Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch das Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Union für Forschung, technologische Entwicklung und Demonstration, Finanzhilfevereinbarung Nr. 305134, unterstützt. Zsuzsanna Izsvák wurde vom Europäischen Forschungsrat ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742) gefördert. Die Autoren danken Anna Dobias und Antje Schiefer (Augenklinik, Universitätsklinikum RWTH Aachen) für die hervorragende fachliche Unterstützung sowie der Aachener Hornhautbank (Augenklinik, Universitätsklinikum RWTH Aachen) für die Bereitstellung der menschlichen Spenderaugen.

Humane Spenderaugen wurden von der Aachener Hornhautbank der Augenklinik (Universitätsklinikum RWTH Aachen) nach Einholung der Einverständniserklärung gemäß den Protokollen der Deklaration von Helsinki bezogen. Die Verfahren für die Entnahme und Verwendung von Humanproben wurden von der institutionellen Ethikkommission genehmigt.
1. Isolierung primärer humaner RPE-Zellen
<ol><li>Legen Sie sterile Schutzkleidung und Handschuhe aus. Legen Sie einen sterilen Vorhang unter eine laminare S...

In unserem Projekt streben wir die nicht-virale Produktion von gentechnisch veränderten primären humanen RPE-Zellen an, die kontinuierlich einen wirksamen Faktor überexprimieren und sezernieren, um die transfizierten Zellen als Langzeittherapeutikum für die Etablierung und Aufrechterhaltung einer schützenden Umgebung zu nutzen. Wir haben die Einführung des Gens etabliert, das für PEDF kodiert, ein ubiquitär exprimiertes multifunktionales Protein mit antiangiogenen und neuroprotektiven Funktionen. Das hier beschri...

Das fortgeschrittene Alter wird als Hauptrisiko für neurodegenerative Erkrankungen beschrieben. Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), eine polygene Erkrankung, die bei Patienten über 60 Jahren zu schwerem Sehverlust führt, gehört zu den vier häufigsten Ursachen für Erblindung und Sehbehinderung1 und wird voraussichtlich bis 2040 auf 288 Millionen Menschen ansteigen2. Funktionsstörungen des retinalen Pigmentepithels (RPE), einer einzigen Schicht dicht gepackter Zellen zwischen der Choriokapillare und den retinalen Photorezeptoren, tragen zur Pathogenese der AMD bei. Das RPE erfüllt mehrere Aufgaben, die für eine normale Netzhautfunktion unerlässlich sind3 und sondert eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Faktoren ab, die für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Netzhaut und der Choriokapillaris unerlässlich sind, wodurch das Überleben der Photorezeptoren unterstützt und eine Grundlage für die Zirkulation und die Versorgung mit Nährstoffen geschaffen wird.
In gesunden Augen ist der Pigmentepithel-abgeleitete Faktor (PEDF) dafür verantwortlich, die Auswirkungen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) auszugleichen und Neuronen vor Apoptose zu schützen, die Proliferation von Endothelzellen zu verhindern und das kapillare Endothel zu stabilisieren. Ein verschobenes VEGF-zu-PEDF-Verhältnis hängt mit der okulären Neovaskularisation zusammen, die in Tiermodellen4,5 sowie in Proben von Patienten mit choroidaler Neovaskularisation (CNV) aufgrund von AMD und proliferativer diabetischer Retinopathie beobachtet wurde 6,7,8,9,10 . Die erhöhte VEGF-Konzentration ist das Ziel für die aktuelle Standardbehandlung. Die Anti-VEGF-Medikamente Bevacizumab, Ranibizumab, Aflibercept und neuerdings Brolucizumab verbessern bei etwa einem Drittel der CNV-Patienten die Sehschärfe bzw. stabilisieren das Sehvermögen in 90% der Fälle11,12,13. Die häufigen, oft monatlichen intravitrealen Injektionen bergen jedoch das Risiko unerwünschter Ereignisse14, beeinträchtigen die Compliance der Patienten und stellen eine erhebliche wirtschaftliche Belastung für die Gesundheitssysteme dar15. Darüber hinaus spricht ein gewisser Prozentsatz der Patienten (2%-20%) nicht oder nur schlecht auf die Anti-VEGF-Therapiean 16,17,18,19. Diese negativen Begleiterscheinungen erfordern die Entwicklung alternativer Therapien, z.B. intraokularer Implantate, zell- und/oder gentherapeutischer Ansätze.
Die Gentherapie hat sich zu einer vielversprechenden Behandlung für erbliche und nicht-erbliche Krankheiten entwickelt und zielt darauf ab, nicht funktionsfähige Gensequenzen wiederherzustellen oder Fehlfunktionen zu unterdrücken. Bei polygenen Erkrankungen, bei denen die Identifizierung und der Ersatz der ursächlichen Faktoren kaum möglich ist, zielen Strategien auf die kontinuierliche Bereitstellung eines Schutzfaktors ab. Im Fall der AMD wurden verschiedene additive Therapien entwickelt, wie die stabile Expression von Endostatin und Angiostatin 20, der VEGF-Antagonist lösliche fms-ähnliche Tyrosinkinase-1 (sFLT-1)21,22, der komplementregulatorische Proteincluster der Differenzierung 59 (CD59)23 oder PEDF 24,25 . Das Auge und insbesondere die Netzhaut sind aufgrund der geschlossenen Struktur, der guten Zugänglichkeit, der geringen Größe und des Immunprivilegs ein ausgezeichnetes Ziel für eine genbasierte Medikation, wodurch eine lokalisierte Abgabe niedriger therapeutischer Dosen ermöglicht wird und Transplantate weniger anfällig für Abstoßungen werden. Darüber hinaus ermöglicht das Auge eine nicht-invasive Überwachung und die Netzhaut kann mit verschiedenen bildgebenden Verfahren untersucht werden.
Virale Vektoren sind aufgrund ihrer hohen Transduktionseffizienz das Hauptvehikel, um therapeutische Gene in Zielzellen zu bringen. Je nach verwendetem viralen Vektor wurden jedoch unterschiedliche Nebenwirkungen beschrieben, wie Immun- und Entzündungsreaktionen26, mutagene und onkogene Wirkungen 27,28 oder Verbreitung in anderen Geweben29. Zu den praktischen Einschränkungen gehören eine begrenzte Verpackungsgröße30 sowie Schwierigkeiten und Kosten im Zusammenhang mit der Herstellung von klinischen Chargen31,32. Diese Nachteile haben die Weiterentwicklung nicht-viraler, plasmidbasierter Vektoren gefördert, die über Lipo-/Polyplexe, Ultraschall oder Elektroporation übertragen werden. Die genomische Integration des Transgens in das Wirtsgenom wird jedoch in der Regel nicht mit Plasmidvektoren gefördert, was zu einer vorübergehenden Expression führt.
Transposons sind natürlich vorkommende DNA-Fragmente, die ihre Position innerhalb des Genoms ändern, eine Eigenschaft, die für die Gentherapie übernommen wurde. Aufgrund eines aktiven Integrationsmechanismus ermöglichen transposonbasierte Vektorsysteme eine kontinuierliche und konstante Expression des eingefügten Transgens. Das Dornröschen-Transposon (SB), rekonstituiert aus einem alten Transposon vom Typ Tc1/Mariner, das in Fisch33 gefunden und durch molekulare Evolution weiter verbessert wurde, was zur hyperaktiven Variante SB100X34 führte, ermöglichte eine effiziente Transposition in verschiedenen Primärzellen und wurde für die phänotypische Korrektur in verschiedenen Krankheitsmodellenverwendet 35. Derzeit wurden 13 klinische Studien mit dem SB-Transposon-System gestartet. Das SB100X-Transposon-System besteht aus zwei Komponenten: dem Transposon, das das interessierende Gen umfasst, flankiert von terminalen invertierten Wiederholungen (TIR), und der Transposase, die das Transposon mobilisiert. Nach der Lieferung von Plasmid-DNA an die Zellen bindet die Transposase die TIRs und katalysiert die Exzision und Integration des Transposons in das Genom der Zelle.
Wir haben eine nicht-virale zellbasierte additive Therapie zur Behandlung der neovaskulären AMD entwickelt. Der Ansatz umfasst die elektroporationsbasierte Insertion des PEDF-Gens in primäre Pigmentepithelzellen (PE) mittels des SB100X-Transposonsystems 36,37,38. Die genetische Information von Transposase und PEDF wird auf separaten Plasmiden bereitgestellt, wodurch die Einstellung des idealen SB100X-zu-PEDF-Transposon-Verhältnisses ermöglicht wird. Die Elektroporation wird mit einem pipettenbasierten Kapillartransfektionssystem durchgeführt, das sich durch eine maximale Spaltgröße zwischen den Elektroden bei gleichzeitiger Minimierung ihrer Oberfläche auszeichnet. Es wurde gezeigt, dass das Gerät hervorragende Transfektionsraten in einem breiten Spektrum von Säugetierzellenerreicht 39,40,41. Die kleine Elektrodenoberfläche sorgt für ein gleichmäßiges elektrisches Feld und reduziert die verschiedenen Nebenwirkungen der Elektrolyse42.
Die antiangiogene Funktionalität von PEDF, das von transfizierten Pigmentepithelzellen sezerniert wird, wurde in verschiedenen In-vitro-Experimenten gezeigt, in denen das Keimen, die Migration und die Apoptose menschlicher Nabelvenendothelzellen analysiertwurden 43. Darüber hinaus zeigte die Transplantation von PEDF-transfizierten Zellen in einem Kaninchenmodell der Hornhautneovaskularisation44 sowie einem Rattenmodell von CNV43,45,46 einen Rückgang der Neovaskularisation.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die stabile Insertion des PEDF-Gens in primäre menschliche RPE-Zellen über das SB100X-Transposonsystem unter Verwendung eines Kapillartransfektionssystems. Die transfizierten Zellen wurden 21 Tage in Kultur gehalten und anschließend hinsichtlich der PEDF-Genexpression durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und hinsichtlich der PEDF-Proteinsekretion durch Immunoblotting und enzymgebundenen Immunassay analysiert (ELISA, Abbildung 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

Unsere zunehmend alternde Gesellschaft führt zu einer zunehmenden Inzidenz neurodegenerativer Erkrankungen. Bisher sind die pathologischen Mechanismen nur unzureichend verstanden, was die Etablierung definierter Therapien erschwert. Zellbasierte additive Gentherapien zur erhöhten Expression eines Schutzfaktors gelten als vielversprechende Option zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie der altersbedingten Makuladegeneration (AMD). Wir haben eine Methode zur stabilen Expression des Gens entwickelt, das für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) kodiert, der als neuroprotektives und antiangiogenes Protein im Nervensystem charakterisiert wird, in das Genom primärer humaner Pigmentepithelzellen (PE) unter Verwendung des Dornröschen-Transposon-Systems. Primäre PE-Zellen wurden aus menschlichen Spenderaugen isoliert und in Kultur gehalten. Nach Erreichen des Zusammenflusses wurden 1 x 104 Zellen in 11 μL Resuspensionspuffer suspendiert und mit 2 μL einer gereinigten Lösung kombiniert, die 30 ng hyperaktives SB (SB100X) Transposase-Plasmid und 470 ng PEDF-Transposon-Plasmid enthielt. Die genetische Veränderung erfolgte mit einem Kapillarelektroporationssystem unter Verwendung folgender Parameter: zwei Impulse mit einer Spannung von 1.100 V und einer Breite von 20 ms. Transfizierte Zellen wurden in Kulturplatten überführt, die ein mit fetalem Rinderserum ergänztes Medium enthielten; Antibiotika und Antimykotika wurden mit dem ersten Medienaustausch hinzugefügt. Die erfolgreiche Transfektion wurde in unabhängig durchgeführten Experimenten nachgewiesen. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zeigte die erhöhte Expression des PEDF-Transgens. Die PEDF-Sekretion war signifikant erhöht und blieb stabil, wie durch Immunoblotting bewertet und durch Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) quantifiziert. Der SB100X-vermittelte Transfer ermöglichte eine stabile PEDF-Genintegration in das Genom von PE-Zellen und stellte die kontinuierliche Sekretion von PEDF sicher, was für die Entwicklung einer zellbasierten Genadditionstherapie zur Behandlung von AMD oder anderen degenerativen Netzhauterkrankungen entscheidend ist. Darüber hinaus zeigte die Analyse des Integrationsprofils des PEDF-Transposons in menschliche PE-Zellen eine fast zufällige genomische Verteilung.

Kultivierung und Elektroporation primärer humaner RPE-Zellen Wir haben gezeigt, dass die Aussaat einer ausreichenden Anzahl von primären RPE-Zellen tierischen Ursprungs die Kultivierung und das Wachstum zu einer integrierten Monoschicht pigmentierter, hexagonal geformter Zellenermöglicht 36,37,48. Ihre Fähigkeit, Tight Junctions zu bilden, phagozytische Aktivität zu zeige...

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Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Wir haben ein Protokoll entwickelt, um primäre menschliche Pigmentepithelzellen durch Elektroporation mit dem Gen, das für den Pigmentepithel-abgeleiteten Faktor (PEDF) kodiert, unter Verwendung des Sleeping Beauty (SB) Transposon-Systems zu transfizieren. Die erfolgreiche Transfektion wurde durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Immunoblotting und enzymgebundenen Immunassay (ELISA) nachgewiesen.

Elektroporationsbasierte genetische Veränderung von primären menschlichen Pigmentepithelzellen mit dem Dornröschen-Transposon-System

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Diese Methode demonstriert die auf Elektroporation basierende Transfektion von primären menschlichen Pigmentepithelzellen unter Verwendung des Dornröschen-Transposon-Systems, einem Nachweis für Transgenexpression und Proteinsekretion. Die Kombination des Dornröschen-Transposon-Systems und der Elektroporation ermöglicht eine effiziente Transfektion von primären menschlichen Pigmentepithelzellen sowie eine stabile und persistente Transgenexpression und Proteinsekretion. Übergeordnetes Ziel ist es, eine zellbasierte Genadditionstherapie zur Behandlung degenerativer Netzhauterkrankungen zu etablieren, die eine stabile und persistente Sekretion des therapeutisch aktiven Proteins voraussetzt.Anne Freialdenhoven und Antje Schiefer, medizinisch-technische Assistentinnen aus dem Labor, demonstrieren das Verfahren. Um Plasmid-DNA für die primäre humane RPE-Zellelektroporation vorzubereiten, verwenden Sie ein Mikrovolumen-Spektralphotometer, um den Plasmid-DNA-Gehalt zu quantifizieren, und passen Sie die Konzentration auf 250 Nanogramm pro Mikroliter in 10 Millimolar Tris-HCL an. Mischen Sie ein Volumen von 250 Nanogramm pro Mikroliter SB100X-Transposase-Plasmid-DNA mit 16 Volumen von 250 Nanogramm pro Mikroliter Pigmentepithel-abgeleiteter Faktor Transposon-Plasmid-DNA.Fügen Sie zwei Mikroliter der resultierenden Plasmamischung in ein steriles 1,5 Milliliter sicheres Schleusen-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und füllen Sie ein Pufferrohr mit drei Milliliter Puffer E.Führen Sie dann das Röhrchen in die Pipettenstation ein, bis ein Klicken zu hören ist, und stellen Sie die Transfektionsvorrichtung auf 1.100 Volt, eine Pulsbreite von 20 Millisekunden und zwei Impulse ein. Um die Zellen für die Elektroporation vorzubereiten. Überprüfen Sie zunächst die Morphologie der primären RPE-Zellkulturen mittels Phasenkontrastmikroskopie, um deren Wachstum und Konfluenz zu beurteilen.Behandeln Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 0,05% Trypsin EDTA pro Vertiefung für sieben bis 15 Minuten im Zellkulturinkubator. Wenn sich die Zellen gelöst haben, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter PBS und zentrifugieren Sie ein bis 10 mal 10 zu den vier Zellaliquoten pro Transfektionsreaktion. Resuspendieren Sie die Pellets in 11 Mikroliter Puffer R pro Röhrchen und fügen Sie jedem Röhrchen zwei Mikroliter der vorbereiteten Plasmidmischung hinzu.Führen Sie den Kopf einer Transfektionspipette in eine 10-Mikroliter-Transfektionsspitze ein, bis die Klemme den Montageschaft des Kolbens vollständig aufnimmt, und laden Sie die Zelle und die Plasmidlösung in die Transfektionsspitze. Führen Sie die Transfektionspipette in das Pufferrohr innerhalb der Pipettenstation ein, bis ein Klicken zu hören ist, und drücken Sie Start, um den Elektroporationsvorgang zu starten. Nach der Transfektion vorsichtig die Transfektionspipette aus der Pipettenstation entfernen und sofort die Zell- und Plasmidlösung in die vorbereiteten Vertiefungen der Zellkulturplatte pipettieren.Zur Reinigung seiner markierten Pigmentepithel-Faktor-Fusionsproteine aus RPE-Zellkulturüberständen. Verwenden Sie zunächst eine abgeschrägte Schnittspitze, um einen 30-Mikroliter-Aliquot Nickel-NTA-Schlamm pro Probe zu sammeln und das Nickel-NTA-Harz durch Zentrifugation zu pelletieren. Resuspendieren Sie das Nickel-NTA-Harz vorsichtig mit 200 Mikrolitern One X-Inkubationspuffer und pelletieren Sie die Lösung zweimal mit einer zusätzlichen Zentrifugation.Nach der zweiten Zentrifugation werden die Nickel-NTA-Harzpellets vorsichtig mit 40 Mikrolitern Four X-Inkubationspuffer pro Probe resuspendiert. Als nächstes mischen Sie 55 Mikroliter eines Aliquots vorbehandelter Nickel-NTA-Aufschlämmung mit 260 Mikrolitern Four X-Inkubationspuffer und 900 Mikrolitern jedes transefcted RPE-Zellkulturüberstands. Die Mischung auf einem Schaukelschüttler bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubieren und die Nickel-NTA-Harzmischungen erneut pelletieren.Die Pellets in 175 Mikroliter One X Inkubationspuffer vorsichtig resuspendieren und die Mischungen zwei weitere Male zentrifugieren. Nach der zweiten Zentrifugation die Nickel-NTA-Harzpellets in 30 Mikroliter Elution-Puffer für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln vorsichtig resuspendieren und die Proben erneut zentrifugieren. Dann sammeln Sie die Überstände sorgfältig und mischen Sie sie mit Two X SDS Probenpuffer für die westliche Blutanalyse der gereinigten Proteine.Kultivierte primäre RPE-Zellen, die aus menschlichen Spenderaugen isoliert wurden, zeigen eine typische Kopfsteinpflastermorphologie, unabhängig vom Alter des Spenders, dem postmortalen Zeitpunkt der Isolierung oder dem Zeitpunkt der Kultivierung. Die Anwendung von kurzfristigen elektrischen Impulsen auf primäre menschliche RPE-Zellen. Die Verwendung des Kapillartransfektionssystems beeinträchtigt die Epithelmorphologie nicht.Westliche Blutanalysen von transfizierten primären humanen RPE-Zellkulturüberständen zeigen eine Sekretion von Pigmentepithel-abgeleiteten Faktoren in konsistenten Konzentrationen ohne Transgen-Silencing für mehr als 500 Tage. Wie in dieser repräsentativen westlichen Blutanalyse von Zellkulturmedium aus seriell durchgeführten Transfektionen beobachtet, wird 21 Tage nach der Transfektion eine universell höhere Sekretionsrate des Pigmentepithelsfaktors beobachtet. In einer verfolgten Kultur hält eine langfristig erhöhte PEDF-Sekretion mindestens 165 Tage an.Darüber hinaus zeigt die ELISA-basierte Quantifizierung einen 20-fachen Anstieg der gesamten Sekretion des Pigmentepithels-abgeleiteten Faktors in transfizierten primären menschlichen RPE-Zellen im Vergleich zu entsprechenden nicht transfizierten Kontrollzellen. Dieser Zuwachs wurde auch auf der Genexpressionsebene bestätigt, bei der die gesamte PEDF-Expression um mehr als das 30-fache erhöht wurde. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, Pigmentepithelzellen zu verwenden, deren Morphologie dem In-vivo-Status entspricht.Denken Sie auch daran, die Zelllösung ohne Luftblasen in die Transfektionsspitze zu ziehen. Die stabil transfizierten Zellen können in verschiedenen Ex Vivo oder In vivo Modellen verwendet werden, um die Funktionalität dieser zellbasierten Genadditionstherapie zu verifizieren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Haut Stanzbiopsie Explantatkultur für die Ableitung des primären humanen Fibroblasten

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Forschung

Medizin

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Identifizierung von<em&gt; Dornröschen</em&gt; Transposon Insertionen in Solid Tumors mit Linker-vermittelte PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

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Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

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Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer

Messung von Carotinoiden in Perifovea mit dem Makulapigmentreflekometer

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