Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het zevende kaderprogramma van de Europese Unie voor onderzoek, technologische ontwikkeling en demonstratie, subsidieovereenkomst nr. 305134. Zsuzsanna Izsvák werd gefinancierd door de European Research Council, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). De auteurs willen Anna Dobias en Antje Schiefer (afdeling Oogheelkunde, Universitair Ziekenhuis RWTH Aachen) bedanken voor uitstekende technische ondersteuning, en de Aachen Cornea Bank (Afdeling Oogheelkunde, Universitair Ziekenhuis RWTH Aachen) voor het verstrekken van de menselijke donorogen.

Menselijke donorogen werden verkregen van de Aachen Cornea Bank van de afdeling Oogheelkunde (Universitair Ziekenhuis RWTH Aachen) na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming in overeenstemming met de Protocollen van de Verklaring van Helsinki. Procedures voor het verzamelen en gebruiken van menselijke monsters zijn goedgekeurd door de institutionele ethische commissie.
1. Isolatie van primaire menselijke RPE-cellen
<ol><li>Leg steriele beschermende kleding en handschoenen neer. Plaats ...

In ons project streven we naar de niet-virale productie van genetisch gemodificeerde primaire menselijke RPE-cellen die voortdurend overexpressie en afscheiding van een effectieve factor om de getransfecteerde cellen te gebruiken als langetermijntherapeutisch middel voor het creëren en onderhouden van een beschermende omgeving. We hebben de introductie vastgesteld van het gen dat codeert voor PEDF, een alomtegenwoordig tot expressie gebracht multifunctioneel eiwit met anti-angiogene en neuroprotectieve functies. Het hie...

Gevorderde leeftijd wordt beschreven als het belangrijkste risico voor neurodegeneratieve ziekten. Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), een polygene ziekte die leidt tot ernstig verlies van het gezichtsvermogen bij patiënten ouder dan 60 jaar, behoort tot de vier meest voorkomende oorzaken van blindheid en slechtziendheid1 en zal naar verwachting toenemen tot 288 miljoen mensen in 20402. Disfuncties van het retinale pigmentepitheel (RPE), een enkele laag dicht opeengepakte cellen tussen de choriocapillaris en de retinale fotoreceptoren, dragen bij aan de pathogenese van AMD. De RPE vervult meerdere taken die essentieel zijn voor een normale retinale functie3 en scheidt een verscheidenheid aan groeifactoren en factoren af die essentieel zijn om de structurele integriteit van het netvlies en de choriocapillaris te behouden, waardoor de overleving van de fotoreceptor wordt ondersteund en een basis wordt gelegd voor de circulatie en de toevoer van voedingsstoffen.
In gezonde ogen is pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) verantwoordelijk voor het balanceren van de effecten van vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF) en beschermt neuronen tegen apoptose, voorkomt proliferatie van endotheelcellen en stabiliseert het capillaire endotheel. Een verschoven VEGF-pedf-verhouding is gerelateerd aan oculaire neovascularisatie, die werd waargenomen in diermodellen 4,5 en in monsters van patiënten met choroïdale neovascularisatie (CNV) als gevolg van AMD en proliferatieve diabetische retinopathie 6,7,8,9,10 . De verhoogde VEGF-concentratie is het doel voor de huidige standaardbehandeling. De anti-VEGF-geneesmiddelen bevacizumab, ranibizumab, aflibercept en, meest recent, brolucizumab verbeteren de gezichtsscherpte bij ongeveer een derde van de CNV-patiënten of stabiliseren het gezichtsvermogen in 90% van de gevallen 11,12,13. De frequente, vaak maandelijkse, intravitreale injecties dragen echter het risico op bijwerkingen14, tasten de therapietrouw van de patiënt aan en vormen een aanzienlijke economische last voor de gezondheidszorgstelsels15. Bovendien reageert een bepaald percentage van de patiënten (2%-20%) niet of slechts slecht op de anti-VEGF-therapie 16,17,18,19. Deze negatieve gelijktijdige factoren vereisen de ontwikkeling van alternatieve behandelingen, bijvoorbeeld intraoculaire implantaten, cel- en/of gentherapeutische benaderingen.
Gentherapie is geëvolueerd als veelbelovende behandeling voor erfelijke en niet-erfelijke ziekten en is bedoeld om niet-functionele gensequenties te herstellen of slecht functionerende te onderdrukken. Voor polygene ziekten, waarbij identificatie en vervanging van de oorzakelijke factoren nauwelijks mogelijk is, streven strategieën naar de continue levering van een beschermende factor. In het geval van AMD zijn verschillende additieve therapieën ontwikkeld, zoals de stabiele expressie van endostatine en angiostatine20, de VEGF-antagonist oplosbare fms-achtige tyrosinekinase-1 (sFLT-1)21,22, het complementregulerende eiwitcluster van differentiatie 59 (CD59)23 of PEDF24,25 . Het oog, en vooral het netvlies, is een uitstekend doelwit voor een op genen gebaseerd medicijn vanwege de gesloten structuur, goede toegankelijkheid, kleine omvang en immuunprivilege, waardoor een gelokaliseerde levering van lage therapeutische doses mogelijk is en transplantaties minder vatbaar zijn voor afstoting. Bovendien maakt het oog niet-invasieve monitoring mogelijk en kan het netvlies worden onderzocht met verschillende beeldvormingstechnieken.
Virale vectoren zijn, vanwege hun hoge transductie-efficiëntie, het belangrijkste voertuig om therapeutische genen in doelcellen af te leveren. Afhankelijk van de gebruikte virale vector zijn echter verschillende bijwerkingen beschreven, zoals immuun- en ontstekingsreacties26, mutagene en oncogene effecten27,28 of verspreiding in andere weefsels29. Praktische beperkingen zijn onder meer een beperkte verpakkingsgrootte30 en moeilijkheden en kosten in verband met de productie van partijen31,32 van klinische kwaliteit. Deze nadelen hebben de verdere ontwikkeling bevorderd van niet-virale, op plasmide gebaseerde vectoren die worden overgedragen via lipo-/polyplexen, echografie of elektroporatie. Genomische integratie van het transgen in het gastheergenoom wordt echter meestal niet bevorderd met plasmidevectoren, wat resulteert in een voorbijgaande expressie.
Transposons zijn natuurlijk voorkomende DNA-fragmenten die hun positie in het genoom veranderen, een kenmerk dat is aangenomen voor gentherapie. Dankzij een actief integratiemechanisme zorgen transposon-gebaseerde vectorsystemen voor een continue en constante expressie van het ingebrachte transgen. Het Sleeping Beauty (SB) transposon, gereconstitueerd uit een oud Tc1/mariner-type transposon gevonden in vis33 en verder verbeterd door moleculaire evolutie resulterend in de hyperactieve variant SB100X34, maakte efficiënte transpositie in verschillende primaire cellen mogelijk en werd gebruikt voor de fenotypische correctie in verschillende ziektemodellen35. Op dit moment zijn 13 klinische onderzoeken gestart met behulp van het SB transposon systeem. Het SB100X transposon systeem bestaat uit twee componenten: het transposon, dat bestaat uit het gen van belang geflankeerd door terminale inverted repeats (TIRs), en het transposase, dat het transposon mobiliseert. Na plasmide-DNA-levering aan de cellen bindt het transposase de TIRs en katalyseert het de excisie en integratie van het transposon in het genoom van de cel.
We hebben een niet-virale celgebaseerde additieve therapie ontwikkeld voor de behandeling van neovasculaire LMD. De aanpak omvat de op elektroporatie gebaseerde insertie van het PEDF-gen in primaire pigmentepitheelcellen (PE) door middel van het SB100X transposonsysteem 36,37,38. De genetische informatie van de transposase en PEDF wordt verstrekt op afzonderlijke plasmiden, waardoor de ideale SB100X-PEDF-transposonverhouding kan worden aangepast. Elektroporatie wordt uitgevoerd met behulp van een op pipet gebaseerd capillair transfectiesysteem dat wordt gekenmerkt door een maximale spleetgrootte tussen de elektroden terwijl hun oppervlak wordt geminimaliseerd. Het apparaat bleek uitstekende transfectiesnelheden te bereiken in een breed scala van zoogdiercellen 39,40,41. Het kleine elektrodeoppervlak zorgt voor een uniform elektrisch veld en vermindert de verschillende bijwerkingen van elektrolyse42.
De anti-angiogene functionaliteit van PEDF uitgescheiden door getransfecteerde pigmentepitheelcellen werd aangetoond in verschillende in vitro experimenten die het kiemen, migreren en apoptose van menselijke navelstrenga-endotheelcellen analyseerden43. Bovendien vertoonde transplantatie van PEDF-getransfecteerde cellen in een konijnenmodel van cornea-neovascularisatie44 en een rattenmodel van CNV 43,45,46 een afname van neovascularisatie.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de stabiele insertie van het PEDF-gen in primaire menselijke RPE-cellen via het SB100X-transposonsysteem met behulp van een capillair transfectiesysteem. De getransfecteerde cellen werden gedurende 21 dagen in cultuur gehouden en vervolgens geanalyseerd in termen van PEDF-genexpressie door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en in termen van PEDF-eiwitsecretie door immunoblotting en enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA, figuur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

Onze steeds ouder wordende samenleving leidt tot een groeiende incidentie van neurodegeneratieve ziekten. Tot nu toe zijn de pathologische mechanismen onvoldoende begrepen, waardoor de vaststelling van gedefinieerde behandelingen wordt belemmerd. Celgebaseerde additieve gentherapieën voor de verhoogde expressie van een beschermende factor worden beschouwd als een veelbelovende optie om neurodegeneratieve ziekten, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), te mediteren. We hebben een methode ontwikkeld voor de stabiele expressie van het gen dat codeert voor pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF), die wordt gekenmerkt als een neuroprotectief en anti-angiogeen eiwit in het zenuwstelsel, in het genoom van primaire menselijke pigmentepitheelcellen (PE) met behulp van het Transposon-systeem van Doornroosje (SB). Primaire PE-cellen werden geïsoleerd uit menselijke donorogen en in cultuur gehouden. Na het bereiken van confluence werden 1 x 104 cellen gesuspendeerd in 11 μL resuspensiebuffer en gecombineerd met 2 μL van een gezuiverde oplossing met 30 ng hyperactief SB (SB100X) transposaseplasmide en 470 ng PEDF transposonplasmide. Genetische modificatie werd uitgevoerd met een capillair elektroporatiesysteem met behulp van de volgende parameters: twee pulsen met een spanning van 1.100 V en een breedte van 20 ms. Getransfecteerde cellen werden overgebracht in kweekplaten met medium aangevuld met foetaal runderserum; antibiotica en antimycotica werden toegevoegd met de eerste medium uitwisseling. Succesvolle transfectie werd aangetoond in onafhankelijk uitgevoerde experimenten. Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) toonde de verhoogde expressie van het PEDF-transgen . PEDF-secretie was significant verhoogd en bleef stabiel, zoals geëvalueerd door immunoblotting en gekwantificeerd door enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-gemedieerde overdracht zorgde voor een stabiele PEDF-genintegratie in het genoom van PE-cellen en zorgde voor de continue afscheiding van PEDF, wat van cruciaal belang is voor de ontwikkeling van een celgebaseerde gentoevoegingstherapie voor de behandeling van AMD of andere retinale degeneratieve ziekten. Bovendien wees analyse van het integratieprofiel van het PEDF-transposon in menselijke PE-cellen op een bijna willekeurige genomische verdeling.

Teelt en elektroporatie van primaire menselijke RPE-cellen We hebben aangetoond dat het zaaien van een voldoende aantal primaire RPE-cellen van dierlijke oorsprong de teelt en groei mogelijk maakt tot een geïntegreerde monolaag van gepigmenteerde, zeshoekig gevormde cellen 36,37,48. Hun vermogen om tight junctions te vormen, fagocytische activiteit te vertonen en specifieke m...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

We hebben een protocol ontwikkeld om primaire menselijke pigmentepitheelcellen te transfecteren door elektroporatie met het gen dat codeert voor pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) met behulp van het Transposon-systeem van Doornroosje (SB). Succesvolle transfectie werd aangetoond door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR), immunoblotting en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Op elektroporatie gebaseerde genetische modificatie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon-systeem

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Deze methode demonstreert op elektroporatie gebaseerde transfectie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen met behulp van het Sleeping Beauty Transposon System, een bewijs voor transgene expressie en eiwitsecretie. De combinatie van het Sleeping Beauty Transposon-systeem en elektroporatie maakt een efficiënte transfectie van primaire menselijke pigmentepitheelcellen mogelijk, evenals stabiele en persistente transgene expressie en eiwitsecretie. Het algemene doel is om een celgebaseerde genadditietherapie op te zetten voor de behandeling van retinale degeneratieve ziekten, die een stabiele en aanhoudende afscheiding van het therapeutisch actieve eiwit vereist.De procedure wordt gedemonstreerd door Anne Freialdenhoven en Antje Schiefer, medisch technisch assistenten van het laboratorium. Om Plasmid DNA voor te bereiden op primaire menselijke RPE-celelektroporatie, gebruikt u een microvolumespectrofotometer om de Plasmid DNA-inhoud te kwantificeren en de concentratie aan te passen tot 250 nanogram per microliter in 10 millimol Tris-HCL. Meng één volume van 250 nanogram per microliter SB100X transposase Plasmid DNA met 16 volumes van 250 nanogram per microliter pigmentepitheel afgeleide factor transposon Plasmid DNA.Voeg twee microliter van het resulterende plasmamengsel toe aan een steriele 1,5 milliliter veilige vergrendelingsmicrocentrifugebuis op ijs en vul een bufferbuis met drie milliliter buffer E.Steek vervolgens de buis in het pipetstation totdat een klik wordt gehoord en stel het transfectieapparaat in op 1.100 volt, een pulsbreedte van 20 milliseconden en twee pulsen. Om de cellen voor te bereiden op elektroporatie. Controleer eerst de morfologie van de primaire RPE-celculturen via fasecontrastmicroscopie om hun groei en confluentie te beoordelen.Behandel de cellen met 500 microliter van 0,05% Trypsine EDTA per put gedurende zeven tot 15 minuten in de celkweekincubator. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, verzamelen de cellen door centrifugatie, resuspenseren de cellen in één milliliter PBS en centrifugeer één tot 10 keer 10 tot de vier cel aliquots per transfectiereactie. Resuspendeer de pellets in 11 microliter buffer R per buis en voeg twee microliter van het bereide plasmidemengsel toe aan elke buis.Steek de kop van een transfectiepipet in een transfectiepunt van 10 microliter totdat de klem de montagesteel van de zuiger volledig oppakt en laad de cel- en plasmideoplossing in de transfectiepunt. Plaats de transfectiepipet in de bufferbuis in het pipetstation totdat een klik wordt gehoord en druk op start om het elektroporatieproces te starten. Verwijder na de transfectie voorzichtig de transfectiepipet uit het pipetstation en pipetteer onmiddellijk de cel en plasmide-oplossing in de voorbereide putten van de celkweekplaat.Om zijn gelabelde pigmentepitheel te zuiveren, zijn factorfusie-eiwitten afgeleid van RPE-celkweeksupernatanten. Gebruik eerst een schuine gesneden punt om één 30 microliter aliquot nikkel NTA-slurry per monster te verzamelen en pelleteer de nikkel NTA-hars door centrifugatie. Resuspenseer de nikkel NTA-hars voorzichtig met 200 microliter One X incubatiebuffer en pelleteer de oplossing twee keer met een extra centrifugatie.Na de tweede centrifugatie resuspenseert u de nikkel NTA-harspellets zorgvuldig met 40 microliter Four X incubatiebuffer per monster. Meng vervolgens 55 microliter van één aliquot voorbehandelde nikkel NTA-slurry met 260 microliter Four X incubatiebuffer en 900 microliter van elk transefcted RPE-celkweeksupernatant. Incubeer het mengsel op een schommelende shaker bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten en pelleteer de nikkel NTA-harsmengsels opnieuw.Resuspenseer de pellets voorzichtig in 175 microliter One X incubatiebuffer en centrifugeer de mengsels nog twee keer. Na de tweede centrifugatie de nikkel NTA-harspellets zorgvuldig resuspenseren in 30 microliter elutiebuffer gedurende een incubatie van 20 minuten bij kamertemperatuur met schudden en de monsters opnieuw centrifugeren. Verzamel vervolgens zorgvuldig de supernatanten en meng ze met Two X SDS-monsterbuffer voor westerse bloedanalyse van de gezuiverde eiwitten.Gecultiveerde primaire RPE-cellen geïsoleerd uit menselijke donorogen vertonen een typische kasseimorfologie, ongeacht de leeftijd van de donor, postmortale tijd van isolatie of tijd van cultivatie. De toepassing van kortdurende elektrische pulsen op primaire menselijke RPE-cellen. Het gebruik van het capillaire transfectiesysteem heeft geen nadelige invloed op de epitheliale morfologie.Westerse bloedanalyse van getransfecteerde primaire humane RPE-celkweeksupernatanten toont pigmentepitheel afgeleide factorsecretie op consistente niveaus zonder transgene uitschakeling gedurende meer dan 500 dagen. Zoals waargenomen in deze representatieve westerse bloedanalyse van celkweekmedium van in serieel uitgevoerde transfecties, wordt een universeel hogere van pigmentepitheel afgeleide factorsecretiesnelheid waargenomen op 21 dagen na transfectie. In een nagestreefde cultuur duurt langdurige verhoogde PEDF-secretie minstens 165 dagen.Bovendien onthult elisa-gebaseerde kwantificering een 20-voudige toename van totale pigmentepitheel afgeleide factorsecretie in getransfecteerde primaire menselijke RPE-cellen in vergelijking met respectieve niet-getransfecteerde controlecellen. Deze toename werd ook bevestigd op het genexpressieniveau waarop de totale PEDF-expressie meer dan 30 keer werd verhoogd. Bij het proberen van dit protocol is het belangrijk om pigmentepitheelcellen te gebruiken waarvan de morfologie overeenkomt met de In Vivo-status.Vergeet ook niet om de celoplossing in de transfectiepunt op te zuigen zonder luchtbellen. De stabiel getransfecteerde cellen kunnen worden gebruikt in verschillende Ex Vivo- of In vivo-modellen om de functionaliteit van deze op cellen gebaseerde gentoevoegingstherapie te verifiëren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Huid Punch Biopsie Explantatiestatus Cultuur voor Afleiding van primaire humane fibroblasten

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identificatie van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Transposon inserties in vaste tumoren met Linker-gemedieerde PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolatie, cryopreservatie en cultuur van de mens Amnion epitheelcellen voor klinische toepassingen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Een Organotypische High Throughput systeem voor de karakterisering van de Drug gevoeligheid van Primary Multiple Myeloma cellen

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Inductie van versnelde atherosclerose bij muizen: het "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolatie van primaire menselijke Decidual cellen van de foetus membranen van Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer

Meting van carotenoïden in Perifovea met behulp van de Macula Pigment Reflectometer

The macular pigment reflectometer (MPR) objectively measures the overall macular pigment optical density (MPOD) and further provides the lutein optical ...