Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af EU's syvende rammeprogram for forskning, teknologisk udvikling og demonstration, tilskudsaftale nr. 305134. Zsuzsanna Izsvák blev finansieret af Det Europæiske Forskningsråd, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Forfatterne vil gerne takke Anna Dobias og Antje Schiefer (Institut for Oftalmologi, Universitetshospitalet RWTH Aachen) for fremragende teknisk support og Aachen Cornea Bank (Institut for Oftalmologi, Universitetshospital RWTH Aachen) for at give de menneskelige donorøjne.

Menneskelige donorøjne blev indhentet fra Aachen Cornea Bank ved Afdelingen for Oftalmologi (Universitetshospitalet RWTH Aachen) efter at have indhentet informeret samtykke i overensstemmelse med Helsingforserklæringens protokoller. Procedurerne for indsamling og anvendelse af prøver fra mennesker er blevet godkendt af den institutionelle etiske komité.
1. Isolering af primære humane RPE-celler
<ol><li>Læg sterilt beskyttelsestøj og handsker ud. Placer en steril drapering under en lam...

I vores projekt sigter vi mod ikke-viral produktion af genetisk modificerede primære humane RPE-celler, der kontinuerligt overudtrykker og udskiller en effektiv faktor for at bruge de transinficerede celler som langsigtet terapeutisk til etablering og vedligeholdelse af et beskyttende miljø. Vi har etableret introduktionen af genet, der koder for PEDF, et allestedsnærværende udtrykt multifunktionelt protein med anti-angiogene og neurobeskyttende funktioner. Den her beskrevne protokol kan bruges til stabilt og reprodu...

Fremskreden alder beskrives som den største risiko for neurodegenerative sygdomme. Aldersrelateret makuladegeneration (AMD), en polygen sygdom, der fører til alvorligt synstab hos patienter over 60 år, hører til de fire mest almindelige årsager til blindhed og synshandicap1 og forventes at stige til 288 millioner mennesker i 20402. Dysfunktioner af retinal pigmentepitel (RPE), et enkelt lag af tæt pakkede celler placeret mellem choriocapillaris og retinale fotoreceptorer, bidrager til patogenesen af AMD. RPE udfører flere opgaver, der er afgørende for en normal retinal funktion3 og udskiller en række vækstfaktorer og faktorer, der er afgørende for at opretholde nethindens og choriocapillarisens strukturelle integritet, hvilket understøtter fotoreceptoroverlevelse og giver grundlag for cirkulation og tilførsel af næringsstoffer.
I sunde øjne er pigmentepitelafledt faktor (PEDF) ansvarlig for at afbalancere virkningerne af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og beskytter neuroner mod apoptose, forhindrer endotelcelleproliferation og stabiliserer kapillærendotelet. Et forskudt VEGF-til-PEDF-forhold er relateret til okulær neovaskularisering, som blev observeret i dyremodeller 4,5 såvel som i prøver af patienter med choroidal neovaskularisering (CNV) på grund af AMD og proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den øgede VEGF-koncentration er målet for den nuværende standardbehandling. Anti-VEGF-lægemidlerne bevacizumab, ranibizumab, aflibercept og senest brolucizumab forbedrer synsstyrken hos ca. en tredjedel af CNV-patienterne eller rettere stabiliserer synet i 90% af tilfældene11,12,13. De hyppige, ofte månedlige, intravitreale injektioner bærer imidlertid risikoen for bivirkninger14, forringer patienternes overholdelse og udgør en betydelig økonomisk byrde for sundhedssystemerne15. Desuden reagerer en vis procentdel af patienterne (2%-20%) ikke eller reagerer kun dårligt på anti-VEGF-behandlingen16,17,18,19. Disse negative samtidige nødvendiggør udvikling af alternative behandlinger, f.eks. intraokulære implantater, celle- og/eller genterapeutiske tilgange.
Genterapi har udviklet sig som lovende behandling af arvelige og ikke-arvelige sygdomme og har til hensigt at genoprette ikke-funktionelle gensekvenser eller undertrykke funktionsfejl. For polygene sygdomme, hvor identifikation og udskiftning af årsagsfaktorerne næppe er mulig, sigter strategier mod kontinuerlig levering af en beskyttende faktor. I tilfælde af AMD er der udviklet forskellige additive terapier, såsom den stabile ekspression af endostatin og angiostatin 20, VEGF-antagonisten opløselig fms-lignende tyrosinkinase-1 (sFLT-1)21,22, den komplementregulerende proteinklynge af differentiering 59 (CD59)23 eller PEDF 24,25 . Øjet, og især nethinden, er et glimrende mål for en genbaseret medicin på grund af den lukkede struktur, god tilgængelighed, lille størrelse og immunprivilegium, hvilket muliggør en lokaliseret levering af lave terapeutiske doser og gør transplantationer mindre modtagelige for afvisning. Desuden muliggør øjet ikke-invasiv overvågning, og nethinden kan undersøges ved forskellige billeddannelsesteknikker.
Virale vektorer er på grund af deres høje transduktionseffektivitet det vigtigste middel til at levere terapeutiske gener til målceller. Afhængigt af den anvendte virale vektor er der imidlertid beskrevet forskellige bivirkninger, såsom immun- og inflammatoriske reaktioner26, mutagene og onkogene virkninger 27,28 eller spredning i andre væv29. Praktiske begrænsninger omfatter en begrænset emballagestørrelse30 samt vanskeligheder og omkostninger forbundet med produktion af kliniske kvalitetspartier31,32. Disse ulemper har fremmet den videre udvikling af ikke-virale, plasmidbaserede vektorer, der overføres via lipo-/polyplexer, ultralyd eller elektroporation. Imidlertid fremmes genomisk integration af transgenet i værtsgenomet normalt ikke med plasmidvektorer, hvilket resulterer i et forbigående udtryk.
Transposoner er naturligt forekommende DNA-fragmenter, der ændrer deres position inden for genomet, en egenskab, der er blevet vedtaget til genterapi. På grund af en aktiv integrationsmekanisme giver transposonbaserede vektorsystemer mulighed for en kontinuerlig og konstant ekspression af det indsatte transgen. Tornerose (SB) transposon, rekonstitueret fra en gammel Tc1 / mariner-type transposon fundet i fisk33 og yderligere forbedret ved molekylær evolution, hvilket resulterede i den hyperaktive variant SB100X34, muliggjorde effektiv transponering i forskellige primære celler og blev brugt til fænotypisk korrektion i forskellige sygdomsmodeller35. På nuværende tidspunkt er der indledt 13 kliniske forsøg ved hjælp af SB-transposonsystemet. SB100X transposonsystemet består af to komponenter: transposonen, som omfatter genet af interesse flankeret af terminale inverterede gentagelser (TIR'er), og transposasen, som mobiliserer transposonen. Efter plasmid-DNA-levering til cellerne binder transposasen TIR'erne og katalyserer excisionen og integrationen af transposon i cellens genom.
Vi har udviklet en ikke-viral cellebaseret additiv terapi til behandling af neovaskulær AMD. Fremgangsmåden omfatter den elektroporationsbaserede indsættelse af PEDF-genet i primære pigmentepitelceller (PE) ved hjælp af SB100X-transposonsystemet 36,37,38. Den genetiske information af transposase og PEDF tilvejebringes på separate plasmider, hvilket muliggør justering af det ideelle SB100X-til-PEDF transposonforhold. Elektroporation udføres ved hjælp af et pipettebaseret kapillærtransfektionssystem, der er kendetegnet ved en maksimeret mellemrumsstørrelse mellem elektroderne, samtidig med at deres overfladeareal minimeres. Enheden viste sig at opnå fremragende transfekktionshastigheder i en bred vifte af pattedyrceller 39,40,41. Det lille elektrodeoverfladeareal giver et ensartet elektrisk felt og reducerer de forskellige bivirkninger af elektrolyse42.
Den anti-angiogene funktionalitet af PEDF udskilt af transinficerede pigmentepitelceller blev vist i forskellige in vitro-eksperimenter, der analyserede spiring, migration og apoptose af humane navlestrengsvenendotelceller43. Derudover viste transplantation af PEDF-transficerede celler i en kaninmodel af hornhinde neovaskularisering44 samt en rottemodel af CNV43,45,46 fald i neovaskularisering.
Her beskriver vi en detaljeret protokol for stabil indsættelse af PEDF-genet i primære humane RPE-celler via SB100X-transposonsystemet ved hjælp af et kapillærtransfektionssystem. De transinficerede celler blev holdt i kultur i 21 dage og efterfølgende analyseret med hensyn til PEDF-genekspression ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) og med hensyn til PEDF-proteinsekretion ved immunoblotting og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA, figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

Vores stadig ældre samfund fører til en stigende forekomst af neurodegenerative sygdomme. Indtil videre er de patologiske mekanismer utilstrækkeligt forstået, hvilket hindrer etableringen af definerede behandlinger. Cellebaserede additive genterapier til øget ekspression af en beskyttende faktor betragtes som en lovende mulighed for at medicinere neurodegenerative sygdomme, såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD). Vi har udviklet en metode til stabil ekspression af den genkodende pigmentepitelafledte faktor (PEDF), der er karakteriseret som et neurobeskyttende og anti-angiogent protein i nervesystemet, ind i genomet af primære humane pigmentepitelceller (PE) ved hjælp af Sleeping Beauty (SB) transposonsystemet. Primære PE-celler blev isoleret fra humane donorøjne og opretholdt i kultur. Efter at have nået sammenløbet blev 1 x 104 celler suspenderet i 11 μL resuspensionbuffer og kombineret med 2 μL af en oprenset opløsning indeholdende 30 ng hyperaktivt SB (SB100X) transposaseplasmid og 470 ng PEDF transposonplasmid. Genetisk modifikation blev udført med et kapillærelektroporationssystem ved hjælp af følgende parametre: to impulser med en spænding på 1.100 V og en bredde på 20 ms. Transinficerede celler blev overført til dyrkningsplader indeholdende medium suppleret med føtalt bovint serum; antibiotika og antimykotika blev tilsat med den første mediumudveksling. Vellykket transfektion blev demonstreret i uafhængigt udførte eksperimenter. Kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) viste den øgede ekspression af PEDF-transgenet . PEDF-sekretionen var signifikant forhøjet og forblev stabil, som evalueret ved immunoblotting og kvantificeret ved enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). SB100X-medieret overførsel muliggjorde en stabil PEDF-genintegration i genomet af PE-celler og sikrede kontinuerlig sekretion af PEDF, hvilket er kritisk for udviklingen af en cellebaseret genadditionsterapi til behandling af AMD eller andre retinale degenerative sygdomme. Desuden viste analyse af PEDF-transponens integrationsprofil i humane PE-celler en næsten tilfældig genomisk fordeling.

Dyrkning og elektroporation af primære humane RPE-celler Vi har vist, at såning af et tilstrækkeligt antal primære RPE-celler af animalsk oprindelse muliggør dyrkning og vækst til et integreret monolag af pigmenterede, sekskantede celler36,37,48. Deres evne til at danne tætte kryds, udvise fagocytisk aktivitet og udtrykke specifikke markørgener in vitro<sup class="xref...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Vi har udviklet en protokol til at transficere primære humane pigmentepitelceller ved elektroporation med genet, der koder for pigmentepitelafledt faktor (PEDF) ved hjælp af Sleeping Beauty (SB) transposonsystemet. Vellykket transfektion blev påvist ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR), immunoblotting og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA).

Elektroporationsbaseret genetisk modifikation af primære humane pigmentepitelceller ved hjælp af Sleeping Beauty Transposon-systemet

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Denne metode demonstrerer elektroporationsbaseret transfektion af primære humane pigmentepitelceller ved hjælp af Sleeping Beauty Transposon System, et bevis for transgenekspression og proteinsekretion. Kombinationen af Sleeping Beauty Transposon System og elektroporation muliggør effektiv transfektion af primære humane pigmentepitelceller samt stabil og vedvarende transgenekspression og proteinsekretion. Det overordnede mål er at etablere en cellebaseret genadditionsterapi til behandling af retinale degenerative sygdomme, hvilket kræver stabil og vedvarende sekretion af det terapeutisk aktive protein.Demonstrerer proceduren vil være Anne Freialdenhoven og Antje Schiefer, medicinske tekniske assistenter fra laboratoriet. For at forberede plasmid-DNA til primær human RPE-celleelektroporation skal du bruge et mikrovolumenspektrofotometer til at kvantificere plasmid-DNA-indholdet og justere koncentrationen til 250 nanogram pr. Mikroliter i 10 millimolar Tris-HCL. Bland et volumen på 250 nanogram pr. mikroliter SB100X transposase plasmid-DNA med 16 volumener af 250 nanogram pr. mikroliter pigmentepitel afledt faktortransposon plasmid-DNA.Tilsæt to mikroliter af den resulterende plasmablanding i et sterilt 1,5 ml sikkert lås mikrocentrifugerør på is og fyld et bufferrør med tre milliliter buffer E.Indsæt derefter røret i pipettestationen, indtil et klik høres, og indstil transfektionsanordningen til 1.100 volt, en pulsbredde på 20 millisekunder og to impulser. At forberede cellerne til elektroporation. Først skal du kontrollere morfologien af de primære RPE-cellekulturer via fasekontrastmikroskopi for at vurdere deres vækst og sammenløb.Behandl cellerne med 500 mikroliter 0,05% Trypsin EDTA pr. Brønd i syv til 15 minutter i cellekulturinkubatoren. Når cellerne har løsrevet, opsamles cellerne ved centrifugering, resuspenderes cellerne i en milliliter PBS og centrifugeres en til 10 gange 10 til de fire cellealikvoter pr. Transfektionsreaktion. Resuspender pellets i 11 mikroliter buffer R pr. rør og tilsæt to mikroliter af den fremstillede plasmidblanding til hvert rør.Indsæt hovedet på en transfektionspipette i en 10 mikroliter transfektionsspids, indtil klemmen helt opfanger stemplets monteringsstamme og lægger celle- og plasmidopløsningen i transfektionsspidsen. Indsæt transfektionspipetten i bufferrøret, der er placeret i pipettestationen, indtil der høres et klik, og tryk på start for at starte elektroporationsprocessen. Efter transfekten fjernes transfektionspipetten forsigtigt fra pipettestationen, og celle- og plasmidopløsningen pipetteres straks i de forberedte brønde på cellekulturpladen.At rense hans mærkede pigmentepitel afledte faktorfusionsproteiner fra RPE-cellekultursupernatanter. Brug først en skrå skåret spids til at indsamle en 30 mikroliter aliquot nikkel NTA-opslæmning pr. prøve og pellet nikkel NTA-harpiksen ved centrifugering. Forsigtigt resuspenderer nikkel NTA-harpiksen med 200 mikroliter One X-inkubationsbuffer og pelleterer opløsningen med en yderligere centrifugering to gange.Efter den anden centrifugering resuspenderes nikkel NTA-harpikspillerne forsigtigt med 40 mikroliter fire X inkubationsbuffer pr. Prøve. Derefter blandes 55 mikroliter af en aliquot forbehandlet nikkel NTA-opslæmning med 260 mikroliter Four X inkubationsbuffer og 900 mikroliter af hver transefteret RPE-cellekultursupernatant. Inkuber blandingen på en gyngeryster ved stuetemperatur i 60 minutter og pellet nikkel NTA-harpiksblandingerne igen.Resuspender forsigtigt pellets i 175 mikroliter One X-inkubationsbuffer og centrifugerer blandingerne yderligere to gange. Efter den anden centrifugering resuspenderes nikkel NTA-harpikspillerne forsigtigt i 30 mikroliter elutionsbuffer til en 20 minutters inkubation ved stuetemperatur med omrystning og centrifuge prøverne igen. Derefter samles supernatanterne omhyggeligt og blandes med Two X SDS-prøvebuffer til vestlig blodanalyse af de oprensede proteiner.Kultiverede primære RPE-celler isoleret fra humane donorøjne viser en typisk brostensmorfologi uanset donorens alder, isolationstid efter døden eller dyrkningstidspunktet. Anvendelse af kortvarige elektriske impulser på primære humane RPE-celler. Brug af kapillærtransfektionssystemet påvirker ikke epitelmorfologien negativt.Vestlig blodanalyse af transinficerede primære humane RPE-cellekultursupernatanter viser pigmentepitel afledt faktorsekretion på ensartede niveauer uden transgenhæmning i mere end 500 dage. Som observeret i denne repræsentative vestlige blodanalyse af cellekulturmedium fra serielt udførte transfektioner observeres en universelt højere pigmentepitel afledt faktorsekretionshastighed 21 dage efter transfektion. I en forfulgt kultur varer langvarig forhøjet PEDF-sekretion i mindst 165 dage.Derudover afslører ELISA-baseret kvantificering en 20 gange stigning i total pigmentepitel afledt faktorsekretion i transficerede primære humane RPE-celler sammenlignet med respektive ikke-transficerede kontrolceller. Denne stigning blev også bekræftet på genekspressionsniveauet, hvor den samlede PEDF-ekspression blev hævet mere end 30 gange. Når du forsøger denne protokol, er det vigtigt at bruge pigmentepitelceller, hvis morfologi svarer til In Vivo-status.Husk også at trække celleopløsningen op i transfektionsspidsen uden luftbobler. De stabilt transficerede celler kan bruges i forskellige Ex Vivo- eller In vivo-modeller for at verificere funktionaliteten af denne cellebaserede genadditionsterapi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Hud Punch Biopsi Eksplantation Culture for Udledning af primære humane fibroblaster

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifikation af<em&gt; Tornerose</em&gt; Transposon Insertioner i solide tumorer med Linker-medieret PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse Imaging af primære præneoplastiske brystepitelceller celler afledt fra gensplejsede musemodeller for brystkræft

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation, Kryopræservering og dyrkning af humane amnion epitelceller ved kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Udførelse subretinale Injektioner i Gnavere at levere retinale pigmentepitel celler i suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypiske High Throughput System til karakterisering af Drug følsomhed Primære myelomatoseceller

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Induktion af accelereret åreforkalkning i Mus: Den "Wire-Skade" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolering af primære humane Decidual celler fra de føtale membraner af udtrykket efterbyrd

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisering af endogene Mitophagy komplekser in situ i humane bugspytkirtel beta celler udnytte nærhed ligation assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer

Måling af carotenoider i Perifovea ved hjælp af maculapigmentreflektoren

The macular pigment reflectometer (MPR) objectively measures the overall macular pigment optical density (MPOD) and further provides the lutein optical ...