Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

इस काम को अनुसंधान, तकनीकी विकास और प्रदर्शन के लिए यूरोपीय संघ के सातवें फ्रेमवर्क प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था, अनुदान समझौता संख्या 305134। Zsuzsanna Izsvak को यूरोपीय अनुसंधान परिषद, ERC एडवांस्ड (ERC-2011-ADG 294742) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए अन्ना डोबियास और एंटजे शेफर (नेत्र विज्ञान विभाग, विश्वविद्यालय अस्पताल आरडब्ल्यूटीएच आचेन) और मानव दाता आंखें प्रदान करने के लिए आचेन कॉर्निया बैंक (नेत्र विज्ञान विभाग, विश्वविद्यालय अस्पताल आरडब्ल्यूटीएच आचेन) को धन्यवाद देना चाहते हैं।

हेलसिंकी प्रोटोकॉल की घोषणा के अनुसार सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद नेत्र विज्ञान विभाग (विश्वविद्यालय अस्पताल आरडब्ल्यूटीएच आचेन) के आचेन कॉर्निया बैंक से मानव दाता आंखें प्राप्त की गईं। मानव नम?...

हमारी परियोजना में, हम आनुवंशिक रूप से संशोधित प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं के गैर-वायरल उत्पादन का लक्ष्य रखते हैं जो एक सुरक्षात्मक वातावरण की स्थापना और रखरखाव के लिए दीर्घकालिक चिकित्सीय के रूप ?...

उन्नत आयु को न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के लिए मुख्य जोखिम के रूप में वर्णित किया गया है। उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी), एक पॉलीजेनिक बीमारी जो 60 वर्ष से अधिक उम्र के रोगियों में गंभीर दृष्टि हानि का कारण बनती है, अंधापन और दृष्टि हानि के चार सबसे आम कारणों से संबंधित हैऔर 20402 में 288 मिलियन लोगों तक बढ़ने की उम्मीद है। रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) की शिथिलता, कोरियोकेशिकापिलरिस और रेटिना फोटोरिसेप्टर के बीच स्थित कसकर पैक कोशिकाओं की एक परत, एएमडी के रोगजनन में योगदान करती है। आरपीई कई कार्यों को पूरा करता है जो एक सामान्य रेटिना फ़ंक्शन3 के लिए आवश्यक हैं और रेटिना और कोरियोकेशिकाओं की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक विभिन्न प्रकार के विकास कारकों और कारकों को स्रावित करता है, जिससे फोटोरिसेप्टर अस्तित्व का समर्थन होता है और परिसंचरण और पोषक तत्वों की आपूर्ति के लिए आधार प्रदान करता है।
स्वस्थ आंखों में, वर्णक उपकला-व्युत्पन्न कारक (पीईडीएफ) संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) के प्रभावों को संतुलित करने के लिए जिम्मेदार है और एपोप्टोसिस के खिलाफ न्यूरॉन्स की रक्षा करता है, एंडोथेलियल सेल प्रसार को रोकता है, और केशिका एंडोथेलियम को स्थिर करता है। एक स्थानांतरित वीईजीएफ-टू-पीईडीएफ अनुपात ओकुलर नियोवैस्कुलराइजेशन से संबंधित है, जो पशु मॉडल 4,5 के साथ-साथ एएमडी और प्रोलिफेरेटिव डायबिटिक रेटिनोपैथी 6,7,8,9,10 के कारण कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन (सीएनवी) वाले रोगियों के नमूनों में देखा गया था। . बढ़ी हुई वीईजीएफ एकाग्रता वर्तमान मानक उपचार के लिए लक्ष्य है। एंटी-वीईजीएफ फार्मास्यूटिकल्स बेवासिजुमैब, रेनिबिज़ुमाब, एफ्लिबरसेप्ट और, हाल ही में, ब्रोलुसिज़ुमैब लगभग एक तिहाई सीएनवी रोगियों में दृश्य तीक्ष्णता में सुधार करते हैं या 11,12,13 मामलों में 90% मामलों में दृष्टि को स्थिर करते हैं। हालांकि, लगातार, अक्सर मासिक, इंट्राविट्रल इंजेक्शन प्रतिकूल घटनाओं का जोखिम उठाते हैं14, रोगी अनुपालन को बाधित करते हैं, और स्वास्थ्य देखभाल प्रणालियों के लिए एक महत्वपूर्ण आर्थिक बोझ का प्रतिनिधित्व करतेहैं। इसके अलावा, रोगियों का एक निश्चित प्रतिशत (2% -20%) प्रतिक्रिया नहीं देता है या केवल एंटी-वीईजीएफ थेरेपी 16,17,18,19 के लिए खराब प्रतिक्रिया देता है। इन नकारात्मक सहवर्ती वैकल्पिक उपचारों के विकास की आवश्यकता होती है, जैसे, इंट्राओकुलर प्रत्यारोपण, सेल और / या जीन चिकित्सीय दृष्टिकोण।
जीन थेरेपी वंशानुगत और गैर-वंशानुगत रोगों के लिए आशाजनक उपचार के रूप में विकसित हुई है और गैर-कार्यात्मक जीन अनुक्रमों को बहाल करने या खराब लोगों को दबाने का इरादा रखती है। पॉलीजेनिक रोगों के लिए, जहां प्रेरक कारकों की पहचान और प्रतिस्थापन शायद ही संभव है, रणनीतियों का उद्देश्य एक सुरक्षात्मक कारक के निरंतर वितरण के लिए है। एएमडी के मामले में, विभिन्न योजक उपचार विकसित किए गए हैं, जैसे कि एंडोस्टैटिन और एंजियोस्टैटिन20 की स्थिर अभिव्यक्ति, वीईजीएफ विरोधी घुलनशील एफएमएस-जैसे टायरोसिन किनेज -1 (एसएफएलटी -1)21,22, भेदभाव 59 (सीडी 59)23 या पीईडीएफ24,25 का पूरक नियामक प्रोटीन क्लस्टर . आंख, और विशेष रूप से रेटिना, संलग्न संरचना, अच्छी पहुंच, छोटे आकार और प्रतिरक्षा विशेषाधिकार के कारण जीन-आधारित दवा के लिए एक उत्कृष्ट लक्ष्य है, इस प्रकार कम चिकित्सीय खुराक के स्थानीय वितरण की अनुमति देता है और प्रत्यारोपण को अस्वीकृति के लिए कम संवेदनशील बनाता है। इसके अलावा, आंख गैर-इनवेसिव निगरानी को सक्षम करती है, और रेटिना की जांच विभिन्न इमेजिंग तकनीकों द्वारा की जा सकती है।
वायरल वैक्टर, उनकी उच्च पारगमन दक्षता के कारण, लक्ष्य कोशिकाओं में चिकित्सीय जीन देने के लिए मुख्य वाहन हैं। हालांकि, उपयोग किए गए वायरल वेक्टर के आधार पर, विभिन्न प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं का वर्णन किया गया है, जैसे कि प्रतिरक्षा और भड़काऊ प्रतिक्रियाएं26, म्यूटाजेनिक और ऑन्कोजेनिक प्रभाव27,28, या अन्यऊतकों में प्रसार 29। व्यावहारिक सीमाओं में एक प्रतिबंधित पैकेजिंग आकार30 के साथ-साथ नैदानिक ग्रेड लॉट31,32 के उत्पादन से जुड़ी कठिनाइयों और लागतों को शामिल किया गया है। इन कमियों ने गैर-वायरल, प्लास्मिड-आधारित वैक्टर के आगे के विकास को बढ़ावा दिया है जो लिपो-/ पॉलीप्लेक्स, अल्ट्रासाउंड या इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से स्थानांतरित होते हैं। हालांकि, मेजबान जीनोम में ट्रांसजीन के जीनोमिक एकीकरण को आमतौर पर प्लास्मिड वैक्टर के साथ बढ़ावा नहीं दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक क्षणिक अभिव्यक्ति होती है।
ट्रांसपोसन स्वाभाविक रूप से होने वाले डीएनए टुकड़े हैं जो जीनोम के भीतर अपनी स्थिति बदलते हैं, एक विशेषता जिसे जीन थेरेपी के लिए अपनाया गया है। एक सक्रिय एकीकरण तंत्र के कारण, ट्रांसपोसन-आधारित वेक्टर सिस्टम सम्मिलित ट्रांसजीन की निरंतर और निरंतर अभिव्यक्ति की अनुमति देते हैं। स्लीपिंग ब्यूटी (एसबी) ट्रांसपोसन, मछली33 में पाए जाने वाले एक प्राचीन टीसी 1 / मेरिनर-प्रकार ट्रांसपोसन से पुनर्गठित और आणविक विकास द्वारा और सुधार किया गया, जिसके परिणामस्वरूप हाइपरएक्टिव संस्करण एसबी 100 एक्स34 ने विभिन्न प्राथमिक कोशिकाओं में कुशल ट्रांसपोज़ेशन को सक्षम किया और विभिन्न रोग मॉडल35 में फेनोटाइपिक सुधार के लिए उपयोग किया गया। वर्तमान में, एसबी ट्रांसपोसन प्रणाली का उपयोग करके 13 नैदानिक परीक्षण शुरू किए गए हैं। एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसन सिस्टम में दो घटक होते हैं: ट्रांसपोसन, जिसमें टर्मिनल इनवर्टेड रिपीट (टीआईआर) से घिरे ब्याज के जीन शामिल होते हैं, और ट्रांसपोसेज, जो ट्रांसपोसन को जुटाता है। कोशिकाओं को प्लास्मिड डीएनए वितरण के बाद, ट्रांसपोसेस टीआईआर को बांधता है और सेल के जीनोम में ट्रांसपोसन के छांटने और एकीकरण को उत्प्रेरित करता है।
हमने नियोवास्कुलर एएमडी के उपचार के लिए एक गैर-वायरल सेल-आधारित योजक थेरेपी विकसित की है। दृष्टिकोण में एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसन सिस्टम36,37,38 के माध्यम से प्राथमिक वर्णक उपकला (पीई) कोशिकाओं में पीईडीएफ जीन का इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित सम्मिलन शामिल है। ट्रांसपोसेस और पीईडीएफ की आनुवंशिक जानकारी अलग-अलग प्लास्मिड पर प्रदान की जाती है, जिससे आदर्श एसबी 100 एक्स-टू-पीईडीएफ ट्रांसपोसन अनुपात का समायोजन सक्षम होता है। इलेक्ट्रोपोरेशन एक पिपेट-आधारित केशिका अभिकर्मक प्रणाली का उपयोग करके किया जाता है जो इलेक्ट्रोड के बीच उनके सतह क्षेत्र को कम करते हुए अधिकतम अंतर आकार की विशेषता है। डिवाइस को स्तनधारी कोशिकाओं 39,40,41 की एक विस्तृत श्रृंखला में उत्कृष्ट अभिकर्मक दर प्राप्त करने के लिए दिखाया गया था। छोटा इलेक्ट्रोड सतह क्षेत्र एक समान विद्युत क्षेत्र प्रदान करता है और इलेक्ट्रोलिसिस42 के विभिन्न दुष्प्रभावों को कम करता है।
ट्रांसक्रिप्टेड पिगमेंट एपिथेलियल कोशिकाओं द्वारा स्रावित पीईडीएफ की एंटी-एंजियोजेनिक कार्यक्षमता को मानव नाभि शिराएंडोथेलियल कोशिकाओं के अंकुरण, प्रवास और एपोप्टोसिस का विश्लेषण करने वाले विभिन्न इन विट्रो प्रयोगों में दिखाया गया था। इसके अलावा, कॉर्नियल नियोवैस्कुलराइजेशन44 के खरगोश मॉडल में पीईडीएफ-ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के साथ-साथ सीएनवी 43,45,46 के चूहे मॉडल ने नियोवैस्कुलराइजेशन की गिरावट दिखाई।
यहां, हम एक केशिका अभिकर्मक प्रणाली का उपयोग करके एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसन सिस्टम के माध्यम से प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं में पीईडीएफ जीन के स्थिर सम्मिलन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। संक्रमित कोशिकाओं को 21 दिनों के लिए संस्कृति में रखा गया था और बाद में मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) द्वारा पीईडीएफ जीन अभिव्यक्ति के संदर्भ में और इम्यूनोब्लोटिंग और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा, चित्रा 1) द्वारा पीईडीएफ प्रोटीन स्राव के संदर्भ में विश्लेषण किया गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

हमारे तेजी से बढ़ते बुढ़ापे के समाज से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों की बढ़ती घटनाएं होती हैं। अब तक, पैथोलॉजिकल तंत्र अपर्याप्त रूप से समझे जाते हैं, इस प्रकार परिभाषित उपचारों की स्थापना में बाधा डालते हैं। एक सुरक्षात्मक कारक की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के लिए सेल-आधारित योजक जीन थेरेपी को उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों को दवा देने के लिए एक आशाजनक विकल्प माना जाता है। हमने जीन एन्कोडिंग पिगमेंट एपिथेलियम-व्युत्पन्न कारक (पीईडीएफ) की स्थिर अभिव्यक्ति के लिए एक विधि विकसित की है, जिसे तंत्रिका तंत्र में न्यूरोप्रोटेक्टिव और एंटी-एंजियोजेनिक प्रोटीन के रूप में जाना जाता है, जो स्लीपिंग ब्यूटी (एसबी) ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके प्राथमिक मानव वर्णक उपकला (पीई) कोशिकाओं के जीनोम में होता है। प्राथमिक पीई कोशिकाओं को मानव दाता आंखों से अलग किया गया था और संस्कृति में बनाए रखा गया था। संगम तक पहुंचने के बाद, 1 x 104 कोशिकाओं को 11 μL पुन: निलंबन बफर में निलंबित कर दिया गया और 2 μL के साथ एक शुद्ध घोल के साथ जोड़ा गया जिसमें 30 ng हाइपरएक्टिव एसबी (SB100X) ट्रांसपोसेज प्लास्मिड और 470 एनजी पीईडीएफ ट्रांसपोसन प्लास्मिड शामिल थे। आनुवंशिक संशोधन निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके एक केशिका इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम के साथ किया गया था: 1,100 वी के वोल्टेज और 20 एमएस की चौड़ाई के साथ दो दालें। संक्रमित कोशिकाओं को कल्चर प्लेटों में स्थानांतरित किया गया था जिसमें भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक माध्यम था; पहले मध्यम विनिमय के साथ एंटीबायोटिक्स और एंटीमाइकोटिक्स जोड़े गए थे। स्वतंत्र रूप से किए गए प्रयोगों में सफल अभिकर्मक का प्रदर्शन किया गया था। क्वांटिटेटिव पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) ने पीईडीएफ ट्रांसजेन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति को दिखाया। पीईडीएफ स्राव काफी ऊंचा था और स्थिर रहा, जैसा कि इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा मूल्यांकन किया गया था, और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा निर्धारित किया गया था। एसबी 100 एक्स-मध्यस्थता हस्तांतरण ने पीई कोशिकाओं के जीनोम में एक स्थिर पीईडीएफ जीन एकीकरण की अनुमति दी और पीईडीएफ के निरंतर स्राव को सुनिश्चित किया, जो एएमडी या अन्य रेटिना अपक्षयी रोगों के इलाज के लिए सेल-आधारित जीन जोड़ चिकित्सा के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, मानव पीई कोशिकाओं में पीईडीएफ ट्रांसपोसन के एकीकरण प्रोफाइल के विश्लेषण ने लगभग यादृच्छिक जीनोमिक वितरण का संकेत दिया।

प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं की खेती और विद्युतीकरण हमने दिखाया है कि पशु मूल की प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या की सीडिंग पिगमेंटेड, हेक्सागोनल आकार की कोशिकाओं 36,37,4...

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Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

हमने स्लीपिंग ब्यूटी (एसबी) ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके जीन एन्कोडिंग पिगमेंट एपिथेलियम-व्युत्पन्न कारक (पीईडीएफ) के साथ इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा प्राथमिक मानव वर्णक उपकला कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। सफल अभिकर्मक मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर), इम्यूनोब्लोटिंग और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा प्रदर्शित किया गया था।

स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके प्राथमिक मानव वर्णक उपकला कोशिकाओं का इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित आनुवंशिक संशोधन

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

यह विधि स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन सिस्टम का उपयोग करके प्राथमिक मानव वर्णक उपकला कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपोरेशन-आधारित अभिकर्मक को प्रदर्शित करती है, जो ट्रांसजेन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्राव के लिए एक सबूत है। स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन सिस्टम और इलेक्ट्रोपोरेशन का संयोजन प्राथमिक मानव वर्णक उपकला कोशिकाओं के कुशल अभिकर्मक के साथ-साथ स्थिर और लगातार ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्राव को सक्षम बनाता है। समग्र उद्देश्य रेटिना अपक्षयी रोगों के उपचार के लिए एक सेल-आधारित जीन जोड़ चिकित्सा स्थापित करना है, जिसके लिए चिकित्सीय रूप से सक्रिय प्रोटीन के स्थिर और लगातार स्राव की आवश्यकता होती है।प्रक्रिया का प्रदर्शन प्रयोगशाला के चिकित्सा तकनीकी सहायक ऐनी फ्रील्डेनहोवन और एंटजे शिफर करेंगे। प्राथमिक मानव आरपीई सेल इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए प्लास्मिड डीएनए तैयार करने के लिए, प्लास्मिड डीएनए सामग्री को मापने के लिए एक माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें, और 10 मिलीमोलर ट्रिस-एचसीएल में एकाग्रता को 250 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर तक समायोजित करें। एसबी 100 एक्स ट्रांसपोसेज प्लास्मिड डीएनए के 250 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर की एक मात्रा को वर्णक उपकला व्युत्पन्न कारक ट्रांसपोसन प्लास्मिड डीएनए के 250 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर के 16 संस्करणों के साथ मिलाएं।परिणामी प्लाज्मा मिश्रण के दो माइक्रोलीटर को बर्फ पर बाँझ 1.5 मिलीलीटर सुरक्षित लॉक माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें और तीन मिलीलीटर बफर ई के साथ एक बफर ट्यूब भरें। फिर ट्यूब को पिपेट स्टेशन में डालें जब तक कि एक क्लिक न सुना जाए और अभिकर्मक डिवाइस को 1, 100 वोल्ट, 20 मिलीसेकंड पल्स चौड़ाई और दो दालों पर सेट करें। कोशिकाओं को विद्युतीकरण के लिए तैयार करना। सबसे पहले, उनके विकास और स्थिरता का आकलन करने के लिए चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राथमिक आरपीई सेल संस्कृतियों की आकृति विज्ञान की जांच करें।सेल कल्चर इनक्यूबेटर में सात से 15 मिनट के लिए प्रति अच्छी तरह से 0.05% ट्रिप्सिन ईडीटीए के 500 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। जब कोशिकाएं सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करती हैं, तो कोशिकाओं को पीबीएस के एक मिलीलीटर में पुन: निलंबित करती हैं और प्रति अभिकर्मक प्रतिक्रिया में चार सेल एलिकोट से एक से 10 गुना 10 गुना सेंट्रीफ्यूज करती हैं। प्रति ट्यूब बफर आर के 11 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करें और प्रत्येक ट्यूब में तैयार प्लास्मिड मिश्रण के दो माइक्रोलीटर जोड़ें।एक अभिकर्मक पिपेट के सिर को 10 माइक्रोलीटर अभिकर्मक टिप में डालें जब तक कि क्लैंप पिस्टन के बढ़ते तने को पूरी तरह से नहीं उठाता है और सेल और प्लास्मिड समाधान को अभिकर्मक सिरे में लोड करता है। पिपेट स्टेशन के भीतर रखी बफर ट्यूब में अभिकर्मक पिपेट डालें जब तक कि एक क्लिक न सुना जाए और इलेक्ट्रोपोरेशन प्रक्रिया शुरू करने के लिए दबाएं। अभिकर्मक के बाद पाइप स्टेशन से अभिकर्मक पिपेट को सावधानीपूर्वक हटा दें और तुरंत सेल और प्लास्मिड समाधान को सेल कल्चर प्लेट के तैयार कुओं में डालें।आरपीई सेल कल्चर सुपरनैटेंट से अपने टैग किए गए वर्णक उपकला व्युत्पन्न कारक संलयन प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए। सबसे पहले, प्रति नमूने निकेल एनटीए स्लरी के एक 30 माइक्रोलीटर एलिकोट को इकट्ठा करने के लिए बेवेल कट टिप का उपयोग करें और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा निकल एनटीए राल को पेलेट करें। निकेल एनटीए राल को वन एक्स इनक्यूबेशन बफर के 200 माइक्रोलीटर के साथ सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें और दो बार अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ घोल को पेलेट करें।दूसरे सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्रति नमूने चार एक्स इनक्यूबेशन बफर के 40 माइक्रोलीटर के साथ निकल एनटीए राल छर्रों को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें। इसके बाद चार एक्स इनक्यूबेशन बफर के 260 माइक्रोलीटर और प्रत्येक ट्रांसेफ्टेड आरपीई सेल कल्चर सुपरनैटेंट के 900 माइक्रोलीटर के साथ प्रीट्रीटेड निकेल एनटीए स्लरी के एक एलिकोट के 55 माइक्रोलीटर मिलाएं। मिश्रण को 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक रॉकिंग शेकर पर इनक्यूबेट करें और निकल एनटीए राल मिश्रण को फिर से पेलेट करें।वन एक्स इनक्यूबेशन बफर के 175 माइक्रोलीटर में छर्रों को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें और मिश्रण को दो बार सेंट्रीफ्यूज करें। दूसरे सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद निकेल एनटीए राल छर्रों को कमरे के तापमान पर 20 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए 30 माइक्रोलीटर एलियेशन बफर में फिर से निलंबित किया गया। फिर ध्यान से सुपरनैटेंट एकत्र करें और उन्हें शुद्ध प्रोटीन के पश्चिमी रक्त विश्लेषण के लिए दो एक्स एसडीएस नमूना बफर के साथ मिलाएं।मानव दाता आंखों से अलग की गई प्राथमिक आरपीई कोशिकाएं दाता की उम्र, अलगाव के पोस्टमॉर्टम समय या खेती के समय की परवाह किए बिना एक विशिष्ट कोबलस्टोन आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करती हैं। प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं के लिए अल्पकालिक विद्युत दालों का अनुप्रयोग। केशिका अभिकर्मक प्रणाली का उपयोग उपकला आकृति विज्ञान पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं डालता है।ट्रांसक्रिप्टेड प्राथमिक मानव आरपीई सेल कल्चर सुपरनैटेंट्स के पश्चिमी रक्त विश्लेषण ने 500 से अधिक दिनों के लिए ट्रांसजीन साइलेंसिंग के बिना लगातार स्तर पर वर्णक उपकला व्युत्पन्न कारक स्राव का प्रदर्शन किया। जैसा कि क्रमिक रूप से किए गए अभिकर्मकों से कोशिका संस्कृति माध्यम के इस प्रतिनिधि पश्चिमी रक्त विश्लेषण में देखा गया है, अभिकर्मक के 21 दिनों बाद एक सार्वभौमिक रूप से उच्च वर्णक उपकला व्युत्पन्न कारक स्राव दर देखी जाती है। एक पीछा की गई संस्कृति में, दीर्घकालिक ऊंचा पीईडीएफ स्राव कम से कम 165 दिनों तक रहता है।इसके अलावा एलिसा-आधारित परिमाणीकरण से संबंधित गैर-संक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में स्थानांतरित प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं में कुल वर्णक उपकला व्युत्पन्न कारक स्राव में 20 गुना वृद्धि का पता चलता है। इस वृद्धि की पुष्टि जीन अभिव्यक्ति स्तर पर भी की गई थी, जिस पर कुल पीईडीएफ अभिव्यक्ति को 30 गुना से अधिक बढ़ाया गया था। इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, वर्णक उपकला कोशिकाओं का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जिनकी आकृति विज्ञान इन विवो स्थिति से मेल खाती है।इसके अलावा, हवा के बुलबुले के बिना अभिकर्मक टिप में सेल समाधान को खींचना याद रखें। इस सेल-आधारित जीन जोड़ चिकित्सा की कार्यक्षमता को सत्यापित करने के लिए विभिन्न एक्स विवो या इन विवो मॉडल में स्थिर रूप से स्थानांतरित कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Medicine

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

प्राथमिक मानव fibroblasts की व्युत्पत्ति के लिए त्वचा पंच बायोप्सी explant संस्कृति

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

की पहचान<em&gt; स्लीपिंग ब्यूटी</em&gt; Linker की मध्यस्थता पीसीआर का उपयोग कर ठोस ट्यूमर में Transposon सम्मिलन

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

प्राथमिक Preneoplastic स्तन उपकला कोशिकाओं के समय चूक इमेजिंग स्तन कैंसर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से निकाली

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

अलगाव, cryopreservation और संस्कृति नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए मानव भ्रूणावरण उपकला कोशिकाओं

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

निलंबन में रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं उद्धार करने के लिए कृन्तकों में subretinal इंजेक्शन प्रदर्शन

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

प्राथमिक मल्टीपल मायलोमा प्रकोष्ठों की दवा संवेदनशीलता की विशेषता के लिए एक Organotypic उच्च Throughput सिस्टम

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

चूहों में त्वरित एथेरोस्क्लेरोसिस का समावेश: "वायर-इंजरी" मॉडल

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

शब्द अपरा की भ्रूण झिल्ली से प्राथमिक मानव Decidual कोशिकाओं का अलगाव

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

मानव अग्नाशय बीटा कोशिकाओं में Situ में अंतर्जात Mitophagy परिसरों का दृश्य निकटता लिगेशन परख का उपयोग

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer

मैकुलर पिगमेंट रिफ्लेक्नोमीटर का उपयोग करके पेरिफोवेया में कैरोटेनॉइड का मापन

The macular pigment reflectometer (MPR) objectively measures the overall macular pigment optical density (MPOD) and further provides the lutein optical ...