Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
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この作業は、研究、技術開発、実証のための欧州連合の第7次フレームワークプログラム、助成金契約第305134号によってサポートされました。Zsuzsanna Izsvákは、欧州研究会議、ERC Advanced(ERC-2011-ADG 294742)から資金提供を受けました。著者らは、優れた技術サポートを提供してくれたAnna DobiasとAntje Schiefer(アーヘン大学病院眼科)と、人間のドナーの目を提供してくれたアーヘン角膜銀行(アーヘン大学病院眼科)に感謝したい。

ヒトドナーの目は、ヘルシンキ宣言プロトコルに従ってインフォームドコンセントを取得した後、眼科のアーヘン角膜バンク(アーヘン大学病院)から取得されました。ヒトサンプルの収集と使用の手順は、機関倫理委員会によって承認されています。
1. 初代ヒトRPE細胞の単離
<ol><li>滅菌防護服と手袋をレイアウトします。層流の下に滅菌ドレープを置きます。</li>
	<li>?...

本プロジェクトでは、遺伝子導入細胞を保護環境の確立と維持のための長期治療薬として使用するために、有効な因子を継続的に過剰発現および分泌する遺伝子改変初代ヒトRPE細胞の非ウイルス産生を目指しています。私たちは、抗血管新生機能と神経保護機能を有する遍在的に発現する多機能タンパク質であるPEDFをコードする遺伝子の導入を確立しました。ここで説明するプロトコルは、...

高齢は神経変性疾患の主なリスクであると説明されています。加齢黄斑変性症(AMD)は、60歳以上の患者に重篤な視力喪失をもたらす多遺伝子性疾患であり、失明と視力障害の4つの最も一般的な原因に属し1 、2040年には2億8,800万人に増加すると予想されています2。絨毛毛細血管と網膜光受容体の間に位置する密集した細胞の単層である網膜色素上皮(RPE)の機能不全は、AMDの病因の一因となります。RPEは、正常な網膜機能に不可欠な複数のタスクを実行し3、 網膜と絨毛毛細血管の構造的完全性を維持するために不可欠なさまざまな成長因子と因子を分泌し、それによって視細胞の生存をサポートし、循環と栄養素の供給の基礎を提供します。
健康な眼では、色素上皮由来因子(PEDF)は血管内皮成長因子(VEGF)の効果のバランスを取り、アポトーシスからニューロンを保護し、内皮細胞の増殖を防ぎ、毛細血管内皮を安定化させます。VEGFとPEDFの比率の変化は、動物モデル4,5、およびAMDおよび増殖性糖尿病網膜症による脈絡膜新生血管(CNV)患者のサンプルで観察された眼の新生血管に関連しています6,7,8,9,10 .強化されたVEGF濃度は、現在の標準治療の目標です。抗VEGF医薬品であるベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、そして最近ではブロルシズマブは、CNV患者の約3分の1の視力を改善するか、むしろ症例の90%で視力を安定させます11、12、13。しかし、頻繁に、しばしば毎月の硝子体内注射は、有害事象のリスクを負い14、患者のコンプライアンスを損ない、医療システム15にとって重大な経済的負担を表しています。さらに、一定の割合の患者(2%〜20%)は、抗VEGF療法に反応しないか、または反応が不十分である16,17,18,19。これらの負の付随物は、代替治療、例えば、眼内インプラント、細胞および/または遺伝子治療アプローチの開発を必要とする。
遺伝子治療は、遺伝性疾患および非遺伝性疾患の有望な治療法として進化しており、機能しない遺伝子配列を回復したり、機能不全の遺伝子配列を抑制したりすることを目的としています。原因因子の特定と置換がほとんど不可能な多遺伝子性疾患の場合、戦略は保護因子の継続的な送達を目指しています。AMDの場合、エンドスタチンおよびアンジオスタチン20の安定発現、VEGFアンタゴニスト可溶性FMS様チロシンキナーゼ-1(sFLT-1)21,22、分化の補体調節タンパク質クラスター59(CD59)23またはPEDF 24,25など、様々な相加療法が開発されている。.眼、特に網膜は、密閉された構造、優れたアクセス可能性、小型、および免疫特権により、遺伝子ベースの薬物療法の優れた標的であり、したがって、低治療用量の局所的な送達を可能にし、移植片を拒絶反応の影響を受けにくくします。さらに、眼は非侵襲的なモニタリングを可能にし、網膜は異なるイメージング技術によって検査することができる。
ウイルスベクターは、その高い形質導入効率のために、治療遺伝子を標的細胞に送達するための主要な媒体である。しかしながら、使用されるウイルスベクターに応じて、免疫および炎症反応26、変異原性および発癌性効果27、28、または他の組織における播種29などの異なる有害反応が記載されている。実用的な制限には、制限されたパッケージサイズ30、および臨床グレードロット31,32の製造に関連する困難とコストが含まれます。これらの欠点は、リポ/ポリプレックス、超音波またはエレクトロポレーションを介して転送される非ウイルス性のプラスミドベースのベクターのさらなる開発を促進した。しかしながら、宿主ゲノムへの導入遺伝子のゲノム組み込みは、通常、プラスミドベクターでは促進されず、したがって一過性の発現をもたらす。
トランスポゾンは、ゲノム内での位置を変える天然に存在するDNA断片であり、遺伝子治療に採用されている特性です。能動統合機構により、トランスポゾンベースのベクターシステムは、挿入された導入遺伝子の連続的かつ一定の発現を可能にする。眠れる森の美女(SB)トランスポゾンは、魚33に見られる古代のTc1 /マリナー型トランスポゾンから再構成され、分子進化によってさらに改良され、活性亢進変異体SB100X34をもたらし、さまざまな初代細胞での効率的な転位を可能にし、さまざまな疾患モデル35の表現型補正に使用されました。現在、SBトランスポゾンシステムを用いて13件の臨床試験が開始されています。SB100Xトランスポゾンシステムは、末端反転リピート(TIR)に挟まれた目的の遺伝子からなるトランスポゾンと、トランスポゾンを動員するトランスポザースの2つのコンポーネントで構成されています。細胞へのプラスミドDNA送達に続いて、トランスポザーゼはTIRに結合し、トランスポゾンの切除および細胞のゲノムへの組み込みを触媒します。
私たちは、血管新生AMDの治療のための非ウイルス細胞ベースの相加療法を開発しました。このアプローチは、SB100Xトランスポゾンシステム36,37,38による初代色素上皮(PE)細胞へのPEDF遺伝子のエレクトロポレーションベースの挿入を含む。トランスポザーゼとPEDFの遺伝情報は別々のプラスミドで提供されるため、理想的なSB100X-PEDFトランスポゾン比の調整が可能になります。エレクトロポレーションは、ピペットベースのキャピラリートランスフェクションシステムを使用して行われ、電極間のギャップサイズを最大化し、表面積を最小限に抑えます。この装置は、広範囲の哺乳動物細胞において優れたトランスフェクション速度を達成することが示された39、40、41。小さな電極表面積は、均一な電界を提供し、電気分解42の様々な副作用を低減する。
トランスフェクトされた色素上皮細胞によって分泌されるPEDFの抗血管新生機能は、ヒト臍帯静脈内皮細胞の発芽、遊走、およびアポトーシスを分析する様々なin vitro実験で示された43。さらに、角膜新生血管のウサギモデル44およびCNV43,45,46のラットモデルにおけるPEDFトランスフェクト細胞の移植は、新生血管形成の低下を示した。
ここでは、キャピラリートランスフェクションシステムを用いたSB100Xトランスポゾンシステムを介して初代ヒトRPE細胞にPEDF遺伝子を安定的に挿入するための詳細なプロトコルについて説明します。トランスフェクトした細胞を21日間培養し、その後、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)によるPEDF遺伝子発現、およびイムノブロッティングおよび酵素結合免疫吸着アッセイによるPEDFタンパク質分泌の観点から分析しました(ELISA、図1)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

高齢化が進む社会では、神経変性疾患の発生率も高まっています。これまでのところ、病理学的メカニズムは十分に理解されていないため、定義された治療法の確立を妨げています。保護因子の発現を増加させるための細胞ベースの相加遺伝子治療は、加齢黄斑変性症(AMD)などの神経変性疾患を治療するための有望な選択肢と考えられています。眠れる森の 美女 (SB)トランスポゾンシステムを用いて、神経系の神経保護・抗血管新生タンパク質として特徴付けられる色素上皮由来因子(PEDF)をコードする遺伝子を初代ヒト色素上皮(PE)細胞のゲノムに安定的に発現させる方法を開発しました。初代PE細胞をヒトドナーの眼から単離し、培養中に維持した。コンフルエントに達した後、1 x 104 細胞を11 μLの再懸濁バッファーに懸濁し、30 ngの高活性 SB (SB100X)トランスポザーゼプラスミドと470 ngの PEDF トランスポゾンプラスミドを含む2 μLの精製溶液と組み合わせました。遺伝子組み換えは、以下のパラメータを用いて毛細管エレクトロポレーションシステムで行った:電圧1,100Vおよび幅20msの2つのパルス。トランスフェクトした細胞を、ウシ胎児血清を添加した培地を含む培養プレートに移した。抗生物質および抗真菌剤を最初の培地交換で添加した。トランスフェクションの成功は、独立して実施された実験で実証されました。定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は、 PEDF 導入遺伝子の発現の増加を示した。PEDF分泌は、イムノブロッティングによって評価され、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって定量されるように、有意に上昇し、安定したままであった。 SB100Xを介した導入は、PE細胞のゲノムへの安定したPEDF遺伝子組み込みを可能にし、AMDまたは他の網膜変性疾患を治療するための細胞ベースの遺伝子付加療法の開発に不可欠な PEDF の継続的な分泌を保証しました。さらに、 ヒトPE細胞へのPEDF トランスポゾンの組み込みプロファイルの分析は、ほぼランダムなゲノム分布を示しました。

初代ヒトRPE細胞の培養とエレクトロポレーション 我々は、動物起源の十分な数の初代RPE細胞の播種が、色素沈着した六角形の細胞の統合された単層への培養および成長を可能にすることを示した36、37、48。タイトジャンクションを形成し、食作用活性を示し、およびインビトロで特...

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Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

私たちは、 眠れる森の美女 (SB)トランスポゾンシステムを用いて色素上皮由来因子(PEDF)をコードする遺伝子をエレクトロポレーションすることにより、初代ヒト色素上皮細胞をトランスフェクトするプロトコルを開発しました。トランスフェクションの成功は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、イムノブロッティング、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって実証されました。

眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた初代ヒト色素上皮細胞のエレクトロポレーションに基づく遺伝子改変

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

この方法は、眠れる森の美女トランスポゾンシステムを用いた初代ヒト色素上皮細胞のエレクトロポレーションベースのトランスフェクションを実証し、導入遺伝子発現とタンパク質分泌の証拠となります。眠れる森の美女トランスポゾンシステムとエレクトロポレーションの組み合わせにより、初代ヒト色素上皮細胞の効率的なトランスフェクション、ならびに安定した持続的な導入遺伝子発現およびタンパク質分泌が可能になります。全体的な目的は、治療活性タンパク質の安定的かつ持続的な分泌を必要とする網膜変性疾患の治療のための細胞ベースの遺伝子付加療法を確立することです。手順を実演するのは、研究所の医療技術助手であるアン・フライアルデンホーフェンとアンティエ・シーファーです。初代ヒトRPE細胞エレクトロポレーション用のプラスミドDNAを調製するには、マイクロボリューム分光光度計を使用してプラスミドDNA含有量を定量し、10ミリモルのTris-HCLの濃度をマイクロリットルあたり250ナノグラムに調整します。SB100XトランスポザーゼプラスミドDNAの1マイクロリットルあたり250ナノグラムの1容量と、色素上皮由来因子トランスポゾンプラスミドDNAのマイクロリットルあたり250ナノグラムの16容量を混合します。得られた血漿混合物2マイクロリットルを氷上の滅菌1.5ミリリットルのセーフロックマイクロ遠心チューブに加え、バッファーチューブに3ミリリットルのバッファーを充填します 次に、カチッという音がするまでチューブをピペットステーションに挿入し、トランスフェクションデバイスを1, 100ボルト、20ミリ秒のパルス幅、および2つのパルスに設定します。エレクトロポレーションのために細胞を調製する。まず、位相差顕微鏡で初代RPE細胞培養の形態を確認し、増殖とコンフルエント性を評価します。細胞培養インキュベーター内で、ウェルあたり500マイクロリットルの0.05%トリプシンEDTAで細胞を7〜15分間処理します。細胞が剥離したら遠心分離により細胞を回収し、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁し、トランスフェクション反応あたり10〜4個の細胞アリコートを1〜10回遠心分離する。ペレットをチューブあたり11マイクロリットルのバッファーRに再懸濁し、調製したプラスミド混合物を2マイクロリットルずつ各チューブに加えます。トランスフェクションピペットのヘッドを10マイクロリットルのトランスフェクションチップに挿入し、クランプがピストンの取り付けステムを完全にピックアップし、細胞とプラスミド溶液をトランスフェクションチップにロードします。トランスフェクションピペットをピペットステーション内のバッファーチューブにカチッという音がするまで挿入し、startを押してエレクトロポレーションプロセスを開始します。トランスフェクション後、トランスフェクションピペットをピペットステーションから慎重に取り出し、直ちに細胞とプラスミド溶液を細胞培養プレートの調製ウェルにピペットで入れます。RPE細胞培養上清からhisタグ付き色素上皮由来因子融合タンパク質を精製した。まず、ベベルカットチップを使用して、サンプルあたり30マイクロリットルのニッケルNTAスラリーを1個集め、遠心分離によってニッケルNTA樹脂をペレット化します。ニッケルNTA樹脂を200マイクロリットルのOne Xインキュベーションバッファーで慎重に再懸濁し、追加の遠心分離で溶液を2回ペレット化します。2回目の遠心分離後、ニッケルNTA樹脂ペレットをサンプルあたり40マイクロリットルのFour Xインキュベーションバッファーで注意深く再懸濁します。次に、55マイクロリットルの前処理ニッケルNTAスラリーを260マイクロリットルのFour Xインキュベーションバッファーおよび900マイクロリットルの各トランスフェクトRPE細胞培養上清と混合します。混合物を室温のロッキングシェーカーで60分間インキュベートし、ニッケルNTA樹脂混合物を再びペレット化します。ペレットを175マイクロリットルのOne Xインキュベーションバッファーに注意深く再懸濁し、混合物をさらに2回遠心分離します。2回目の遠心分離後、ニッケルNTA樹脂ペレットを30マイクロリットルの溶出バッファーに注意深く再懸濁し、振とうしながら室温で20分間インキュベートし、サンプルを再度遠心分離します。次に、上清を注意深く収集し、精製タンパク質の西部血液分析のために2つのX SDSサンプルバッファーと混合します。ヒトドナーの目から単離された培養初代RPE細胞は、ドナーの年齢、死後の分離時間、または培養時間に関係なく、典型的な石畳の形態を示します。初代ヒトRPE細胞への短期間の電気パルスの適用。キャピラリートランスフェクションシステムを使用しても、上皮形態に悪影響はありません。トランスフェクトされた初代ヒトRPE細胞培養上清のウェスタン血液分析では、500日以上導入遺伝子サイレンシングなしで一貫したレベルで色素上皮由来因子分泌が示されています。連続的に実施されたトランスフェクションからの細胞培養培地のこの代表的な西洋血液分析で観察されるように、トランスフェクション後21日目に普遍的に高い色素上皮由来因子分泌率が観察されます。追求された培養では、長期的なPEDF分泌の上昇は少なくとも165日間続きます。さらに、ELISAベースの定量により、トランスフェクトされた初代ヒトRPE細胞における総色素上皮由来因子分泌が、それぞれの非トランスフェクト対照細胞と比較して20倍増加することが明らかになりました。この増加は、総PEDF発現が30倍以上に上昇した遺伝子発現レベルでも確認された。このプロトコルを試みる場合、形態がIn Vivo状態に対応する色素上皮細胞を使用することが重要です。また、気泡のないトランスフェクションチップに細胞溶液を吸い込むことを忘れないでください。安定にトランスフェクトされた細胞は、この細胞ベースの遺伝子付加療法の機能を検証するために、異なるEx VivoまたはIn vivoモデルで使用することができます。

Research

JoVE Journal

Medicine

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の同定<em&gt;眠れる森の美女</emリンカ媒介PCRを用いた固形腫瘍&gt;トランスポゾン挿入

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