Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

这项工作得到了欧洲联盟第七研究、技术开发和示范框架方案（第305134号赠款协议）的支持。Zsuzsanna Izsvák由欧洲研究理事会ERC Advanced（ERC-2011-ADG 294742）资助。作者要感谢Anna Dobias和Antje Schiefer（亚琛工业大学医院眼科）的出色技术支持，以及亚琛角膜库（亚琛工业大学医院眼科）为人类捐赠者的眼睛提供。

根据《赫尔辛基宣言议定书》获得知情同意后，从亚琛工业大学医院眼科亚琛角膜库获得人类供体眼睛。收集和使用人体样本的程序已得到机构伦理委员会的批准。
1. 原代人RPE细胞的分离
<ol><li>摆好无菌防护服和手套。将无菌窗帘置于层流下。</li>
	<li>将无菌制备仪器和其他必要的无菌设备置于层流下。</li>
	<li>记录眼球的接收，准备的开始以及可能的异常。登记捐赠者的?...

在我们的项目中，我们的目标是非病毒生产转基因原代人类RPE细胞，这些细胞不断过表达并分泌有效因子，以便将转染的细胞用作建立和维持保护环境的长期治疗药物。我们已经建立了编码PEDF的基因的引入，PEDF是一种普遍表达的多功能蛋白质，具有抗血管生成和神经保护功能。此处描述的方案可用于使用 SB100X 转座子系统稳定且可重复地转染原代人RPE细胞。DNA递送和引入RPE细胞是使用基于...

高龄被描述为神经退行性疾病的主要风险。年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种导致60岁以上患者严重视力丧失的多基因疾病，属于失明和视力障碍的四个最常见原因1，预计到2040年将增加到2.88亿人2。视网膜色素上皮（RPE）功能障碍，即位于绒毛细血管和视网膜光感受器之间的单层紧密堆积的细胞，有助于AMD的发病机制。RPE完成对正常视网膜功能3至关重要的多项任务，并分泌多种生长因子和维持视网膜和脉络膜毛细血管结构完整性所必需的因子，从而支持光感受器存活并为循环和营养供应提供基础。
在健康的眼睛中，色素上皮衍生因子（PEDF）负责平衡血管内皮生长因子（VEGF）的作用，保护神经元免受细胞凋亡，防止内皮细胞增殖，并稳定毛细血管内皮。VEGF与PEDF比值的转移与眼部新生血管形成有关，在动物模型4，5以及AMD和增殖性糖尿病视网膜病变引起的脉络膜新生血管（CNV）患者样本中观察到6，7，8，9，10.提高的VEGF浓度是当前标准处理的目标。抗VEGF药物贝伐珠单抗，雷珠单抗，阿柏西普以及最近的brolucizumab改善了约三分之一CNV患者的视力，或者更确切地说，在90%的病例中稳定了视力11，12，13。然而，频繁的玻璃体内注射通常会带来不良事件的风险14，损害患者的依从性，并对医疗保健系统造成重大的经济负担15。此外，一定比例的患者（2%-20%）对抗VEGF治疗无反应或反应不佳16，17，18，19。这些阴性伴随因素需要开发替代疗法，例如眼内植入物、细胞和/或基因治疗方法。
基因疗法已经发展成为遗传性和非遗传性疾病的有前途的治疗方法，并打算恢复非功能性基因序列或抑制功能障碍的基因序列。对于几乎不可能识别和替代致病因素的多基因疾病，策略旨在持续提供保护因素。在AMD的情况下，已经开发了各种添加剂疗法，例如内皮抑素和血管抑素20的稳定表达，VEGF拮抗剂可溶性FMS样酪氨酸激酶-1（sFLT-1）21，22，补体调节蛋白簇分化59（CD59）23或PEDF24，25.眼睛，尤其是视网膜，是基因药物的绝佳靶标，因为它具有封闭的结构、良好的可及性、小尺寸和免疫特权，因此允许局部递送低治疗剂量并使移植不易产生排斥反应。此外，眼睛可以进行无创监测，并且可以通过不同的成像技术检查视网膜。
由于其高转导效率，病毒载体是将治疗基因递送到靶细胞的主要载体。然而，根据所使用的病毒载体，已经描述了不同的不良反应，例如免疫和炎症反应26，诱变和致癌作用27，28，或在其他组织中的播散29。实际限制包括包装尺寸限制30以及与生产临床级批次31，32相关的困难和成本。这些缺点促进了通过脂质体/多链体、超声或电穿孔转移的非病毒、基于质粒的载体的进一步发展。然而，质粒载体通常不会促进转基因与宿主基因组的基因组整合，从而导致瞬时表达。
转座子是天然存在的DNA片段，可以改变它们在基因组中的位置，这一特征已被用于基因治疗。由于具有主动整合机制，基于转座子的载体系统允许插入的转基因的连续和恒定表达。睡美人（SB）转座子由鱼类33中发现的古代Tc1/mariner型转座子重组而成，并通过分子进化进一步改进，从而产生过度活跃的变体SB100X34，能够在各种原代细胞中实现有效转座，并用于不同疾病模型中的表型校正35。目前，使用SB转座子系统已启动13项临床试验。SB100X转座子系统由两部分组成：转座子，其包含目的基因，两侧是末端倒置重复序列（TIR））和转座酶，其动员转座子。在质粒DNA递送到细胞后，转座酶结合TIR并催化转座子的切除和整合到细胞基因组中。
我们开发了一种基于非病毒细胞的添加剂疗法，用于治疗新生血管性AMD。该方法包括通过SB100X转座子系统36，37，38将基于电穿孔的PEDF基因插入原代色素上皮（PE）细胞中。转座酶和PEDF的遗传信息在单独的质粒上提供，从而能够调整理想的SB100X与PEDF转座子比。电穿孔使用基于移液器的毛细管转染系统进行，其特点是电极之间的间隙尺寸最大化，同时最小化其表面积。该装置被证明在广泛的哺乳动物细胞中实现了出色的转染率39，40，41。小电极表面积提供均匀的电场并减少电解的各种副作用42。
转染色素上皮细胞分泌的PEDF的抗血管生成功能在分析人脐静脉内皮细胞发芽，迁移和凋亡的各种体外实验中显示43。此外，在角膜新生血管形成的兔模型44和CNV43，45，46的大鼠模型中移植PEDF转染的细胞显示出新生血管的下降。
在这里，我们描述了使用毛细管转染系统通过SB100X转座子系统将PEDF基因稳定插入原代人RPE细胞的详细方案。将转染的细胞在培养物中保持21天，随后通过定量聚合酶链反应（qPCR）分析PEDF基因表达，并通过免疫印迹和酶联免疫吸附测定分析PEDF蛋白分泌（ELISA，图1）。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

我们日益老龄化的社会导致神经退行性疾病的发病率上升。到目前为止，病理机制尚未得到充分了解，从而阻碍了确定的治疗方法的建立。用于增加保护因子表达的基于细胞的添加剂基因疗法被认为是治疗神经退行性疾病（如年龄相关性黄斑变性（AMD））的有前途的选择。我们开发了一种使用 睡美人 （SB）转座子系统将编码色素上皮衍生因子（PEDF）的基因稳定表达到原代人色素上皮（PE）细胞基因组中的方法，该因子的特征是神经系统中的神经保护和抗血管生成蛋白。从人类供体的眼睛中分离原代PE细胞并保持培养。达到汇合后，将1 x 104 个细胞悬浮在11 μL重悬缓冲液中，并与含有30 ng高活性 SB （SB100X）转座酶质粒和470 ng PEDF 转座子质粒的2 μL纯化溶液合并。使用以下参数使用毛细管电穿孔系统进行基因改造：两个电压为1，100 V，宽度为20 ms的脉冲。将转染的细胞转移到含有补充有胎牛血清的培养基的培养板中;在第一次培养基交换时加入抗生素和抗真菌药。在独立进行的实验中证明了成功的转染。定量聚合酶链反应（qPCR）显示 PEDF 转基因的表达增加。通过免疫印迹评估，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量，PEDF分泌显着升高并保持稳定。 SB100X介导的转移允许稳定的PEDF基因整合到PE细胞的基因组中，并确保 PEDF 的连续分泌，这对于开发基于细胞的基因添加疗法以治疗AMD或其他视网膜退行性疾病至关重要。此外，对 PEDF 转座子与人PE细胞的整合谱的分析表明，基因组分布几乎是随机的。

原代人RPE细胞的培养和电穿孔 我们已经表明，接种足够数量的动物源性原代RPE细胞可以培养和生长到色素沉着的六角形细胞的集成单层36，37，48。它们在体外形成紧密连接、表现出吞噬活性和表达特异性标记基因的能力48 反映了体内视网膜色素上皮的实质性任务。从人...

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Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

我们开发了一种方案，通过使用 睡美人 （SB）转座子系统，通过编码色素上皮衍生因子（PEDF）的基因电穿孔来转染原代人色素上皮细胞。定量聚合酶链反应（qPCR）、免疫印迹和酶联免疫吸附测定（ELISA）证明了成功的转染。

使用睡美人转座子系统对原代人色素上皮细胞进行基于电穿孔的遗传修饰

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

该方法证明了使用睡美人转座子系统对原代人色素上皮细胞进行基于电穿孔的转染，这是转基因表达和蛋白质分泌的证据。睡美人转座子系统和电穿孔的结合能够高效转染原代人色素上皮细胞，以及稳定和持续的转基因表达和蛋白质分泌。总体目标是建立一种基于细胞的基因加成疗法，用于治疗视网膜退行性疾病，这需要稳定和持续地分泌治疗活性蛋白。演示该程序的将是实验室的医疗技术助理Anne Freialdenhoven和Antje Schiefer。为了制备用于原代人RPE细胞电穿孔的质粒DNA，请使用微量分光光度计定量质粒DNA含量，并将浓度调节至10毫摩尔Tris-HCL中的250纳克/微升。将一体积为250纳克/微升SB100X转座酶质粒DNA与16体积250纳克/微升色素上皮衍生因子转座子质粒DNA混合。将两微升所得血浆混合物加入冰上的无菌1.5毫升安全锁定微量离心管中，并在缓冲管中填充3毫升缓冲液E.然后将管插入移液器站，直到听到咔嗒声，并将转染装置设置为1，100伏，20毫秒脉冲宽度和两个脉冲。准备用于电穿孔的细胞。首先，通过相差显微镜检查原代RPE细胞培养物的形态，以评估其生长和融合度。在细胞培养箱中用每孔500微升0.05%胰蛋白酶EDTA处理细胞7至15分钟。当细胞分离后，通过离心收集细胞，将细胞重悬于一毫升PBS中，并在每次转染反应中离心1至10倍10至四个细胞等分试样。将沉淀重悬于每管11微升缓冲液R中，并向每个试管中加入2微升制备的质粒混合物。将转染移液器的头部插入10 μL转染吸头中，直到夹子完全拾取活塞的安装杆，并将细胞和质粒溶液装入转染吸头中。将转染移液器插入移液器站内的缓冲管中，直到听到咔嗒声，然后按开始开始电穿孔过程。转染后，小心地从移液站取出转染移液器，并立即将细胞和质粒溶液移液到细胞培养板的制备孔中。从RPE细胞培养上清液中纯化his标记的色素上皮衍生因子融合蛋白。首先，使用斜面切割尖端收集每个样品一个 30 微升等分试样的镍 NTA 浆料，并通过离心沉淀镍 NTA 树脂。小心地用200微升One X孵育缓冲液重悬镍NTA树脂，并通过额外的离心沉淀溶液两次。第二次离心后，小心地用每个样品的40微升Four X孵育缓冲液重悬镍NTA树脂颗粒。接下来将 55 微升一等分试样的预处理镍 NTA 浆液与 260 微升 Four X 孵育缓冲液和 900 微升每个转染的 RPE 细胞培养上清液混合。将混合物在室温下在摇床上孵育60分钟，然后再次沉淀镍NTA树脂混合物。小心地将沉淀重悬于175微升One X孵育缓冲液中，并将混合物再离心两次。第二次离心后，小心地将镍NTA树脂颗粒重悬于30微升洗脱缓冲液中，在室温下振荡孵育20分钟，然后再次离心样品。然后小心收集上清液并将其与Two X SDS样品缓冲液混合，用于纯化蛋白质的蛋白质血液分析。从人类供体眼睛分离的培养原代RPE细胞表现出典型的鹅卵石形态，无论供体的年龄，死后分离时间或培养时间如何。短期电脉冲在原代人RPE细胞中的应用。使用毛细管转染系统不会对上皮形态产生不利影响。转染原代人RPE细胞培养上清液的西方血液分析显示，色素上皮衍生因子分泌水平一致，无需转基因沉默超过500天。正如在连续转染的细胞培养基的代表性西方血液分析中观察到的那样，在转染后21天观察到普遍较高的色素上皮衍生因子分泌率。在追求培养中，长期升高的 PEDF 分泌持续至少 165 天。此外，基于 ELISA 的定量显示，与相应的非转染对照细胞相比，转染的原代人 RPE 细胞中的总色素上皮衍生因子分泌增加了 20 倍。这一增量在基因表达水平上也得到了证实，在该水平上，总PEDF表达提高了30倍以上。尝试此方案时，重要的是使用其形态对应于体内状态的色素上皮细胞。另外，请记住将细胞溶液吸入转染尖端，不要有气泡。稳定转染的细胞可用于不同的离体或体内模型，以验证这种基于细胞的基因加法疗法的功能。

Research

JoVE Journal

Medicine

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