Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par le septième programme-cadre de recherche, de développement technologique et de démonstration de l’Union européenne, la convention de subvention n° 305134. Zsuzsanna Izsvák a été financée par le Conseil européen de la recherche, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Les auteurs tiennent à remercier Anna Dobias et Antje Schiefer (Département d’ophtalmologie, Hôpital universitaire RWTH Aix-la-Chapelle) pour leur excellent soutien technique, ainsi que la Banque de cornée d’Aix-la-Chapelle (Département d’ophtalmologie, Hôpital universitaire RWTH Aix-la-Chapelle) pour avoir fourni les yeux du donneur humain.

Les yeux de donneurs humains ont été obtenus auprès de la Banque de cornée d’Aix-la-Chapelle du Département d’ophtalmologie (Hôpital universitaire RWTH Aix-la-Chapelle) après avoir obtenu un consentement éclairé conformément aux protocoles de la Déclaration d’Helsinki. Les procédures de prélèvement et d’utilisation des échantillons humains ont été approuvées par le comité d’éthique de l’établissement.
1. Isolement des cellules EPR humaines primaires
<ol><li>D...

Dans notre projet, nous visons la production non virale de cellules EPR primaires humaines génétiquement modifiées qui surexpriment et sécrètent continuellement un facteur efficace afin d’utiliser les cellules transfectées comme thérapeutique à long terme pour l’établissement et le maintien d’un environnement protecteur. Nous avons établi l’introduction du gène codant pour la PEDF, une protéine multifonctionnelle omniprésente avec des fonctions anti-angiogéniques et neuroprotectrices. Le protocole d...

L’âge avancé est décrit comme le principal risque de maladies neurodégénératives. La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), une maladie polygénique entraînant une perte de vision sévère chez les patients âgés de plus de 60 ans, fait partie des quatre causes les plus fréquentes de cécité et de déficience visuelle1 et devrait atteindre 288 millions de personnes en 20402. Les dysfonctionnements de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), une couche unique de cellules étroitement emballées situées entre le choriocapillaris et les photorécepteurs rétiniens, contribuent à la pathogenèse de la DMLA. L’EPR remplit de multiples tâches essentielles à une fonction rétinienne normale3 et sécrète une variété de facteurs de croissance et de facteurs essentiels pour maintenir l’intégrité structurelle de la rétine et de la choriocapillaris, soutenant ainsi la survie des photorécepteurs et fournissant une base pour la circulation et l’apport de nutriments.
Dans les yeux sains, le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) est responsable de l’équilibre des effets du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) et protège les neurones contre l’apoptose, empêche la prolifération des cellules endothéliales et stabilise l’endothélium capillaire. Un rapport VEGF-/ PEDF décalé est lié à la néovascularisation oculaire, qui a été observée dans les modèles animaux4,5 ainsi que dans des échantillons de patients atteints de néovascularisation choroïdienne (CNV) due à la DMLA et à la rétinopathie diabétique proliférante 6,7,8,9,10 . La concentration accrue de VEGF est la cible du traitement standard actuel. Les produits pharmaceutiques anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept et, plus récemment, brolucizumab améliorent l’acuité visuelle chez environ un tiers des patients atteints de CNV ou plutôt stabilisent la vision dans 90% des cas11,12,13. Cependant, les injections intravitréennes fréquentes, souvent mensuelles, comportent un risque d’événements indésirables14, nuisent à l’observance du patient et représentent un fardeau économique important pour les systèmes de santé15. De plus, un certain pourcentage de patients (2%-20%) ne répondent pas ou ne réagissent que mal au traitement anti-VEGF16,17,18,19. Ces concomitants négatifs nécessitent le développement de traitements alternatifs, par exemple, des implants intraoculaires, des approches thérapeutiques cellulaires et/ou géniques.
La thérapie génique a évolué en tant que traitement prometteur pour les maladies héréditaires et non héréditaires et vise à restaurer les séquences de gènes non fonctionnelles ou à supprimer celles qui ont mal fonctionné. Pour les maladies polygéniques, où l’identification et le remplacement des facteurs de causalité sont difficilement possibles, les stratégies visent l’administration continue d’un facteur de protection. Dans le cas de la DMLA, diverses thérapies additives ont été développées, telles que l’expression stable de l’endostatine et de l’angiostatine20, l’antagoniste du VEGF soluble de la tyrosine kinase-1 (sFLT-1)21,22, le groupe de protéines régulatrices du complément de différenciation 59 (CD59)23 ou PEDF 24,25 . L’œil, et en particulier la rétine, est une excellente cible pour un médicament à base de gènes en raison de sa structure fermée, de sa bonne accessibilité, de sa petite taille et de son privilège immunitaire, permettant ainsi une administration localisée de faibles doses thérapeutiques et rendant les greffes moins sensibles au rejet. De plus, l’œil permet une surveillance non invasive et la rétine peut être examinée par différentes techniques d’imagerie.
Les vecteurs viraux sont, en raison de leur grande efficacité de transduction, le principal véhicule pour délivrer des gènes thérapeutiques dans les cellules cibles. Cependant, selon le vecteur viral utilisé, différents effets indésirables ont été décrits, tels que les réponses immunitaires et inflammatoires26, les effets mutagènes et oncogènes 27,28, ou la dissémination dans d’autres tissus29. Les limitations pratiques comprennent une taille d’emballage restreinte30 ainsi que des difficultés et des coûts associés à la production de lots de qualité clinique31,32. Ces inconvénients ont favorisé le développement de vecteurs plasmidiques non viraux qui sont transférés via des lipo / polyplexes, des ultrasons ou des électroporations. Cependant, l’intégration génomique du transgène dans le génome de l’hôte n’est généralement pas favorisée avec les vecteurs plasmidiques, ce qui entraîne une expression transitoire.
Les transposons sont des fragments d’ADN naturels qui changent de position dans le génome, une caractéristique qui a été adoptée pour la thérapie génique. Grâce à un mécanisme d’intégration actif, les systèmes vectoriels basés sur les transposons permettent une expression continue et constante du transgène inséré. Le transposon de la Belle au bois dormant (SB), reconstitué à partir d’un ancien transposon de type Tc1/marin trouvé chez les poissons33 et encore amélioré par l’évolution moléculaire aboutissant à la variante hyperactive SB100X34, a permis une transposition efficace dans diverses cellules primaires et a été utilisé pour la correction phénotypique dans différents modèles de maladie35. À l’heure actuelle, 13 essais cliniques ont été lancés à l’aide du système de transposons SB . Le système de transposons SB100X se compose de deux composants: le transposon, qui comprend le gène d’intérêt flanqué de répétitions inversées terminales (TIR), et la transposase, qui mobilise le transposon. Après l’administration de l’ADN plasmidique aux cellules, la transposase lie les TIR et catalyse l’excision et l’intégration du transposon dans le génome de la cellule.
Nous avons développé une thérapie additive non virale à base de cellules pour le traitement de la DMLA néovasculaire. L’approche comprend l’insertion par électroporation du gène PEDF dans les cellules épithéliales pigmentaires primaires (PE) au moyen du système de transposons SB100X 36,37,38. L’information génétique de la transposase et de la PEDF est fournie sur des plasmides séparés, permettant ainsi l’ajustement du rapport transposon SB100X / PEDF idéal. L’électroporation est réalisée à l’aide d’un système de transfection capillaire à pipette qui se caractérise par une taille d’espace maximisée entre les électrodes tout en minimisant leur surface. Il a été démontré que le dispositif atteignait d’excellents taux de transfection dans un large éventail de cellules de mammifères 39,40,41. La petite surface de l’électrode fournit un champ électrique uniforme et réduit les différents effets secondaires de l’électrolyse42.
La fonctionnalité anti-angiogénique de la PEDF sécrétée par les cellules épithéliales pigmentaires transfectées a été démontrée dans diverses expériences in vitro analysant la germination, la migration et l’apoptose des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine43. De plus, la transplantation de cellules transfectées par PEDF dans un modèle de lapin de néovascularisation cornéenne44 ainsi qu’un modèle de rat de CNV43,45,46 ont montré un déclin de la néovascularisation.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour l’insertion stable du gène PEDF dans les cellules RPE humaines primaires via le système de transposon SB100X en utilisant un système de transfection capillaire. Les cellules transfectées ont été conservées en culture pendant 21 jours, puis analysées en termes d’expression du gène PEDF par réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) et en termes de sécrétion de protéines PEDF par immunoblot et dosage immuno-enzymatique (ELISA, Figure 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

Notre société de plus en plus vieillissante entraîne une incidence croissante de maladies neurodégénératives. Jusqu’à présent, les mécanismes pathologiques sont mal compris, ce qui empêche la mise en place de traitements définis. Les thérapies géniques additives cellulaires pour l’expression accrue d’un facteur de protection sont considérées comme une option prometteuse pour traiter les maladies neurodégénératives, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Nous avons développé une méthode pour l’expression stable du gène codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF), qui est caractérisé comme une protéine neuroprotectrice et anti-angiogénique dans le système nerveux, dans le génome des cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires (PE) en utilisant le système de transposon de la Belle au bois dormant (SB). Les cellules PE primaires ont été isolées des yeux de donneurs humains et maintenues en culture. Après avoir atteint la confluence, 1 x 104 cellules ont été suspendues dans 11 μL de tampon de remise en suspension et combinées avec 2 μL d’une solution purifiée contenant 30 ng de plasmide transposase SB hyperactif (SB100X) et 470 ng de plasmide de transposon PEDF . La modification génétique a été réalisée avec un système d’électroporation capillaire utilisant les paramètres suivants: deux impulsions d’une tension de 1 100 V et d’une largeur de 20 ms. Les cellules transfectées ont été transférées dans des plaques de culture contenant un milieu complété par du sérum fœtal bovin; Des antibiotiques et des antimycotiques ont été ajoutés avec le premier échange de milieu. Une transfection réussie a été démontrée dans des expériences réalisées indépendamment. La réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) a montré l’expression accrue du transgène PEDF . La sécrétion de PEDF était significativement élevée et restait stable, telle qu’évaluée par immunoblotting, et quantifiée par dosage immuno-enzymatique (ELISA). Le transfert médié par SB100X a permis une intégration stable du gène PEDF dans le génome des cellules PE et a assuré la sécrétion continue de PEDF , ce qui est essentiel pour le développement d’une thérapie génique à base de cellules pour traiter la DMLA ou d’autres maladies dégénératives de la rétine. De plus, l’analyse du profil d’intégration du transposon PEDF dans les cellules PE humaines a indiqué une distribution génomique presque aléatoire.

Culture et électroporation de cellules EPR humaines primaires Nous avons montré que l’ensemencement d’un nombre suffisant de cellules primaires EPR d’origine animale permet la culture et la croissance vers une monocouche intégrée de cellules pigmentées de forme hexagonale36,37,48. Leur capacité à former des jonctions serrées, à présenter une activité phagocyta...

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Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Nous avons développé un protocole pour transfecter les cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires par électroporation avec le gène codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) à l’aide du système de transposon de la Belle au bois dormant (SB). La réussite de la transfection a été démontrée par la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR), l’immunoblot et le dosage immuno-enzymatique (ELISA).

Modification génétique basée sur l’électroporation de cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires à l’aide du système de transposon de la Belle au bois dormant

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Cette méthode démontre la transfection basée sur l’électroporation de cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires à l’aide du système Sleeping Beauty Transposon, une preuve de l’expression transgénique et de la sécrétion de protéines. La combinaison du système de transposon de la Belle au bois dormant et de l’électroporation permet une transfection efficace des cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires, ainsi qu’une expression transgénique stable et persistante et une sécrétion de protéines. L’objectif global est d’établir une thérapie génique d’addition cellulaire pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine, qui nécessite une sécrétion stable et persistante de la protéine thérapeutiquement active.Anne Freialdenhoven et Antje Schiefer, assistantes techniques médicales du laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour préparer l’ADN plasmidique pour l’électroporation primaire des cellules EPR humaines, utilisez un spectrophotomètre de microvolume pour quantifier le contenu de l’ADN plasmidique et ajustez la concentration à 250 nanogrammes par microlitre dans 10 millimolaires de Tris-HCL. Mélanger un volume de 250 nanogrammes par microlitre d’ADN plasmidique transposase SB100X avec 16 volumes de 250 nanogrammes par microlitre d’ADN plasmidique dérivé de l’épithélium pigmentaire.Ajouter deux microlitres du mélange de plasma résultant dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 millilitres à verrouillage sûr sur glace et remplir un tube tampon avec trois millilitres de tampon E.Insérez ensuite le tube dans la station de pipette jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre et réglez le dispositif de transfection sur 1 100 volts, une largeur d’impulsion de 20 millisecondes et deux impulsions. Préparer les cellules à l’électroporation. Tout d’abord, vérifiez la morphologie des cultures primaires de cellules EPR par microscopie à contraste de phase pour évaluer leur croissance et leur confluence.Traiter les cellules avec 500 microlitres de 0,05% de trypsine EDTA par puits pendant sept à 15 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules se sont détachées, collectez les cellules par centrifugation, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de PBS et centrifugez une à 10 fois 10 à quatre aliquotes cellulaires par réaction de transfection. Remettez les pastilles en suspension dans 11 microlitres de tampon R par tube et ajoutez deux microlitres du mélange plasmidique préparé dans chaque tube.Insérez la tête d’une pipette de transfection dans une pointe de transfection de 10 microlitres jusqu’à ce que la pince capte complètement la tige de montage du piston et charge la cellule et la solution plasmidique dans l’embout de transfection. Insérez la pipette de transfection dans le tube tampon placé à l’intérieur de la station de pipette jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre et appuyez sur Démarrer pour commencer le processus d’électroporation. Après la transfection, retirez soigneusement la pipette de transfection de la station de pipette et pipette immédiatement la solution cellulaire et plasmidique dans les puits préparés de la plaque de culture cellulaire.Pour purifier les protéines de fusion de facteurs dérivés de l’épithélium pigmentaire marqué à partir de surnageants de culture cellulaire RPE. Tout d’abord, utilisez une pointe de coupe conique pour recueillir une aliquote de 30 microlitres de suspension de nickel NTA par échantillon et enduisez la résine de nickel NTA par centrifugation. Remettez soigneusement en suspension la résine de nickel NTA avec 200 microlitres de tampon d’incubation One X et granulez la solution avec une centrifugation supplémentaire deux fois.Après la deuxième centrifugation, remettre soigneusement en suspension les pastilles de résine de nickel NTA avec 40 microlitres de tampon d’incubation Four X par échantillon. Mélangez ensuite 55 microlitres d’une aliquote de suspension de nickel NTA prétraitée avec 260 microlitres de tampon d’incubation Four X et 900 microlitres de chaque surnageant de culture cellulaire RPE transefcté. Incuber le mélange sur un agitateur à bascule à température ambiante pendant 60 minutes et enduire à nouveau les mélanges de résine de nickel NTA.Remettez soigneusement les granulés en suspension dans 175 microlitres de tampon d’incubation One X et centrifugez les mélanges deux fois de plus. Après la deuxième centrifugation, remettre soigneusement en suspension les pastilles de résine de nickel NTA dans 30 microlitres de tampon Elution pour une incubation de 20 minutes à température ambiante en agitant et centrifuger à nouveau les échantillons. Ensuite, collectez soigneusement les surnageants et mélangez-les avec un tampon d’échantillon Two X SDS pour l’analyse sanguine occidentale des protéines purifiées.Les cellules EPR primaires cultivées isolées à partir d’yeux de donneurs humains présentent une morphologie pavée typique, quel que soit l’âge du donneur, la période d’isolement post-mortem ou la période de culture. L’application d’impulsions électriques à court terme aux cellules RPE humaines primaires. L’utilisation du système de transfection capillaire n’affecte pas négativement la morphologie épithéliale.L’analyse sanguine occidentale de surnageants de cultures cellulaires EPR humaines primaires transfectées démontre la sécrétion de facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire à des niveaux constants sans silençage transgénique pendant plus de 500 jours. Comme observé dans cette analyse sanguine occidentale représentative du milieu de culture cellulaire à partir de transfections effectuées en série, un taux de sécrétion de facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire universellement plus élevé est observé 21 jours après la transfection. Dans une culture poursuivie, une sécrétion élevée de PEDF à long terme dure au moins 165 jours.En outre, la quantification basée sur ELISA révèle une multiplication par 20 de la sécrétion de facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire total dans les cellules RPE humaines primaires transfectées par rapport aux cellules témoins non transfectées respectives. Cet accroissement a également été confirmé au niveau de l’expression génique auquel l’expression totale de PEDF a été multipliée par plus de 30. Lors de la tentative de ce protocole, il est important d’utiliser des cellules épithéliales pigmentaires dont la morphologie correspond au statut In Vivo.N’oubliez pas non plus d’aspirer la solution cellulaire dans l’embout de transfection sans bulles d’air. Les cellules transfectées de manière stable peuvent être utilisées dans différents modèles Ex Vivo ou In vivo pour vérifier la fonctionnalité de cette thérapie génique basée sur l’addition cellulaire.

Research

JoVE Journal

Medicine

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