Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Sétimo Programa-Quadro de Investigação, Desenvolvimento Tecnológico e Demonstração da União Europeia, convenção de subvenção n.º 305134. Zsuzsanna Izsvák foi financiada pelo Conselho Europeu de Investigação, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Os autores gostariam de agradecer a Anna Dobias e Antje Schiefer (Departamento de Oftalmologia, Hospital Universitário RWTH Aachen) pelo excelente suporte técnico, e ao Aachen Cornea Bank (Departamento de Oftalmologia, Hospital Universitário RWTH Aachen) por fornecer os olhos do doador humano.

Os olhos dos doadores humanos foram obtidos do Aachen Cornea Bank do Departamento de Oftalmologia (Hospital Universitário RWTH Aachen) após a obtenção do consentimento informado de acordo com os protocolos da Declaração de Helsinque. Os procedimentos para a coleta e uso de amostras humanas foram aprovados pelo comitê de ética institucional.
1. Isolamento das células primárias de EPR humanas
<ol><li>Coloque roupas de proteção estéreis e luvas. Coloque uma cortina estéril sob um ...

Em nosso projeto, visamos a produção não viral de células primárias geneticamente modificadas de PSE humanas que continuamente superexpressam e secretam um fator eficaz, a fim de usar as células transfectadas como terapêuticas de longo prazo para o estabelecimento e manutenção de um ambiente protetor. Estabelecemos a introdução do gene que codifica o PEDF, uma proteína multifuncional onipresente e expressa com funções antiangiogênicas e neuroprotetoras. O protocolo descrito aqui pode ser usado para transfe...

A idade avançada é descrita como o principal risco para doenças neurodegenerativas. A degeneração macular relacionada à idade (DMRI), uma doença poligênica que leva à perda de visão grave em pacientes com mais de 60 anos de idade, pertence às quatro causas mais comuns de cegueira e deficiência visual1 e espera-se que aumente para 288 milhões de pessoas em 20402. Disfunções do epitélio pigmentar da retina (EPR), uma única camada de células bem compactadas localizadas entre o coriocapilar e os fotorreceptores da retina, contribuem para a patogênese da DMRI. O PSE cumpre múltiplas tarefas que são essenciais para uma função retiniana normal3 e secreta uma variedade de fatores de crescimento e fatores essenciais para manter a integridade estrutural da retina e do coriocapilar, apoiando assim a sobrevivência dos fotorreceptores e fornecendo uma base para a circulação e o fornecimento de nutrientes.
Em olhos saudáveis, o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) é responsável por equilibrar os efeitos do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e protege os neurônios contra a apoptose, previne a proliferação de células endoteliais e estabiliza o endotélio capilar. Uma relação VEGF-para-PEDF deslocada está relacionada à neovascularização ocular, o que foi observado em modelos animais4,5, bem como em amostras de pacientes com neovascularização da coroide (NVC) por DMRI e retinopatia diabética proliferativa 6,7,8,9,10 . A concentração aumentada de VEGF é o alvo para o tratamento padrão atual. Os fármacos anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept e, mais recentemente, brolucizumab melhoram a acuidade visual em cerca de um terço dos pacientes com NVC, ou melhor, estabilizam a visão em 90% dos casos11,12,13. No entanto, as injeções intravítreas frequentes, muitas vezes mensais, acarretam o risco de eventos adversos14, prejudicam a adesão do paciente e representam um ônus econômico significativo para os sistemas de saúde15. Além disso, certa porcentagem de pacientes (2%-20%) não responde ou apenas reage mal à terapia anti-VEGF16,17,18,19. Esses concomitantes negativos requerem o desenvolvimento de tratamentos alternativos, por exemplo, implantes intraoculares, abordagens terapêuticas celulares e/ou genéticas.
A terapia gênica tem evoluído como tratamento promissor para doenças hereditárias e não hereditárias e pretende restaurar sequências gênicas não funcionais ou suprimir as de mau funcionamento. Para doenças poligênicas, onde a identificação e a substituição dos fatores causadores dificilmente são possíveis, as estratégias visam a entrega contínua de um fator protetor. No caso da DMRI, várias terapias aditivas têm sido desenvolvidas, como a expressão estável de endostatina e angiostatina20, o antagonista do VEGF solúvel fms-like tirosina quinase-1 (sFLT-1)21,22, o cluster de proteínas reguladoras do complemento de diferenciação 59 (CD59)23 ou o PEDF 24,25 . O olho, e especialmente a retina, é um excelente alvo para uma medicação baseada em genes devido à estrutura fechada, boa acessibilidade, tamanho pequeno e privilégio imunológico, permitindo assim uma entrega localizada de baixas doses terapêuticas e tornando os transplantes menos suscetíveis à rejeição. Além disso, o olho permite o monitoramento não invasivo, e a retina pode ser examinada por diferentes técnicas de imagem.
Os vetores virais são, devido à sua alta eficiência de transdução, o principal veículo para entregar genes terapêuticos nas células-alvo. Entretanto, dependendo do vetor viral utilizado, diferentes reações adversas têm sido descritas, como respostas imunes e inflamatórias26, efeitos mutagênicos e oncogênicos 27,28 ou disseminação em outros tecidos29. As limitações práticas incluem um tamanho de embalagem restrito30, bem como dificuldades e custos associados à produção de lotes de grau clínico31,32. Essas desvantagens promoveram o desenvolvimento de vetores não virais, baseados em plasmídeos, que são transferidos via lipo / poliplexos, ultrassom ou eletroporação. No entanto, a integração genômica do transgene no genoma do hospedeiro geralmente não é promovida com vetores plasmídicos, resultando em uma expressão transitória.
Transposons são fragmentos de DNA de ocorrência natural que mudam sua posição dentro do genoma, uma característica que foi adotada para a terapia gênica. Devido a um mecanismo de integração ativa, os sistemas vetoriais baseados em transposon permitem uma expressão contínua e constante do transgene inserido. O transposon da Bela Adormecida (SB), reconstituído a partir de um antigo transposon do tipo Tc1/marinheiro encontrado em peixes33 e melhorado pela evolução molecular resultando na variante hiperativa SB100X34, possibilitou uma transposição eficiente em várias células primárias e foi utilizado para a correção fenotípica em diferentes modelos de doenças35. Atualmente, 13 ensaios clínicos foram iniciados usando o sistema de transposição SB . O sistema de transposon SB100X consiste em dois componentes: o transposon, que compreende o gene de interesse ladeado por repetições invertidas terminais (TIRs), e a transposase, que mobiliza o transposon. Após a entrega do DNA plasmídico às células, a transposase se liga aos TIRs e catalisa a excisão e a integração do transposon no genoma da célula.
Desenvolvemos uma terapia aditiva não viral baseada em células para o tratamento da DMRI neovascular. A abordagem compreende a inserção baseada em eletroporação do gene PEDF em células epiteliais pigmentares primárias (PE) por meio do sistema de transposon SB100X 36,37,38. A informação genética da transposase e do PEDF é fornecida em plasmídeos separados, permitindo assim o ajuste da razão de transposição ideal SB100X-para-PEDF. A eletroporação é realizada usando um sistema de transfecção capilar baseado em pipeta que é caracterizado por um tamanho de folga maximizado entre os eletrodos, minimizando sua área de superfície. O dispositivo demonstrou atingir excelentes taxas de transfecção em uma ampla gama de células de mamíferos 39,40,41. A pequena área de superfície do eletrodo proporciona um campo elétrico uniforme e reduz os vários efeitos colaterais da eletrólise42.
A funcionalidade antiangiogênica do PEDF secretado por células epiteliais pigmentares transfectadas foi demonstrada em vários experimentos in vitro analisando a brotação, migração e apoptose de células endoteliais da veia umbilical humana43. Além disso, o transplante de células transfectadas por PEDF em um modelo de neovascularização corneana de coelho44 e em um modelo de rato de CNV43,45,46 mostrou declínio da neovascularização.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a inserção estável do gene PEDF em células primárias de EPR humanas através do sistema de transposon SB100X usando um sistema de transfecção capilar. As células transfectadas foram mantidas em cultura por 21 dias e, posteriormente, analisadas em termos de expressão gênica de PEDF por reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR) e em termos de secreção de proteína PEDF por imunoblotting e ensaio imunoenzimático (ELISA, Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

Nossa sociedade cada vez mais envelhecida leva a uma incidência crescente de doenças neurodegenerativas. Até o momento, os mecanismos patológicos são inadequadamente compreendidos, impedindo assim o estabelecimento de tratamentos definidos. Terapias genéticas aditivas baseadas em células para o aumento da expressão de um fator protetor são consideradas uma opção promissora para medicar doenças neurodegenerativas, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Desenvolvemos um método para a expressão estável do gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF), que é caracterizado como uma proteína neuroprotetora e antiangiogênica no sistema nervoso, no genoma das células epiteliais primárias do pigmento humano (PE) usando o sistema transposon da Bela Adormecida (SB). As células primárias de EP foram isoladas dos olhos do doador humano e mantidas em cultura. Após atingir a confluência, 1 x 104 células foram suspensas em 11 μL de tampão de ressuspensão e combinadas com 2 μL de uma solução purificada contendo 30 ng de plasmídeo de transposase SB hiperativo (SB100X) e 470 ng de plasmídeo transposon PEDF . A modificação genética foi realizada com um sistema de eletroporação capilar utilizando os seguintes parâmetros: dois pulsos com tensão de 1.100 V e largura de 20 ms. As células transfectadas foram transferidas para placas de cultura contendo meio suplementado com soro fetal bovino; antibióticos e antimicóticos foram adicionados com a primeira troca média. A transfecção bem-sucedida foi demonstrada em experimentos realizados de forma independente. A reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR) mostrou o aumento da expressão do transgene PEDF . A secreção de PEDF foi significativamente elevada e permaneceu estável, avaliada por imunoblotting, e quantificada por ensaio imunoenzimático (ELISA). A transferência mediada por SB100X permitiu uma integração estável do gene PEDF no genoma das células PE e garantiu a secreção contínua de PEDF, o que é crítico para o desenvolvimento de uma terapia de adição genética baseada em células para tratar a DMRI ou outras doenças degenerativas da retina. Além disso, a análise do perfil de integração do transposon do PEDF em células de EP humanas indicou uma distribuição genômica quase aleatória.

Cultivo e eletroporação de células primárias de EPR humanas Mostramos que a semeadura de um número suficiente de células primárias de EPR de origem animal permite o cultivo e o crescimento para uma monocamada integrada de células pigmentadas de forma hexagonal36,37,48. Sua capacidade de formar junções apertadas, exibir atividade fagocítica e expressar genes marcador...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Desenvolvemos um protocolo para transfectar células epiteliais primárias de pigmento humano por eletroporação com o gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) usando o sistema de transposon da Bela Adormecida (SB). A transfecção bem-sucedida foi demonstrada pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR), immunoblotting e ensaio imunoenzimático (ELISA).

Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Este método demonstra a transfecção baseada em eletroporação de células epiteliais primárias de pigmento humano usando o Sistema de Transposon da Bela Adormecida, uma evidência para a expressão transgênica e secreção de proteínas. A combinação do Sistema de Transposon da Bela Adormecida e da eletroporação permite a transfecção eficiente de células epiteliais primárias de pigmento humano, bem como a expressão transgênica estável e persistente e a secreção de proteínas. O objetivo geral é estabelecer uma terapia de adição genética baseada em células para o tratamento de doenças degenerativas da retina, que requer secreção estável e persistente da proteína terapeuticamente ativa.Demonstrando o procedimento estarão Anne Freialdenhoven e Antje Schiefer, assistentes médicos técnicos do laboratório. Para preparar o DNA plasmídico para a eletroporação primária de células RPE humanas, use um espectrofotômetro de microvolume para quantificar o conteúdo de DNA plasmídico e ajuste a concentração para 250 nanogramas por microlitro em Tris-HCL 10 milimolares. Misture um volume de 250 nanogramas por microlitro de DNA plasmídico da transposase SB100X com 16 volumes de 250 nanogramas por microlitro de fator derivado do epitélio pigmentar transposon DNA plasmídico.Adicione dois microlitros da mistura de plasma resultante em um tubo de microcentrífuga de bloqueio seguro estéril de 1,5 mililitros no gelo e encha um tubo tampão com três mililitros de buffer E.Em seguida, insira o tubo na estação de pipeta até que um clique seja ouvido e defina o dispositivo de transfecção para 1, 100 volts, uma largura de pulso de 20 milissegundos e dois pulsos. Para preparar as células para eletroporação. Primeiro, verifique a morfologia das culturas primárias de células de PSE via microscopia de contraste de fase para avaliar seu crescimento e confluência.Trate as células com 500 microlitros de 0,05% de tripsina EDTA por poço por sete a 15 minutos na incubadora de cultura celular. Quando as células tiverem se desprendido, coletem as células por centrifugação, ressuspenda as células em um mililitro de PBS e centrifugar de uma a 10 vezes 10 para as quatro alíquotas celulares por reação de transfecção. Ressuscite os pellets em 11 microlitros de tampão R por tubo e adicione dois microlitros da mistura plasmídica preparada a cada tubo.Insira a cabeça de uma pipeta de transfecção em uma ponta de transfecção de 10 microlitros até que a braçadeira pegue totalmente a haste de montagem do pistão e carregue a célula e a solução plasmídica na ponta de transfecção. Insira a pipeta de transfecção no tubo tampão colocado dentro da estação de pipeta até que um clique seja ouvido e pressione start para iniciar o processo de eletroporação. Após a transfecção, remova cuidadosamente a pipeta de transfecção da estação de pipeta e imediatamente pipete a célula e a solução plasmídica para os poços preparados da placa de cultura celular.Para purificar suas proteínas de fusão de fator derivado do epitélio pigmentar de sobrenadantes de cultura de células RPE. Primeiro, use uma ponta de corte chanfrado para coletar uma alíquota de 30 microlitros de pasta NTA de níquel por amostra e pellet a resina NTA de níquel por centrifugação. Ressuscite cuidadosamente a resina NTA de níquel com 200 microlitros de tampão de incubação One X e retire a solução com uma centrifugação adicional duas vezes.Após a segunda centrifugação, ressuscite cuidadosamente os pellets de resina NTA de níquel com 40 microlitros de tampão de incubação Four X por amostra. Em seguida, misture 55 microlitros de uma alíquota de pasta de níquel NTA pré-tratada com 260 microlitros de tampão de incubação Four X e 900 microlitros de cada sobrenadante de cultura de células RPE transefcted. Incubar a mistura num agitador de balanço à temperatura ambiente durante 60 minutos e repeltar as misturas de resina NTA de níquel.Ressuscite cuidadosamente os pellets em 175 microlitros de tampão de incubação One X e centrifugar as misturas mais duas vezes. Após a segunda centrifugação, ressuspenda cuidadosamente os pellets de resina NTA de níquel em 30 microlitros de tampão de eluição por uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente com agitação e centrifugação das amostras novamente. Em seguida, colete cuidadosamente os sobrenadantes e misture-os com o tampão de amostra Two X SDS para análise do sangue ocidental das proteínas purificadas.Células primárias de PSE cultivadas isoladas de olhos de doadores humanos demonstram uma morfologia típica de paralelepípedos, independentemente da idade do doador, tempo post-mortem de isolamento ou tempo de cultivo. A aplicação de pulsos elétricos de curto prazo a células primárias de EPR humanas. O uso do sistema de transfecção capilar não afeta negativamente a morfologia epitelial.A análise sanguínea ocidental de sobrenadantes primários transfectados de cultura de células de PSE humana demonstram secreção de fator derivado do epitélio pigmentar em níveis consistentes sem silenciamento transgênico por mais de 500 dias. Como observado nesta análise sanguínea ocidental representativa do meio de cultura celular de transfecções realizadas em série, uma taxa de secreção de fator derivado do epitélio pigmentar universalmente maior é observada em 21 dias após a transfecção. Em uma cultura seguida, a secreção elevada de PEDF a longo prazo dura pelo menos 165 dias.Além disso, a quantificação baseada em ELISA revela um aumento de 20 vezes da secreção do fator derivado do epitélio pigmentar total em células RPE humanas primárias transfectadas em comparação com as respectivas células de controle não transfectadas. Esse incremento também foi afirmado no nível de expressão gênica em que a expressão total do PEDF foi aumentada mais de 30 vezes. Ao tentar este protocolo, é importante usar células epiteliais pigmentares cuja morfologia corresponda ao status In Vivo.Além disso, lembre-se de extrair a solução celular na ponta de transfecção sem bolhas de ar. As células transfectadas de forma estável podem ser usadas em diferentes modelos Ex Vivo ou In vivo para verificar a funcionalidade desta terapia de adição de genes baseada em células.

Research

JoVE Journal

Medicine

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Pele da biópsia Explant Cultura para Derivação de primárias fibroblastos humanos

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Medicina

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identificação de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Inserções de transposões em tumores sólidos utilizando Linker mediada por PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Lapso de tempo de imagem de pré-neoplásicas primárias células epiteliais mamárias derivados de modelos de rato geneticamente modificado do cancro da mama

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolamento, criopreservação e cultivo de células epiteliais humanas Amnion para aplicações clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Realizando Subretinal Injeções em roedores para entregar epitélio pigmentar da retina células em suspensão

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Um Sistema Organotípicas alta taxa de transferência para Caracterização de Drogas de sensibilidade de células de mieloma múltiplo primárias

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Indução de Aterosclerose Acelerada em Camundongos: O Modelo de "Lesão por Fio"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolamento de células humanas primárias do Decidual de membranas fetais de termo placentas

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualização de complexos de Mitophagy endógenos in situ em células beta pancreáticas humanas utilizando o ensaio de ligadura de proximidade

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer

Medição de Carotenoides em Perifovea usando o Refletor de Pigmento Macular

The macular pigment reflectometer (MPR) objectively measures the overall macular pigment optical density (MPOD) and further provides the lutein optical ...