Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av EUs syvende rammeprogram for forskning, teknologisk utvikling og demonstrasjon, tilskuddsavtale nr. 305134. Zsuzsanna Izsvák ble finansiert av Det europeiske forskningsrådet, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Forfatterne vil gjerne takke Anna Dobias og Antje Schiefer (Øyeavdelingen, Universitetssykehuset RWTH Aachen) for utmerket teknisk støtte, og Aachen Cornea Bank (Øyeavdelingen, Universitetssykehuset RWTH Aachen) for å gi den menneskelige donorøyne.

Donorøyne hos mennesker ble innhentet fra Aachen Cornea Bank ved Øyeavdelingen (Universitetssykehuset RWTH Aachen) etter å ha innhentet informert samtykke i samsvar med Helsinkideklarasjonens protokoller. Prosedyrer for innsamling og bruk av prøver fra mennesker er godkjent av institusjonens etiske komité.
1. Isolering av primære humane RPE-celler
<ol><li>Legg ut sterile verneklær og hansker. Plasser en steril drapering under en laminær strøm.</li>
	<li>Plasser sterile forberedelses...

I vårt prosjekt tar vi sikte på ikke-viral produksjon av genmodifiserte primære humane RPE-celler som kontinuerlig overuttrykker og utskiller en effektiv faktor for å bruke de transfiserte cellene som langsiktig terapeutisk for etablering og vedlikehold av et beskyttende miljø. Vi har etablert introduksjonen av genet som koder for PEDF, et allestedsnærværende uttrykt multifunksjonelt protein med antiangiogene og nevrobeskyttende funksjoner. Protokollen beskrevet her kan brukes til stabilt og reproduserbart transfe...

Avansert alder er beskrevet å være den viktigste risikoen for nevrodegenerative sykdommer. Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), en polygen sykdom som fører til alvorlig synstap hos pasienter eldre enn 60 år, tilhører de fire vanligste årsakene til blindhet og synshemming1 og forventes å øke til 288 millioner mennesker i 20402. Dysfunksjoner av retinalpigmentepitelet (RPE), et enkelt lag med tettpakkede celler som ligger mellom choriocapillaris og retinale fotoreceptorer, bidrar til patogenesen av AMD. RPE oppfyller flere oppgaver som er avgjørende for en normal retinal funksjon3 og utskiller en rekke vekstfaktorer og faktorer som er avgjørende for å opprettholde den strukturelle integriteten til netthinnen og choriocapillaris, og støtter dermed fotoreseptoroverlevelse og gir grunnlag for sirkulasjon og tilførsel av næringsstoffer.
I sunne øyne er pigmentepitelavledet faktor (PEDF) ansvarlig for å balansere effekten av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og beskytter nevroner mot apoptose, forhindrer endotelcelleproliferasjon og stabiliserer kapillærendotelet. Et forskjøvet VEGF-til-PEDEF-forhold er relatert til okulær neovaskularisering, som ble observert i dyremodeller4,5 samt i prøver av pasienter med koroidal neovaskularisering (CNV) på grunn av AMD og proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den forbedrede VEGF-konsentrasjonen er målet for dagens standardbehandling. Anti-VEGF-legemidlene bevacizumab, ranibizumab, aflibercept og senest brolucizumab forbedrer synsstyrken hos omtrent en tredjedel av CNV-pasientene eller rettere stabiliserer synet i 90% av tilfellene11,12,13. De hyppige, ofte månedlige, intravitreale injeksjonene bærer imidlertid risikoen for bivirkninger14, svekker pasientetterlevelsen og representerer en betydelig økonomisk byrde for helsevesenet15. Videre reagerer en viss prosentandel av pasientene (2% -20%) ikke eller reagerer bare dårlig på anti-VEGF-terapien16,17,18,19. Disse negative sammenhengene nødvendiggjør utvikling av alternative behandlinger, f.eks. intraokulære implantater, celle- og/eller genterapeutiske tilnærminger.
Genterapi har utviklet seg som lovende behandling for arvelige og ikke-arvelige sykdommer og har til hensikt å gjenopprette ikke-funksjonelle gensekvenser eller undertrykke funksjonsfeil. For polygene sykdommer, hvor identifisering og erstatning av årsaksfaktorene knapt er mulig, tar strategier sikte på kontinuerlig levering av en beskyttende faktor. Når det gjelder AMD, er det utviklet forskjellige additive terapier, for eksempel stabilt ekspresjon av endostatin og angiostatin 20, VEGF-antagonisten løselig fms-lignende tyrosinkinase-1 (sFLT-1) 21,22, komplementregulerende proteinklynge av differensiering 59 (CD59) 23 eller PEDF 24,25 . Øyet, og spesielt netthinnen, er et utmerket mål for en genbasert medisinering på grunn av den lukkede strukturen, god tilgjengelighet, liten størrelse og immunprivilegi, noe som muliggjør en lokalisert levering av lave terapeutiske doser og gjør transplantasjoner mindre utsatt for avvisning. Videre muliggjør øyet ikke-invasiv overvåking, og netthinnen kan undersøkes ved hjelp av forskjellige bildebehandlingsteknikker.
Virale vektorer er, på grunn av deres høye transduksjonseffektivitet, det viktigste kjøretøyet for å levere terapeutiske gener til målceller. Avhengig av hvilken virusvektor som brukes, er det imidlertid beskrevet forskjellige bivirkninger, for eksempel immun- og inflammatoriske responser26, mutagene og onkogene effekter 27,28 eller spredning i andre vev29. Praktiske begrensninger inkluderer en begrenset emballasjestørrelse30, samt vanskeligheter og kostnader forbundet med produksjon av kliniske partier31,32. Disse ulempene har fremmet videreutvikling av ikke-virale, plasmidbaserte vektorer som overføres via lipo- / polyplexer, ultralyd eller elektroporering. Imidlertid blir genomisk integrasjon av transgenet i vertsgenomet vanligvis ikke fremmet med plasmidvektorer, noe som resulterer i et forbigående uttrykk.
Transposoner er naturlig forekommende DNA-fragmenter som endrer sin posisjon i genomet, en egenskap som er vedtatt for genterapi. På grunn av en aktiv integrasjonsmekanisme tillater transposonbaserte vektorsystemer et kontinuerlig og konstant uttrykk for det innsatte transgenet. Tornerosetransposonen, rekonstituert fra en gammel Tc1/mariner-type transposon funnet i fisk 33 og ytterligere forbedret ved molekylær evolusjon som resulterte i den hyperaktive varianten SB100X34, muliggjorde effektiv transposisjon i forskjellige primærceller og ble brukt til fenotypisk korreksjon i forskjellige sykdomsmodeller 35. For tiden er 13 kliniske studier initiert ved bruk av SB transposon-systemet. SB100X transposon-systemet består av to komponenter: transposonet, som består av genet av interesse flankert av terminale inverterte repetisjoner (TIR), og transposasen, som mobiliserer transposonet. Etter plasmid-DNA-levering til cellene binder transposasen TIR-ene og katalyserer eksisjonen og integrasjonen av transposonet i cellens genom.
Vi har utviklet en ikke-viral cellebasert additiv terapi for behandling av neovaskulær AMD. Tilnærmingen omfatter elektroporeringsbasert innsetting av PEDF-genet i primære pigmentepitelceller (PE) ved hjelp av SB100X transposonsystemet36,37,38. Den genetiske informasjonen til transposasen og PEDF er gitt på separate plasmider, og muliggjør dermed justering av det ideelle SB100X-til-PEDF transposonforholdet. Elektroporering utføres ved hjelp av et pipettebasert kapillærtransfeksjonssystem som er preget av en maksimert gapstørrelse mellom elektrodene samtidig som overflatearealet minimeres. Enheten ble vist å oppnå gode transfeksjonshastigheter i et bredt spekter av pattedyrceller 39,40,41. Den lille elektrodeoverflaten gir et jevnt elektrisk felt og reduserer de ulike bivirkningene av elektrolyse42.
Den anti-angiogene funksjonaliteten til PEDF utskilt av transfekterte pigmentepitelceller ble vist i forskjellige in vitro-eksperimenter som analyserte spiring, migrasjon og apoptose av humane navlestrengendotelceller43. I tillegg viste transplantasjon av PEDF-transfekterte celler i en kaninmodell av hornhinnen neovaskularisering44 samt en rottemodell av CNV43,45,46 nedgang i neovaskularisering.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for stabil innsetting av PEDF-genet i primære humane RPE-celler via SB100X transposon-systemet ved hjelp av et kapillærtransfeksjonssystem. De transfiserte cellene ble holdt i kultur i 21 dager og deretter analysert i form av PEDF-genuttrykk ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) og i form av PEDF-proteinsekresjon ved immunoblotting og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA, figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

Vårt stadig aldrende samfunn fører til en økende forekomst av nevrodegenerative sykdommer. Så langt er de patologiske mekanismene utilstrekkelig forstått, og hindrer dermed etableringen av definerte behandlinger. Cellebaserte additive genterapier for økt ekspresjon av en beskyttende faktor anses som et lovende alternativ for å medisinere nevrodegenerative sykdommer, for eksempel aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). Vi har utviklet en metode for stabilt uttrykk av genet som koder for pigmentepitel-avledet faktor (PEDF), som er karakterisert som et nevrobeskyttende og antiangiogent protein i nervesystemet, inn i genomet til primære humane pigmentepitelceller (PE) ved hjelp av Tornerose (SB) transposonsystemet. Primære PE-celler ble isolert fra menneskelige donorøyne og opprettholdt i kultur. Etter å ha nådd sammenløp ble 1 x 104 celler suspendert i 11 μL resuspenderingsbuffer og kombinert med 2 μL av en renset løsning inneholdende 30 ng hyperaktiv SB (SB100X) transposaseplasmid og 470 ng PEDF transposon plasmid. Genmodifisering ble utført med et kapillær elektroporeringssystem ved bruk av følgende parametere: to pulser med en spenning på 1.100 V og en bredde på 20 ms. Transfiserte celler ble overført til kulturplater som inneholdt medium supplert med føtalt bovint serum; Antibiotika og antimykotika ble tilsatt ved første medium utveksling. Vellykket transfeksjon ble demonstrert i uavhengig utførte eksperimenter. Kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) viste økt ekspresjon av PEDF-transgenet . PEDF-sekresjonen var signifikant forhøyet og forble stabil, evaluert ved immunblotting, og kvantifisert ved enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). SB100X-mediert overføring tillot en stabil PEDF-genintegrasjon i genomet til PE-celler og sikret kontinuerlig sekresjon av PEDF , noe som er kritisk for utviklingen av en cellebasert gentilskuddsterapi for å behandle AMD eller andre retinale degenerative sykdommer. Videre indikerte analyse av integrasjonsprofilen til PEDF-transposonet til humane PE-celler en nesten tilfeldig genomisk fordeling.

Dyrking og elektroporering av primære humane RPE-celler Vi har vist at såing av et tilstrekkelig antall primære RPE-celler av animalsk opprinnelse muliggjør dyrking og vekst til et integrert monolag av pigmenterte, sekskantede celler36,37,48. Deres evne til å danne tette kryss, å utvise fagocytisk aktivitet og å uttrykke spesifikke markørgener in vitro<sup class="xref"...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Vi har utviklet en protokoll for å transfektere primære humane pigmentepitelceller ved elektroporering med genet som koder for pigmentepitelavledet faktor (PEDF) ved hjelp av Tornerose (SB) transposonsystemet. Vellykket transfeksjon ble demonstrert ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), immunoblotting og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).

Elektroporeringsbasert genetisk modifisering av primære humane pigmentepitelceller ved bruk av Tornerose Transposon-systemet

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Denne metoden demonstrerer elektroporeringsbasert transfeksjon av primære humane pigmentepitelceller ved hjelp av Tornerose Transposon System, et bevis for transgenuttrykk og proteinsekresjon. Kombinasjonen av Tornerose Transposon System og elektroporering muliggjør effektiv transfeksjon av primære humane pigmentepitelceller, samt stabil og vedvarende transgene ekspresjon og proteinsekresjon. Det overordnede målet er å etablere en cellebasert gentilskuddsterapi for behandling av retinale degenerative sykdommer, som krever stabil og vedvarende sekresjon av det terapeutisk aktive proteinet.Demonstrasjon av prosedyren vil være Anne Freialdenhoven og Antje Schiefer, medisinske tekniske assistenter fra laboratoriet. For å forberede Plasmid DNA for primær human RPE-celleelektroporering, bruk et mikrovolumspektrofotometer for å kvantifisere Plasmid DNA-innholdet, og juster konsentrasjonen til 250 nanogram per mikroliter i 10 millimolar Tris-HCL. Bland ett volum på 250 nanogram per mikroliter SB100X transposase Plasmid DNA med 16 volumer på 250 nanogram per mikroliter pigmentepitelavledet faktor transposon Plasmid DNA.Tilsett to mikroliter av den resulterende plasmablandingen i et sterilt 1,5 milliliter sikkert lås mikrosentrifugerør på is og fyll et bufferrør med tre milliliter buffer E.Sett deretter røret inn i pipettestasjonen til et klikk høres og sett transfeksjonsanordningen til 1.100 volt, en pulsbredde på 20 millisekunder og to pulser. For å forberede cellene for elektroporering. Kontroller først morfologien til de primære RPE-cellekulturene via fasekontrastmikroskopi for å vurdere vekst og sammenløp.Behandle cellene med 500 mikroliter 0,05% Trypsin EDTA per brønn i syv til 15 minutter i cellekulturinkubatoren. Når cellene har løsnet samle cellene ved sentrifugering, resuspend cellene i en milliliter PBS og sentrifuge en til 10 ganger 10 til de fire celle aliquots per transfeksjon reaksjon. Resuspend pellets i 11 mikroliter buffer R per rør og tilsett to mikroliter av den fremstilte plasmidblandingen til hvert rør.Sett hodet på en transfeksjonspipette inn i en 10 mikroliter transfeksjonsspiss til klemmen helt plukker opp monteringsstammen til stempelet og last celle- og plasmidløsningen inn i transfeksjonsspissen. Sett transfeksjonspipetten inn i bufferrøret som er plassert i pipettestasjonen til et klikk høres, og trykk på start for å starte elektroporeringsprosessen. Etter transfeksjonen fjern forsiktig transfeksjonspipetten fra pipettestasjonen og pipetter umiddelbart cellen og plasmidoppløsningen inn i de forberedte brønnene på cellekulturplaten.For å rense hans merkede pigmentepitelavledede faktorfusjonsproteiner fra RPE-cellekultursupernatanter. Bruk først en skråskåret spiss for å samle en 30 mikroliter aliquot nikkel NTA-oppslemming per prøve og pellet nikkel NTA-harpiksen ved sentrifugering. Resuspend nikkel NTA-harpiksen forsiktig med 200 mikroliter One X-inkubasjonsbuffer og pellets løsningen med en ekstra sentrifugering to ganger.Etter den andre sentrifugeringen, forsiktig resuspendere nikkel NTA harpiks pellets med 40 mikroliter Four X inkubasjonsbuffer per prøve. Deretter blandes 55 mikroliter av en aliquot av forbehandlet nikkel NTA slurry med 260 mikroliter Four X inkubasjonsbuffer og 900 mikroliter av hver transefcted RPE cellekultur supernatant. Inkuber blandingen på en gyngerisker ved romtemperatur i 60 minutter og pellet nikkel NTA-harpiksblandingene igjen.Resuspend pellets forsiktig i 175 mikroliter One X-inkubasjonsbuffer og sentrifuger blandingene to ganger til. Etter den andre sentrifugeringen forsiktig resuspendere nikkel NTA harpiks pellets i 30 mikroliter Elution buffer for en 20 minutters inkubasjon ved romtemperatur med risting og sentrifuge prøvene igjen. Samle deretter supernatantene forsiktig og bland dem med to X SDS-prøvebuffer for vestlig blodanalyse av de rensede proteinene.Kultiverte primære RPE-celler isolert fra menneskelige donorøyne viser en typisk brosteinsmorfologi uavhengig av donorens alder, postmortem isolasjonstid eller dyrkingstid. Anvendelsen av kortsiktige elektriske pulser til primære menneskelige RPE-celler. Bruk av kapillærtransfeksjonssystemet påvirker ikke epitelmorfologien negativt.Vestlig blodanalyse av transfekterte primære humane RPE-cellekultursupernatanter demonstrerer pigmentepitelavledet faktorsekresjon på konsistente nivåer uten transgen silencing i mer enn 500 dager. Som observert i denne representative vestlige blodanalysen av cellekulturmedium fra serielt utførte transfeksjoner, observeres en universelt høyere pigmentepitelavledet faktorsekresjonshastighet 21 dager etter transfeksjon. I en forfulgt kultur varer langvarig forhøyet PEDF-sekresjon i minst 165 dager.I tillegg viser ELISA-basert kvantifisering en 20 ganger økning av total pigmentepitelavledet faktorsekresjon i transfiserte primære humane RPE-celler sammenlignet med respektive ikke-transfiserte kontrollceller. Denne økningen ble også bekreftet på genuttrykksnivået der det totale PEDF-uttrykket ble hevet mer enn 30 ganger. Når du prøver denne protokollen, er det viktig å bruke pigmentepitelceller hvis morfologi tilsvarer In Vivo-statusen.Husk også å trekke opp celleoppløsningen i transfeksjonsspissen uten luftbobler. De stabilt transfiserte cellene kan brukes i forskjellige Ex Vivo- eller In vivo-modeller for å verifisere funksjonaliteten til denne cellebaserte gentilskuddsterapien.

Research

JoVE Journal

Medicine

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Skin Punch Biopsi Eksplantering Kultur for Utledning av primære humane fibroblaster

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifisering av<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Transposon Innsettinger i solide svulster ved hjelp Linker-mediert PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse Imaging av Primary Preneoplastic mammary epitelceller Avledet fra genmodifisert mus modeller av Breast Cancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolasjon, Kryopreservering og kultur menneskerettighets amnion Epitelceller for kliniske anvendelser

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Utføre subretinal injeksjoner i Gnagere å levere retinal pigment epitelet Cells i Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En organotypiske høy gjennomstrømning System for Karakterisering av Drug Sensitivity of Primary myelomatose Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Induksjon av akselerert aterosklerose hos mus: "Wire-Injury" Modell

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolering av primære Decidual menneskeceller fra fosterets membraner av begrepet Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisering av endogene Mitophagy komplekser in situ i Human bukspyttkjertelen beta Cells utnytte nærhet ligation analysen

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer

Måling av karotenoider i Perifovea ved bruk av makulær pigmentreflektor

The macular pigment reflectometer (MPR) objectively measures the overall macular pigment optical density (MPOD) and further provides the lutein optical ...