Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי והדגמה, הסכם מענקים מס' 305134. Zsuzsanna Izsvák מומן על ידי מועצת המחקר האירופית, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). המחברים רוצים להודות לאנה דוביאס ואנטג'ה שייפר (המחלקה לרפואת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי RWTH Aachen) על התמיכה הטכנית המצוינת, ולבנק הקרנית של אאכן (המחלקה לרפואת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי RWTH Aachen) על מתן עיני התורם האנושי.

עיני התורם האנושי התקבלו מבנק אאכן קורניאה של המחלקה לרפואת עיניים (בית החולים האוניברסיטאי RWTH Aachen) לאחר קבלת הסכמה מדעת בהתאם לפרוטוקולי הצהרת הלסינקי. נהלים לאיסוף דגימות אנושיות ולשימוש בהן אושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית.
1. בידוד של תאי RPE אנושיים ראשוניים
<ol><li>פרשו ב?...

בפרויקט שלנו, אנו שואפים לייצור לא ויראלי של תאי RPE אנושיים ראשוניים מהונדסים גנטית, אשר מבטאים יתר על המידה ומפרישים ללא הרף גורם יעיל על מנת להשתמש בתאים המועתקים כטיפול ארוך טווח להקמה ותחזוקה של סביבה מגוננת. ביססנו את ההקדמה של הגן המקודד PEDF, חלבון רב-תפקודי המתבטא בכל מקום עם פונקציות...

גיל מתקדם מתואר כסיכון העיקרי למחלות נוירודגנרטיביות. ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), מחלה פוליגנית המובילה לאובדן ראייה חמור בחולים מעל גיל 60, שייך לארבעת הגורמים השכיחים ביותר לעיוורון ולפגיעה בראייה1 וצפוי לעלות ל -288 מיליון איש בשנת 20402. תפקוד לקוי של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), שכבה אחת של תאים ארוזים היטב הממוקם בין choriocapillaris לבין photoreceptors הרשתית, לתרום פתוגנזה של AMD. ה- RPE ממלא משימות מרובות החיוניות לתפקוד רשתית תקין3 ומפריש מגוון גורמי גדילה וגורמים חיוניים לשמירה על השלמות המבנית של הרשתית והכוריוקפילריס, ובכך תומך בהישרדות הפוטורצפטור ומספק בסיס למחזור הדם ולאספקת חומרים מזינים.
בעיניים בריאות, גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) אחראי לאיזון ההשפעות של גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) ומגן על תאי עצב מפני אפופטוזיס, מונע שגשוג תאי אנדותל ומייצב את האנדותל הנימי. יחס VEGF-to-PEDF קשור לניאו-וסקולריזציה של העין, אשר נצפתה במודלים של בעלי חיים 4,5 וכן בדגימות של חולים עם ניאו-וסקולריזציה כורואידלית (CNV) עקב AMD ורטינופתיה סוכרתית שגשוג 6,7,8,9,10 . ריכוז ה-VEGF המשופר הוא היעד לטיפול הסטנדרטי הנוכחי. התרופות נגד VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept ולאחרונה, brolucizumab לשפר את חדות הראייה בכשליש מחולי CNV או ליתר דיוק לייצב את הראייה ב 90% מהמקרים11,12,13. עם זאת, הזריקות התוך-גופיות התכופות, לעתים קרובות חודשיות, נושאות בסיכון לתופעות לוואי14, פוגעות בציות המטופלים ומהוות נטל כלכלי משמעותי על מערכות הבריאות15. יתר על כן, אחוז מסוים מהחולים (2%-20%) אינם מגיבים או רק מגיבים בצורה גרועה לטיפול נגד VEGF16,17,18,19. מקבילות שליליות אלה מחייבות פיתוח של טיפולים אלטרנטיביים, כגון שתלים תוך עיניים, גישות טיפוליות בתאים ו/או בגנים.
הריפוי הגנטי התפתח כטיפול מבטיח במחלות תורשתיות ולא תורשתיות ומתכוון לשחזר רצפי גנים לא מתפקדים או לדכא תקלות. עבור מחלות פוליגניות, שבהן זיהוי והחלפה של הגורמים הסיבתיים כמעט ואינו אפשרי, אסטרטגיות שואפות לאספקה רציפה של גורם מגן. במקרה של AMD, פותחו טיפולים מוספים שונים, כגון הביטוי היציב של אנדוסטטין ואנגיוסטטין 20, אנטגוניסט VEGF מסיס דמוי טירוזין קינאז-1 (sFLT-1)21,22, אשכול החלבון הרגולטורי המשלים של התמיינות 59 (CD59)23 או PEDF 24,25 . העין, ובמיוחד הרשתית, היא מטרה מצוינת לתרופה מבוססת גנים בשל המבנה הסגור, הנגישות הטובה, הגודל הקטן והפריבילגיה החיסונית, ובכך מאפשרת אספקה מקומית של מינונים טיפוליים נמוכים והופכת את ההשתלות לפחות רגישות לדחייה. יתר על כן, העין מאפשרת ניטור לא פולשני, וניתן לבחון את הרשתית בטכניקות הדמיה שונות.
וקטורים נגיפיים הם, בגלל יעילות ההתמרה הגבוהה שלהם, הכלי העיקרי להעברת גנים טיפוליים לתאי מטרה. עם זאת, בהתאם לווקטור הנגיפי המשמש, תוארו תגובות שליליות שונות, כגון תגובות חיסוניות ודלקתיות26, השפעות מוטגניות ואונקוגניות27,28, או הפצה ברקמות אחרות 29. המגבלות המעשיות כוללות גודל אריזה מוגבל30 וכן קשיים ועלויות הכרוכים בייצור מגרשים ברמה קלינית31,32. חסרונות אלה קידמו את המשך הפיתוח של וקטורים לא ויראליים, מבוססי פלסמיד, המועברים באמצעות ליפו-/פוליפלקסים, אולטרסאונד או אלקטרופורציה. עם זאת, אינטגרציה גנומית של הטרנסגן לתוך הגנום המארח בדרך כלל אינה מקודמת עם וקטורים פלסמידים, וכתוצאה מכך ביטוי חולף.
טרנספוזונים הם מקטעי דנ"א טבעיים המשנים את מיקומם בתוך הגנום, מאפיין שאומץ לריפוי גנטי. בשל מנגנון אינטגרציה פעיל, מערכות וקטוריות מבוססות טרנספוזון מאפשרות ביטוי רציף וקבוע של הטרנסגן המוכנס. הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB), ששוחזר מטרנספוזון עתיק מסוג Tc1/mariner שנמצא בדגים33 ושופר עוד יותר על ידי אבולוציה מולקולרית וכתוצאה מכך הגרסה ההיפראקטיבית SB100X34, אפשרה טרנספוזיציה יעילה בתאים ראשוניים שונים ושימשה לתיקון פנוטיפי במודלים שונים של מחלות35. נכון לעכשיו, 13 ניסויים קליניים החלו באמצעות מערכת טרנספוזון SB . מערכת הטרנספוזון SB100X מורכבת משני מרכיבים: הטרנספוזון, המרכיב את הגן המעניין המוקף בחזרות הפוכות סופניות (TIRs), והטרנספוזה, המגייסת את הטרנספוזון. לאחר העברת דנ"א פלסמיד לתאים, הטרנספוזאז קושר את ה-TIRs ומזרז את הכריתה והאינטגרציה של הטרנספוזון בגנום של התא.
פיתחנו תוסף שאינו מבוסס על תאים נגיפיים לטיפול ב- AMD ניאו-וסקולרי. הגישה כוללת החדרה מבוססת אלקטרופורציה של הגן PEDF לתאי אפיתל פיגמנטים ראשוניים (PE) באמצעות מערכת הטרנספוזון SB100X 36,37,38. המידע הגנטי של הטרנספוזאז וה-PEDF מסופק על פלסמידים נפרדים, ובכך מאפשר התאמה של יחס הטרנספוזון האידיאלי SB100X-to-PEDF. האלקטרופורציה מתבצעת באמצעות מערכת טרנספקציה נימית מבוססת פיפטה המאופיינת בגודל מרווח מקסימלי בין האלקטרודות תוך מזעור שטח הפנים שלהן. הודגם כי המכשיר משיג שיעורי העברה מצוינים במגוון רחב של תאי יונקים 39,40,41. שטח הפנים של האלקטרודה הקטנה מספק שדה חשמלי אחיד ומפחית את תופעות הלוואי השונות של אלקטרוליזה42.
הפונקציונליות האנטי-אנגיוגנית של PEDF המופרשת על ידי תאי אפיתל פיגמנטיים שעברו טרנספקציה הודגמה בניסויים שונים במבחנה שניתחו את ההנבטה, הנדידה והאפופטוזיס של תאי אנדותל וורידי הטבור האנושיים43. בנוסף, השתלת תאים שעברו טרנספקציה של PEDF במודל ארנב של ניאו-וסקולריזציה של הקרנית44 וכן מודל חולדות שלCNV 43,45,46 הראו ירידה של ניאו-וסקולריזציה.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להחדרה יציבה של הגן PEDF לתאי RPE אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת טרנספוזון SB100X באמצעות מערכת טרנספקציה נימרית. התאים שעברו טרנספקציה נשמרו בתרבית במשך 21 יום ולאחר מכן נותחו במונחים של ביטוי גנים של PEDF על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ובמונחים של הפרשת חלבון PEDF על ידי אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA, איור 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

החברה המזדקנת יותר ויותר שלנו מובילה לשכיחות גוברת של מחלות נוירודגנרטיביות. עד כה, המנגנונים הפתולוגיים אינם מובנים כראוי, ובכך מעכבים את כינונתם של טיפולים מוגדרים. טיפולים גנטיים מוספים מבוססי תאים לביטוי מוגבר של גורם מגן נחשבים כאופציה מבטיחה לטיפול תרופתי במחלות נוירודגנרטיביות, כגון ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD). פיתחנו שיטה לביטוי יציב של הגורם הנגזר מאפיתל פיגמנטי (PEDF), המאופיין כחלבון נוירו-פרוטקטיבי ואנטי-אנגיוגני במערכת העצבים, לתוך הגנום של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים (PE) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). תאי PE ראשוניים בודדו מעיני תורמים אנושיים ונשמרו בתרבית. לאחר שהגיעו למפגש, 1 x 104 תאים הושעו ב-11 μL של מאגר resuspension ובשילוב עם 2 μL של תמיסה מטוהרת המכילה 30 ננוגרם של פלסמיד טרנספוזן היפראקטיבי (SB100X) ו-470 ננוגרם של פלסמיד טרנספוזון PEDF. השינוי הגנטי בוצע עם מערכת אלקטרופורציה נימית באמצעות הפרמטרים הבאים: שתי פולסים עם מתח של 1,100 V ורוחב של 20 ms. תאים שעברו טרנספקציה הועברו לצלחות תרבית המכילות תוסף בינוני עם סרום בקר עוברי; אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטיקה נוספו עם חילופי המדיום הראשונים. העברה מוצלחת הודגמה בניסויים שבוצעו באופן עצמאי. תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) הראתה את הביטוי המוגבר של טרנסגן PEDF. הפרשת ה-PEDF הייתה גבוהה באופן משמעותי ונותרה יציבה, כפי שהוערך על ידי אימונובלוטציה, וכומתה על ידי בדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA). העברה בתיווך SB100X אפשרה אינטגרציה יציבה של גן PEDF בגנום של תאי PE והבטיחה הפרשה מתמשכת של PEDF, שהיא קריטית לפיתוח טיפול תוספת גנים מבוסס תאים לטיפול ב- AMD או במחלות ניווניות אחרות ברשתית. יתר על כן, ניתוח פרופיל האינטגרציה של טרנספוזון PEDF לתאי PE אנושיים הצביע על התפלגות גנומית כמעט אקראית.

טיפוח ואלקטרופורציה של תאי RPE אנושיים ראשוניים הראינו כי זריעה של מספר מספיק של תאי RPE ראשוניים ממוצא מן החי מאפשרת טיפוח וצמיחה לחד-שכבתי משולב של תאים בעלי פיגמנטציה בצורת משושה36,37,48. יכולתם ליצור צמתים הדוק?...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

פיתחנו פרוטוקול לטרנספקציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים על ידי אלקטרופורציה עם הגן המקודד גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). העברה מוצלחת הודגמה על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA).

שינוי גנטי מבוסס אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

שיטה זו מדגימה טרנספקציה מבוססת אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת, עדות לביטוי טרנסגני ולהפרשת חלבונים. השילוב של מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת ואלקטרופורציה מאפשר העברה יעילה של תאי אפיתל פיגמנטים אנושיים ראשוניים, כמו גם ביטוי טרנסגנים יציב ומתמשך והפרשת חלבונים. המטרה הכוללת היא להקים טיפול תוספת גנים מבוסס תאים לטיפול במחלות ניווניות ברשתית, הדורש הפרשה יציבה ומתמשכת של החלבון הפעיל מבחינה טיפולית.המדגימים את ההליך יהיו אן פריאלדנהובן ואנטיה שייפר, עוזרים טכניים רפואיים מהמעבדה. כדי להכין דנ"א פלסמיד לאלקטרופורציה ראשונית של תאי RPE אנושיים, השתמש בספקטרופוטומטר מיקרו-נפח כדי לכמת את תכולת הדנ"א הפלסמיד, והתאם את הריכוז ל-250 ננוגרם למיקרוליטר ב-10 מילימולר Tris-HCL. ערבבו נפח אחד של 250 ננוגרם למיקרוליטר של דנ"א פלסמיד טרנספוזאז SB100X עם 16 נפחים של 250 ננוגרם למיקרוליטר של פיגמנט אפיתל שמקורו בגורם טרנספוזון פלסמיד DNA.הוסף שני מיקרוליטרים של תערובת הפלזמה המתקבלת לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר נעילה בטוחה על קרח ומלא צינור חיץ עם שלושה מיליליטר של חיץ E.ואז הכנס את הצינור לתחנת פיפטה עד לשמיעת קליק והגדר את מכשיר הטרנספקציה ל -1, 100 וולט, רוחב פולס של 20 אלפיות השנייה ושני פולסים. כדי להכין את התאים לאלקטרופורציה. ראשית, בדוק את המורפולוגיה של תרביות תאי RPE ראשוניות באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה כדי להעריך את גדילתן ומפגשן.טפלו בתאים עם 500 מיקרוליטרים של 0.05% טריפסין EDTA לכל באר במשך שבע עד 15 דקות באינקובטור תרבית התאים. כאשר התאים מתנתקים לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, יש לתלות את התאים במיליליטר אחד של PBS ולבצע צנטריפוגה אחת עד 10 פעמים 10 לארבעת התאים האליקוטים לכל תגובת טרנספקציה. השהה את הכדורים ב -11 מיקרוליטרים של חיץ R לכל צינור והוסף שני מיקרוליטרים של תערובת הפלסמיד המוכנה לכל צינור.הכנס את ראשו של פיפטה טרנספקציה לתוך קצה תעתיק של 10 מיקרוליטר עד שהמהדק מרים במלואו את גזע ההרכבה של הבוכנה וטוען את תמיסת התא והפלסמיד לתוך קצה הטרנספקציה. הכנס את פיפטה הטרנספקציה לתוך צינור החיץ הממוקם בתוך תחנת הפיפטה עד לשמיעת נקישה ולחץ על התחל כדי להתחיל בתהליך האלקטרופורציה. לאחר הטרנספקציה הסר בזהירות את פיפטה הטרנספקציה מתחנת הפיפטה ומיד פיפט את התא ואת תמיסת הפלסמיד לתוך הבארות המוכנות של צלחת תרבית התא.כדי לטהר את הפיגמנט המתויג שלו אפיתל נגזר חלבון היתוך גורם מתרבית תאי RPE supernatants. ראשית, השתמש בקצה חתך משופע כדי לאסוף אליקוט אחד של 30 מיקרוליטר של ניקל NTA slurry לכל דגימה וכדור שרף NTA ניקל על ידי צנטריפוגה. בזהירות להשעות את שרף ניקל NTA עם 200 microliters של מאגר הדגירה One X ו גלולה את הפתרון עם צנטריפוגה נוספת פעמיים.לאחר הצנטריפוגה השנייה, יש להשעות בזהירות את כדורי השרף של ניקל NTA עם 40 מיקרוליטרים של מאגר דגירה Four X לכל דגימה. לאחר מכן מערבבים 55 מיקרוליטרים של אליקוט אחד של ניקל NTA שטופל מראש עם 260 מיקרוליטרים של מאגר דגירה של Four X ו-900 מיקרוליטרים של כל תרבית תאי RPE שעברה טרנספקציה. מדגרים את התערובת על שייקר מתנדנד בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות ומניחים שוב את תערובת שרף הניקל NTA.החזירו בזהירות את הכדורים ב-175 מיקרוליטרים של חיץ דגירה One X וצנטריפוגות של התערובות פעמיים נוספות. לאחר הצנטריפוגה השנייה יש להשעות בזהירות את כדורי השרף של ניקל NTA ב-30 מיקרוליטרים של חיץ Elution למשך דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור וצנטריפוגה של הדגימות שוב. לאחר מכן אספו בזהירות את הסופרנאטנטים וערבבו אותם עם מאגר דגימת Two X SDS לניתוח דם מערבי של החלבונים המטוהרים.תאי RPE ראשוניים מעובדים שבודדו מעיני התורם האנושי מדגימים מורפולוגיה טיפוסית ללא קשר לגיל התורם, זמן הבידוד לאחר המוות או זמן הטיפוח. יישום של פולסים חשמליים לטווח קצר על תאי RPE אנושיים ראשוניים. השימוש במערכת הטרנספקציה הנימית אינו משפיע לרעה על המורפולוגיה האפיתלית.ניתוח דם מערבי של תרביות-על של תרביות תאי RPE אנושיות ראשוניות שעברו טרנספקציה מדגים הפרשת גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי ברמות עקביות ללא השתקה טרנסגנית במשך יותר מ-500 יום. כפי שנצפה בניתוח דם מערבי מייצג זה של מדיום תרבית תאים מטרנספקציות שבוצעו באופן סדרתי, שיעור הפרשת גורם אפיתל פיגמנטי גבוה יותר באופן אוניברסלי נצפה ב -21 יום לאחר הטרנספקציה. בתרבות נרדפת, הפרשת PEDF מוגברת לטווח ארוך נמשכת לפחות 165 יום.בנוסף, כימות מבוסס ELISA חושף עלייה של פי 20 בהפרשת הגורם הכולל של אפיתל פיגמנט בתאי RPE אנושיים ראשוניים שעברו טרנספקציה, בהשוואה לתאי בקרה שאינם מועברים בהתאמה. תוספת זו אושרה גם ברמת ביטוי הגנים שבה הביטוי הכולל של PEDF הועלה יותר מפי 30. כאשר מנסים פרוטוקול זה, חשוב להשתמש בתאי אפיתל פיגמנטיים שהמורפולוגיה שלהם תואמת את מצב In Vivo.כמו כן, זכור למשוך את תמיסת התא לתוך קצה transfection ללא בועות אוויר. ניתן להשתמש בתאים היציבים שעברו טרנספקציה במודלים שונים של Ex Vivo או In vivo כדי לאמת את הפונקציונליות של טיפול נוסף גנטי מבוסס תאים זה.

Research

JoVE Journal

Medicine

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

תרבות explant עור אגרוף ביופסיה לגזירה של fibroblasts אדם היסודי

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

זיהוי<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; הוספות Transposon בגידולים מוצקים באמצעות PCR לינקר בתיווך

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

אינדוקציה של טרשת עורקים מואצת בעכברים: מודל "פגיעת חוט"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer

מדידה של קרוטנואידים ב Perifovea באמצעות פיגמנט מקולרי השתקפות

The macular pigment reflectometer (MPR) objectively measures the overall macular pigment optical density (MPOD) and further provides the lutein optical ...