preparing tape slide wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td>(optional) for anesthesizing tissues older than 20 somites stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A3160601</td>
			<td>additional for tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG2b, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat#A-21145; RRID: AB_2535781</td>
			<td>secondary antibody for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 Medium with L-Glutamine w/o Phenol Red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21083-027</td>
			<td>for tissue dissection media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical Corneal Knife 2.85 mm Angled Tip Double Bevel Blade</td>
			<td>Surgical Specialties</td>
			<td>72-2863</td>
			<td>for tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-ppERK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#M8159; RRID:AB_477245</td>
			<td>for ppERK immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucRed Live 647 ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37106</td>
			<td>(optional) for live staining of cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>for fixation of samples for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Tail Collagen Coating Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>122-20</td>
			<td>(optional) for chemically activating slide chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>tokai-hit-stxg</td>
			<td>(optional) for temperature control during live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Tape 3/4&#39;&#39;</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>S-9782</td>
			<td>for preparing tape slide wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish: Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP)</td>
			<td>Campbell et&#160;al., 2015</td>
			<td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4</td>
			<td>transgenic fish with nuclear localized EGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)</td>
			<td>Cooper et&#160;al., 2005</td>
			<td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75</td>
			<td>transgenic fish with cell membrane localized EGFP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3-d tail explant culture to study vertebrate segmentation in zebrafish

Los embriones de vertebrados modelan su eje corporal principal como somitas repetitivas, los precursores de las vértebras, los músculos y la piel. Las somitas se segmentan progresivamente desde el mesodermo presomático (PSM) a medida que el extremo de la cola del embrión se alarga posteriormente. Los somitas se forman con periodicidad regular y escala en tamaño. El pez cebra es un organismo modelo popular, ya que es genéticamente manejable y tiene embriones transparentes que permiten obtener imágenes vivas. Sin embargo, durante la somitogénesis, los embriones de peces se envuelven alrededor de una yema grande y redondeada. Esta geometría limita las imágenes vivas de tejido PSM en embriones de pez cebra, particularmente a resoluciones más altas que requieren una distancia de trabajo objetiva cercana. Aquí, presentamos un método aplanado de la cultura del tejido de 3-D para la proyección de imagen viva de los explantes de la cola del pez cebra. Los explantes de cola imitan los embriones intactos mostrando una desaceleración proporcional de la elongación del eje y el acortamiento de las longitudes de somita rostrocaudal. Además, somos capaces de detener la velocidad de elongación del eje a través del cultivo de explantes. Esto, por primera vez, nos permite desenredar la entrada química de los gradientes de señalización de la entrada mecanicista de la elongación axial. En estudios futuros, este método se puede combinar con una configuración microfluídica para permitir perturbaciones farmacéuticas controladas por el tiempo o la detección de la segmentación de vertebrados sin ningún problema de penetración de fármacos.

Este protocolo permite el cultivo geométrico plano de explantes de cola de pez cebra vivos. El cultivo de tejidos presenta tres ventajas principales sobre embriones enteros: 1) control de la velocidad de elongación del eje, 2) control sobre varias fuentes de señalización (morfógeno) por disección simple, y 3) cerca de objetivos, alta ampliación y altas imágenes en vivo de NA.
Las cámaras deslizantes no tratadas químicamente permiten que el explante de la cola alargue su eje principal...

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A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

Aquí, presentamos el protocolo para el cultivo de tejidos 3-D del eje posterior del cuerpo del pez cebra, lo que permite el estudio en vivo de la segmentación de vertebrados. Este modelo de explant proporciona control sobre el alargamiento del eje, alteración de las fuentes de morfógenos y obtención de imágenes vivas a nivel de tejido de resolución subcelular.

Un cultivo de explantes de cola 3-D para estudiar la segmentación de vertebrados en el pez cebra

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...

3-D explantes de cola de pez cebra nos permiten explotar la transparencia de los embriones de pez cebra en toda su extensión durante el desarrollo de somita y la segmentación de vertebrados. Llene un tanque de apareamiento vacío con agua del sistema de peces. Limpie el colador con agua del sistema.Levante las barreras entre las parejas de apareamiento. Mueva selectivamente el par de peces en el tanque de agua dulce. Recoger embriones en el colador a través de transferencias de agua con un tanque vacío.Enjuague los embriones recogidos con agua del sistema de peces y voltee una placa de Petri. Herramientas de disección etanol-esmalte. Haga dos capas de cintas en diapositivas.Corte los lados horizontales de las cámaras profundas. Cortes de cámara completos con lados verticales. Retire la cinta de la superficie de la cámara.Vierta medios de cultivo celular en un tubo. Mezclar cloruro de calcio 2,8 milimolares de concentración final. Añadir solución antibiótica.Medios de disección alícuota en un tubo separado. Complemente el suero bovino fetal para hacer el medio de cultivo de tejidos. Des-corrinato de embriones con agujas.Enjuague los embriones en un plato de agua dulce y colótelos para explantarlos. Estabilizar el embrión con aguja y empezar a des-yugo. Recorte los tejidos sobrantes.Transfiera los explantes al cubrebocas. Aplanar el tejido y chupar el exceso de medios con pipeta. Coloque el cubrebocas en el medio de crecimiento que contiene la cámara deslizante.Coloque el tejido explantado en una toallita de tejido. Aplicar aceite de inmersión al objetivo. Monte la cámara de portaobjetos en el microscopio.Ajuste los canales láser para la adquisición de imágenes. Compruebe los límites de la capa z de la muestra. Configuración de imágenes de tiempo y capas z.El sistema de explante de cola 3-D mantiene intacta la integración celular con el brote de cola y el exceso de elongación como embriones enteros. También es posible detener el exceso de elongación activando químicamente la superficie con colágeno tipo uno. El sistema de explantes de cola de pez cebra 3-D nos permite explotar la transparencia de los embriones de pez cebra al permitirnos tomar imágenes de microscopía de alta resolución y casi objetivas.Además de eso, nos permite desacoplar el exceso de elongación de la señalización de morfógenos y también controlar las fuentes de señalización de morfógenos con métodos de disección simples.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Investigación

Biología del Desarrollo

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Aislamiento y cultivo de neuroesferas derivada de cerebro de adultos de pez cebra

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Producción y Administración de la terapéutica madre mesenquimales / célula del estroma (MSC) esferoides imprimado en 3-D Los cultivos bajo condiciones Xeno-libres

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Aplicación de sistema de cultivo de explantes de Aorta-gónada-mesonefros en hematopoyesis del desarrollo

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Cultura Organotypic método para estudiar el desarrollo de tejidos de embrión de pollo

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Cultura y transfección de células primarias de pez cebra

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

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Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

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Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Enfoques de visualización y análisis tridimensionales y de cuatro dimensiones para estudiar la elongación y segmentación axial de vertebrados

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...