Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Settimo programma quadro dell'Unione europea per la ricerca, lo sviluppo tecnologico e la dimostrazione, convenzione di sovvenzione n. 305134. Zsuzsanna Izsvák è stata finanziata dal Consiglio europeo della ricerca, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Gli autori desiderano ringraziare Anna Dobias e Antje Schiefer (Dipartimento di Oftalmologia, Ospedale universitario RWTH Aachen) per l'eccellente supporto tecnico e la Banca della cornea di Aquisgrana (Dipartimento di Oftalmologia, Ospedale universitario RWTH Aachen) per aver fornito gli occhi del donatore umano.

Gli occhi dei donatori umani sono stati ottenuti dalla Banca della cornea di Aquisgrana del Dipartimento di Oftalmologia (Ospedale universitario RWTH di Aquisgrana) dopo aver ottenuto il consenso informato in conformità con i protocolli della Dichiarazione di Helsinki. Le procedure per la raccolta e l'uso di campioni umani sono state approvate dal comitato etico istituzionale.
1. Isolamento di cellule RPE umane primarie
<ol><li>Stendere indumenti protettivi sterili e guanti. Posizionare un ...

Nel nostro progetto, miriamo alla produzione non virale di cellule RPE umane primarie geneticamente modificate che sovraesprimono continuamente e secernono un fattore efficace al fine di utilizzare le cellule trasfettate come terapia a lungo termine per la creazione e il mantenimento di un ambiente protettivo. Abbiamo stabilito l'introduzione del gene che codifica per il PEDF, una proteina multifunzionale ubiquitariamente espressa con funzioni anti-angiogeniche e neuroprotettive. Il protocollo qui descritto può essere u...

L'età avanzata è descritta come il principale rischio di malattie neurodegenerative. La degenerazione maculare legata all'età (AMD), una malattia poligenica che porta a una grave perdita della vista nei pazienti di età superiore ai 60 anni, appartiene alle quattro cause più comuni di cecità e compromissione della vista1 e si prevede che aumenterà a 288 milioni di persone nel 20402. Le disfunzioni dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), un singolo strato di cellule strettamente impacchettate situate tra il coriocapillare e i fotorecettori retinici, contribuiscono alla patogenesi dell'AMD. L'RPE svolge molteplici compiti essenziali per una normale funzione retinica3 e secerne una varietà di fattori di crescita e fattori essenziali per mantenere l'integrità strutturale della retina e del coriocapillare, supportando così la sopravvivenza dei fotorecettori e fornendo una base per la circolazione e l'apporto di nutrienti.
Negli occhi sani, il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) è responsabile del bilanciamento degli effetti del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e protegge i neuroni dall'apoptosi, previene la proliferazione delle cellule endoteliali e stabilizza l'endotelio capillare. Uno spostamento del rapporto VEGF-PEDF è correlato alla neovascolarizzazione oculare, che è stata osservata nei modelli animali4,5 e in campioni di pazienti con neovascolarizzazione coroideale (CNV) dovuta a AMD e retinopatia diabetica proliferativa 6,7,8,9,10 . L'aumento della concentrazione di VEGF è l'obiettivo per l'attuale trattamento standard. I farmaci anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept e, più recentemente, brolucizumab migliorano l'acuità visiva in circa un terzo dei pazienti con CNV o meglio stabilizzano la vista nel 90% dei casi11,12,13. Tuttavia, le frequenti iniezioni intravitreali, spesso mensili, comportano il rischio di eventi avversi14, compromettono la compliance del paziente e rappresentano un onere economico significativo per i sistemi sanitari15. Inoltre, una certa percentuale di pazienti (2%-20%) non risponde o reagisce solo male alla terapia anti-VEGF16,17,18,19. Questi concomitanti negativi richiedono lo sviluppo di trattamenti alternativi, ad esempio impianti intraoculari, approcci terapeutici cellulari e/o genici.
La terapia genica si è evoluta come trattamento promettente per le malattie ereditarie e non ereditarie e intende ripristinare sequenze geniche non funzionali o sopprimere quelle malfunzionanti. Per le malattie poligeniche, dove l'identificazione e la sostituzione dei fattori causali è difficilmente possibile, le strategie mirano alla fornitura continua di un fattore protettivo. Nel caso dell'AMD, sono state sviluppate varie terapie additive, come l'espressione stabile di endostatina e angiostatina20, l'antagonista VEGF tirosin-simile alla tirosin-chinasi-1 (sFLT-1)21,22, il cluster proteico regolatore del complemento della differenziazione 59 (CD59)23 o PEDF 24,25 . L'occhio, e in particolare la retina, è un bersaglio eccellente per un farmaco basato su geni a causa della struttura chiusa, della buona accessibilità, delle piccole dimensioni e del privilegio immunitario, consentendo così una consegna localizzata di basse dosi terapeutiche e rendendo i trapianti meno suscettibili al rigetto. Inoltre, l'occhio consente un monitoraggio non invasivo e la retina può essere esaminata con diverse tecniche di imaging.
I vettori virali sono, a causa della loro elevata efficienza di trasduzione, il veicolo principale per fornire geni terapeutici nelle cellule bersaglio. Tuttavia, a seconda del vettore virale utilizzato, sono state descritte diverse reazioni avverse, come risposte immunitarie e infiammatorie26, effetti mutageni e oncogeni 27,28 o disseminazione in altri tessuti29. Le limitazioni pratiche includono una dimensione di imballaggio limitata30, nonché difficoltà e costi associati alla produzione di lotti di grado clinico31,32. Questi inconvenienti hanno promosso l'ulteriore sviluppo di vettori non virali basati su plasmidi che vengono trasferiti tramite lipo / poliplex, ultrasuoni o elettroporazione. Tuttavia, l'integrazione genomica del transgene nel genoma dell'ospite di solito non è promossa con vettori plasmidici, risultando così in un'espressione transitoria.
I trasposoni sono frammenti di DNA presenti in natura che cambiano la loro posizione all'interno del genoma, una caratteristica che è stata adottata per la terapia genica. Grazie ad un meccanismo di integrazione attivo, i sistemi vettoriali basati su trasposoni consentono un'espressione continua e costante del transgene inserito. Il trasposone della Bella Addormentata (SB), ricostituito da un antico trasposone di tipo Tc1/marinaio trovato nel pesce33 e ulteriormente migliorato dall'evoluzione molecolare risultante nella variante iperattiva SB100X34, ha permesso una trasposizione efficiente in varie cellule primarie ed è stato utilizzato per la correzione fenotipica in diversi modelli di malattia35. Attualmente, 13 studi clinici sono stati avviati utilizzando il sistema di trasposone SB. Il sistema di trasposone SB100X è costituito da due componenti: il trasposone, che comprende il gene di interesse affiancato da ripetizioni invertite terminali (TIR), e la trasposasi, che mobilizza il trasposone. Dopo la consegna del DNA plasmidico alle cellule, la trasposasi lega i TIR e catalizza l'escissione e l'integrazione del trasposone nel genoma della cellula.
Abbiamo sviluppato una terapia additiva non virale basata su cellule per il trattamento dell'AMD neovascolare. L'approccio comprende l'inserimento basato sull'elettroporazione del gene PEDF in cellule epiteliali pigmentate primarie (PE) mediante il sistema di trasposone SB100X 36,37,38. Le informazioni genetiche della trasposasi e del PEDF sono fornite su plasmidi separati, consentendo così la regolazione del rapporto ideale tra trasposone SB100X e PEDF. L'elettroporazione viene eseguita utilizzando un sistema di trasfezione capillare basato su pipette caratterizzato da una dimensione massima dello spazio tra gli elettrodi, riducendo al minimo la loro superficie. Il dispositivo ha dimostrato di raggiungere eccellenti tassi di trasfezione in una vasta gamma di cellule di mammifero 39,40,41. La piccola superficie dell'elettrodo fornisce un campo elettrico uniforme e riduce i vari effetti collaterali dell'elettrolisi42.
La funzionalità anti-angiogenica del PEDF secreta dalle cellule epiteliali pigmentate trasfettate è stata dimostrata in vari esperimenti in vitro analizzando la germinazione, la migrazione e l'apoptosi delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana43. Inoltre, il trapianto di cellule trasfettate con PEDF in un modello di coniglio di neovascolarizzazione corneale44 e in un modello di ratto di CNV43,45,46 ha mostrato un declino della neovascolarizzazione.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'inserimento stabile del gene PEDF in cellule RPE umane primarie tramite il sistema di trasposone SB100X utilizzando un sistema di trasfezione capillare. Le cellule trasfettate sono state tenute in coltura per 21 giorni e successivamente analizzate in termini di espressione genica PEDF mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) e in termini di secrezione proteica PEDF mediante immunoblotting e saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA, Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

La nostra società sempre più anziana porta a una crescente incidenza di malattie neurodegenerative. Finora, i meccanismi patologici non sono adeguatamente compresi, impedendo così l'istituzione di trattamenti definiti. Le terapie geniche additive basate sulle cellule per l'aumentata espressione di un fattore protettivo sono considerate un'opzione promettente per medicare le malattie neurodegenerative, come la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Abbiamo sviluppato un metodo per l'espressione stabile del gene che codifica per il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF), che è caratterizzato come una proteina neuroprotettiva e anti-angiogenica nel sistema nervoso, nel genoma delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie (PE) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Le cellule PE primarie sono state isolate dagli occhi dei donatori umani e mantenute in coltura. Dopo aver raggiunto la confluenza, 1 x 104 cellule sono state sospese in 11 μL di tampone di risospensione e combinate con 2 μL di una soluzione purificata contenente 30 ng di plasmide iperattivo SB (SB100X) trasposasi e 470 ng di plasmide trasposone PEDF . La modificazione genetica è stata effettuata con un sistema di elettroporazione capillare utilizzando i seguenti parametri: due impulsi con una tensione di 1.100 V e una larghezza di 20 ms. Le cellule trasfettate sono state trasferite in piastre di coltura contenenti terreno integrato con siero fetale bovino; Antibiotici e antimicotici sono stati aggiunti con il primo scambio di mezzo. La trasfezione di successo è stata dimostrata in esperimenti eseguiti in modo indipendente. La reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) ha mostrato l'aumentata espressione del transgene PEDF . La secrezione di PEDF era significativamente elevata e rimaneva stabile, come valutato mediante immunoblotting e quantificato mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Il trasferimento mediato da SB100X ha permesso un'integrazione stabile del gene PEDF nel genoma delle cellule PE e ha assicurato la secrezione continua di PEDF, che è fondamentale per lo sviluppo di una terapia di aggiunta genica basata su cellule per il trattamento di AMD o altre malattie degenerative della retina. Inoltre, l'analisi del profilo di integrazione del trasposone PEDF in cellule PE umane ha indicato una distribuzione genomica quasi casuale.

Coltivazione ed elettroporazione di cellule RPE umane primarie Abbiamo dimostrato che la semina di un numero sufficiente di cellule RPE primarie di origine animale consente la coltivazione e la crescita in un monostrato integrato di cellule pigmentate di forma esagonale36,37,48. La loro capacità di formare giunzioni strette, di esibire attività fagocitaria e di esprimere gen...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare le cellule epiteliali pigmentate umane primarie mediante elettroporazione con il gene che codifica il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Il successo della trasfezione è stato dimostrato mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), immunoblotting e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).

Modificazione genetica basata sull'elettroporazione delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie utilizzando il sistema di trasposone della bella addormentata nel bosco

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Questo metodo dimostra la trasfezione basata sull'elettroporazione delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie utilizzando il sistema di trasposone della bella addormentata, una prova dell'espressione transgenica e della secrezione proteica. La combinazione del sistema di trasposone della bella addormentata nel bosco e dell'elettroporazione consente un'efficiente trasfezione delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie, nonché l'espressione transgenica stabile e persistente e la secrezione proteica. L'obiettivo generale è quello di stabilire una terapia di addizione genica basata su cellule per il trattamento delle malattie degenerative della retina, che richiede una secrezione stabile e persistente della proteina terapeuticamente attiva.A dimostrare la procedura saranno Anne Freialdenhoven e Antje Schiefer, assistenti tecnici medici del laboratorio. Per preparare il DNA plasmidico per l'elettroporazione primaria delle cellule RPE umane, utilizzare uno spettrofotometro a microvolume per quantificare il contenuto di DNA plasmidico e regolare la concentrazione a 250 nanogrammi per microlitro in Tris-HCL da 10 millimolari. Mescolare un volume di 250 nanogrammi per microlitro di DNA plasmidico della trasposasi SB100X con 16 volumi di 250 nanogrammi per microlitro di DNA plasmidico derivato dal fattore di trasposone dell'epitelio pigmentato.Aggiungere due microlitri della miscela di plasma risultante in un tubo di microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri di blocco sicuro su ghiaccio e riempire un tubo tampone con tre millilitri di tampone E.Quindi inserire il tubo nella stazione di pipetta fino a quando non si sente un clic e impostare il dispositivo di trasfezione su 1.100 volt, una larghezza di impulso di 20 millisecondi e due impulsi. Per preparare le celle per l'elettroporazione. In primo luogo, controllare la morfologia delle colture cellulari RPE primarie tramite microscopia a contrasto di fase per valutarne la crescita e la confluenza.Trattare le cellule con 500 microlitri di 0,05% di tripsina EDTA per pozzetto per sette-15 minuti nell'incubatore di coltura cellulare. Quando le cellule si sono staccate, raccogliere le cellule mediante centrifugazione, risospendere le cellule in un millilitro di PBS e centrifugare da una a 10 volte 10 alle quattro aliquote cellulari per reazione di trasfezione. Risospendere i pellet in 11 microlitri di tampone R per tubo e aggiungere due microlitri della miscela plasmidica preparata a ciascun tubo.Inserire la testa di una pipetta di trasfezione in una punta di trasfezione da 10 microlitri fino a quando il morsetto non raccoglie completamente lo stelo di montaggio del pistone e carica la cella e la soluzione plasmidica nella punta di trasfezione. Inserire la pipetta di trasfezione nel tubo tampone posto all'interno della stazione di pipetta fino a quando non si sente un clic e premere start per iniziare il processo di elettroporazione. Dopo la trasfezione, rimuovere con cautela la pipetta di trasfezione dalla stazione di pipetta e pipettare immediatamente la soluzione cellulare e plasmidica nei pozzetti preparati della piastra di coltura cellulare.Per purificare le proteine di fusione del fattore derivate dall'epitelio pigmentato marcato da supernatanti di coltura cellulare RPE. In primo luogo, utilizzare una punta di taglio smussato per raccogliere un'aliquota da 30 microlitri di liquame NTA di nichel per campione e pellettare la resina NTA di nichel mediante centrifugazione. Risospendere con cautela la resina nichel NTA con 200 microlitri di tampone di incubazione One X e pellettare la soluzione con un'ulteriore centrifugazione due volte.Dopo la seconda centrifugazione, risospendere accuratamente i pellet di resina di nichel NTA con 40 microlitri di tampone di incubazione Four X per campione. Quindi mescolare 55 microlitri di un'aliquota di liquame NTA di nichel pretrattato con 260 microlitri di tampone di incubazione Four X e 900 microlitri di ogni coltura cellulare RPE transefcted surnatant. Incubare la miscela su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente per 60 minuti e pellettare nuovamente le miscele di resina NTA nichel.Risospendere con cura il pellet in 175 microlitri di tampone di incubazione One X e centrifugare le miscele altre due volte. Dopo la seconda centrifugazione risospendere accuratamente i pellet di resina di nichel NTA in 30 microlitri di tampone Elution per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente con agitazione e centrifugare nuovamente i campioni. Quindi raccogliere con cura i surnatanti e mescolarli con il tampone campione Two X SDS per l'analisi del sangue occidentale delle proteine purificate.Le cellule RPE primarie coltivate isolate dagli occhi dei donatori umani dimostrano una tipica morfologia del ciottolo indipendentemente dall'età del donatore, dal tempo di isolamento post-mortem o dal tempo di coltivazione. L'applicazione di impulsi elettrici a breve termine a cellule RPE umane primarie. L'uso del sistema di trasfezione capillare non influisce negativamente sulla morfologia epiteliale.L'analisi del sangue occidentale dei supernatanti primari di colture cellulari RPE primarie trasfettate dimostra la secrezione di fattori derivati dall'epitelio pigmentato a livelli costanti senza silenziamento transgenico per più di 500 giorni. Come osservato in questa analisi del sangue occidentale rappresentativa del terreno di coltura cellulare da trasfezioni eseguite in serie, un tasso di secrezione del fattore derivato dall'epitelio pigmentato universalmente più alto si osserva a 21 giorni dopo la trasfezione. In una cultura perseguita, la secrezione elevata di PEDF a lungo termine dura per almeno 165 giorni.Inoltre, la quantificazione basata su ELISA rivela un aumento di 20 volte della secrezione totale del fattore derivato dall'epitelio pigmentato nelle cellule RPE umane primarie trasfettate rispetto alle rispettive cellule di controllo non trasfettate. Questo incremento è stato confermato anche al livello di espressione genica al quale l'espressione totale di PEDF è stata aumentata di oltre 30 volte. Quando si tenta questo protocollo, è importante utilizzare cellule epiteliali pigmentate la cui morfologia corrisponde allo stato In Vivo.Inoltre, ricordarsi di aspirare la soluzione cellulare nella punta di trasfezione senza bolle d'aria. Le cellule stabilmente trasfettate possono essere utilizzate in diversi modelli Ex Vivo o In vivo per verificare la funzionalità di questa terapia di aggiunta genica basata su cellule.

Research

JoVE Journal

Medicine

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Pelle Punch Biopsia Espianto Cultura per la derivazione di fibroblasti umani primari

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Ricerca

Medicina

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identificazione dei<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Inserimenti trasposone nei tumori solidi utilizzando Linker-mediata PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Induzione di aterosclerosi accelerata nei topi: il modello "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolamento di cellule deciduali umane primarie dalle membrane fetali del termine intempestivo della placenta

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer

Misurazione dei carotenoidi in Perifovea utilizzando il Riflessometro pigmento maculare

The macular pigment reflectometer (MPR) objectively measures the overall macular pigment optical density (MPOD) and further provides the lutein optical ...