Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Эта работа была поддержана Седьмой рамочной программой Европейского союза по исследованиям, технологическим разработкам и демонстрации, грантовым соглашением No 305134. Zsuzsanna Izsvák финансировалась Европейским исследовательским советом ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Авторы хотели бы поблагодарить Анну Добиас и Антье Шифер (отделение офтальмологии, университетская клиника RWTH Aachen) за отличную техническую поддержку, а также Aachen Cornea Bank (отделение офтальмологии, университетская клиника RWTH Aachen) за предоставление человеческим донорским глазам.

Человеческие донорские глаза были получены из банка ахенской роговицы отделения офтальмологии (Университетская клиника RWTH Aachen) после получения информированного согласия в соответствии с Хельсинкской декларацией протоколов. Процедуры сбора и использования образцов человека были од?...

В нашем проекте мы стремимся к невирусному производству генетически модифицированных первичных клеток RPE человека, которые постоянно сверхэкспрессируют и секретируют эффективный фактор, чтобы использовать трансфектированные клетки в качестве долгосрочного терапевтического средст...

Пожилой возраст описывается как основной риск нейродегенеративных заболеваний. Возрастная макулярная дегенерация (ВМД), полигенное заболевание, приводящее к тяжелой потере зрения у пациентов старше 60 лет, относится к четырем наиболее распространенным причинам слепоты и нарушения зрения1 и, как ожидается, увеличится до 288 миллионов человек в 2040году 2. Дисфункции пигментного эпителия сетчатки (RPE), одного слоя плотно упакованных клеток, расположенных между хориокапиллярами и фоторецепторами сетчатки, способствуют патогенезу ВМД. RPE выполняет множество задач, которые необходимы для нормальной функции сетчатки3 , и выделяет различные факторы роста и факторы, необходимые для поддержания структурной целостности сетчатки и хориокапилляра, тем самым поддерживая выживание фоторецепторов и обеспечивая основу для циркуляции и снабжения питательными веществами.
В здоровых глазах фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF), отвечает за балансировку эффектов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и защищает нейроны от апоптоза, предотвращает пролиферацию эндотелиальных клеток и стабилизирует капиллярный эндотелий. Смещенное отношение VEGF к PEDF связано с глазной неоваскуляризацией, которая наблюдалась на животных моделях 4,5, а также в образцах пациентов с хориоидальной неоваскуляризацией (CNV) из-за ВМД и пролиферативной диабетической ретинопатии 6,7,8,9,10 . Повышенная концентрация VEGF является мишенью для текущего стандартного лечения. Анти-VEGF фармацевтические препараты бевацизумаб, ранибизумаб, афлиберцепт и, совсем недавно, бролуцизумаб улучшают остроту зрения примерно у одной трети пациентов с ХНВ или, скорее, стабилизируют зрение в 90% случаев 11,12,13. Однако частые, часто ежемесячные, интравитреальные инъекции несут риск нежелательных явлений14, ухудшают соблюдение пациентами и представляют собой значительную экономическую нагрузку для систем здравоохранения15. Более того, определенный процент пациентов (2%-20%) не реагируют или только плохо реагируют на анти-VEGF терапию 16,17,18,19. Эти негативные сопутствующие факторы требуют разработки альтернативных методов лечения, например, внутриглазных имплантатов, клеточных и/или генных терапевтических подходов.
Генная терапия эволюционировала как перспективное лечение наследственных и ненаследственных заболеваний и направлена на восстановление нефункциональных последовательностей генов или подавление неисправных. Для полигенных заболеваний, где выявление и замена причинных факторов вряд ли возможны, стратегии направлены на непрерывную доставку защитного фактора. В случае ВМД были разработаны различные аддитивные методы лечения, такие как стабильная экспрессия эндостатина и ангиостатина20, антагонист VEGF растворимый fms-подобная тирозинкиназа-1 (sFLT-1)21,22, регуляторный белковый кластер комплемента дифференцировки 59 (CD59)23 или PEDF24,25 . Глаз, и особенно сетчатка, является отличной мишенью для генного лекарства из-за закрытой структуры, хорошей доступности, небольшого размера и иммунной привилегии, что позволяет локализовать доставку низких терапевтических доз и делает трансплантацию менее восприимчивой к отторжению. Кроме того, глаз обеспечивает неинвазивный мониторинг, а сетчатка может быть исследована различными методами визуализации.
Вирусные векторы, благодаря своей высокой эффективности трансдукции, являются основным средством доставки терапевтических генов в клетки-мишени. Однако, в зависимости от используемого вирусного вектора, были описаны различные побочные реакции, такие как иммунные и воспалительные реакции26, мутагенные и онкогенные эффекты 27,28 или распространение в других тканях29. Практические ограничения включают ограниченный размер упаковки30, а также трудности и затраты, связанные с производством партий клинического сорта31,32. Эти недостатки способствовали дальнейшему развитию невирусных, основанных на плазмидах векторов, которые передаются через липо-/полиплексы, ультразвук или электропорацию. Однако геномная интеграция трансгена в геном хозяина обычно не стимулируется плазмидными векторами, что приводит к переходной экспрессии.
Транспозоны — это естественные фрагменты ДНК, которые изменяют свое положение в геноме, характеристика, которая была принята для генной терапии. Благодаря активному механизму интеграции векторные системы на основе транспозонов позволяют непрерывно и постоянно выражать вставленный трансген. Транспозон Спящей красавицы (SB), восстановленный из древнего транспозона типа Tc1/mariner, обнаруженного у рыб33 и дополнительно улучшенного молекулярной эволюцией, что привело к гиперактивному варианту SB100X34, обеспечил эффективную транспозицию в различных первичных клетках и использовался для фенотипической коррекции в различных моделях заболеваний35. В настоящее время начато 13 клинических испытаний с использованием транспозонной системы SB . Транспозонная система SB100X состоит из двух компонентов: транспозона, который содержит интересующий ген, окруженный терминальными инвертированными повторами (TR), и транспозазы, которая мобилизует транспозон. После доставки плазмидной ДНК в клетки транспозаза связывает TIF и катализирует иссечение и интеграцию транспозона в геном клетки.
Мы разработали невирусную клеточную аддитивную терапию для лечения неоваскулярной ВМД. Подход включает в себя электропорационную вставку гена PEDF в первичные пигментные эпителиальные (PE) клетки с помощью транспозонной системы SB100X 36,37,38. Генетическая информация транспозазы и PEDF предоставляется на отдельных плазмидах, что позволяет регулировать идеальное соотношение транспозонов SB100X к PEDF. Электропорация выполняется с использованием капиллярной трансфекционной системы на основе пипетки, которая характеризуется максимальным размером зазора между электродами при минимизации площади их поверхности. Было показано, что устройство достигает превосходных скоростей трансфекции в широком диапазоне клеток млекопитающих 39,40,41. Малая площадь поверхности электрода обеспечивает равномерное электрическое поле и уменьшает различные побочные эффекты электролиза42.
Антиангиогенная функциональность PEDF, секретируемая трансфектированными пигментными эпителиальными клетками, была показана в различных экспериментах in vitro, анализирующих прорастание, миграцию и апоптоз эндотелиальных клеток пуповинной вены человека43. Кроме того, трансплантация PEDF-трансфектированных клеток в кроличью модель неоваскуляризации роговицы44, а также крысиная модель CNV 43,45,46 показали снижение неоваскуляризации.
Здесь мы описываем подробный протокол для стабильной вставки гена PEDF в первичные клетки RPE человека через систему транспозонов SB100X с использованием системы капиллярной трансфекции. Трансфектированные клетки держали в культуре в течение 21 дня и впоследствии анализировали с точки зрения экспрессии гена PEDF с помощью количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) и с точки зрения секреции белка PEDF путем иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа (ИФА, рисунок 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

Наше все более стареющее общество приводит к росту заболеваемости нейродегенеративными заболеваниями. До сих пор патологические механизмы недостаточно изучены, что препятствует установлению определенных методов лечения. Клеточная аддитивная генная терапия для повышения экспрессии защитного фактора рассматривается как перспективный вариант лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД). Мы разработали метод стабильной экспрессии гена, кодирующего пигментный эпителий-производный фактор (PEDF), который характеризуется как нейропротекторный и антиангиогенный белок в нервной системе, в геном первичных пигментных эпителиальных (PE) клеток человека с использованием транспозонной системы Sleeping Beauty (SB). Первичные ПЭ-клетки были выделены из глаз донора человека и сохранены в культуре. После достижения слияния 1 х 104 клетки суспендировали в 11 мкл буфера ресуспензии и соединяли с 2 мкл очищенного раствора, содержащего 30 нг гиперактивной плазмиды транспозазы SB (SB100X) и 470 нг транспозонной плазмиды PEDF . Генетическую модификацию проводили с помощью капиллярной электропорационной системы с использованием следующих параметров: два импульса напряжением 1 100 В и шириной 20 мс. Трансфектированные клетки переносили в культуральные пластины, содержащие среду, дополненную фетальной бычьей сывороткой; антибиотики и антимикотики добавляли с первым средним обменом. Успешная трансфекция была продемонстрирована в самостоятельно проведенных экспериментах. Количественная полимеразная цепная реакция (qPCR) показала повышенную экспрессию трансгена PEDF . Секреция PEDF была значительно повышена и оставалась стабильной, что оценивалось иммуноблоттингом и количественно оценивалось с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). SB100X-опосредованный перенос позволил обеспечить стабильную интеграцию гена PEDF в геном клеток PE и обеспечил непрерывную секрецию PEDF, что имеет решающее значение для разработки клеточной генной аддитивной терапии для лечения ВМД или других дегенеративных заболеваний сетчатки. Более того, анализ профиля интеграции транспозона PEDF в клетки PE человека показал почти случайное геномное распределение.

Культивирование и электропорация первичных клеток RPE человека Показано, что посев достаточного количества первичных РПЭ клеток животного происхождения позволяет культивировать и выращивать до интегрированного монослоя пигментированных, шестиугольных к...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Мы разработали протокол для трансфекции первичных пигментных эпителиальных клеток человека путем электропорации с геном, кодирующим фактор, полученный из пигментного эпителия (PEDF), с использованием транспозонной системы Sleeping Beauty (SB). Успешная трансфекция была продемонстрирована количественной полимеразной цепной реакцией (qPCR), иммуноблоттингом и иммуноферментным анализом (ИФА).

Генетическая модификация первичных пигментных эпителиальных клеток человека на основе электропорации с использованием транспозонной системы «Спящая красавица»

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Этот метод демонстрирует трансфекцию первичных пигментных эпителиальных клеток человека на основе электропорации с использованием транспозонной системы «Спящая красавица», что свидетельствует о экспрессии трансгенов и секреции белка. Комбинация транспозонной системы Sleeping Beauty и электропорации обеспечивает эффективную трансфекцию первичных пигментных эпителиальных клеток человека, а также стабильную и стойкую экспрессию трансгенов и секрецию белка. Общая цель состоит в том, чтобы создать клеточную генную аддитивную терапию для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки, которая требует стабильной и стойкой секреции терапевтически активного белка.Продемонстрировать процедуру будут Энн Фрайалденховен и Антье Шифер, медицинские технические ассистенты из лаборатории. Чтобы подготовить плазмидную ДНК к первичной электропорации клеток RPE человека, используйте микрообъемный спектрофотометр для количественной оценки содержимого плазмидной ДНК и отрегулируйте концентрацию до 250 нанограммов на микролитр в 10 миллимолярах Tris-HCL. Смешайте один объем 250 нанограмм на микролитр транспозазной плазмидной ДНК SB100X с 16 объемами 250 нанограмм на микролитр пигментного эпителия, полученного из фактора транспозона плазмидной ДНК.Добавьте два микролитра полученной плазменной смеси в стерильную 1,5-миллилитровую безопасную микроцентрифужную трубку на льду и заполните буферную трубку тремя миллилитрами буфера E. Затем вставьте трубку в пипетку до тех пор, пока не будет слышен щелчок, и установите устройство трансфекции на 1 100 вольт, ширину импульса 20 миллисекунд и два импульса. Подготовить ячейки к электропорации. Во-первых, проверьте морфологию первичных клеточных культур RPE с помощью фазово-контрастной микроскопии для оценки их роста и слияния.Обрабатывайте клетки 500 микролитрами 0,05% трипсина ЭДТА на лунку в течение семи-15 минут в инкубаторе клеточной культуры. Когда клетки отделились, соберут клетки путем центрифугирования, повторно суспендируют клетки в одном миллилитре PBS и центрифугируют от одного до 10 раз 10 до четырех аликвот клеток за реакцию трансфекции. Повторно суспендируют гранулы в 11 микролитрах буфера R на пробирку и добавляют два микролитра приготовленной плазмидной смеси в каждую трубку.Вставьте головку трансфекционной пипетки в 10-микролитровый трансфекционный наконечник до тех пор, пока зажим полностью не поднимет крепежный шток поршня, и загрузите ячейку и плазмидный раствор в наконечник трансфекции. Вставьте трансфекционную пипетку в буферную трубку, расположенную внутри пипеточной станции, пока не будет слышен щелчок, и нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать процесс электропорации. После трансфекции осторожно извлекают трансфекционную пипетку из пипетки и сразу же пипетку клеточного и плазмидного раствора в подготовленные лунки клеточной культуральной пластины.Для очистки помеченного им пигментного эпителия получают белки факторного слияния из супернатантов клеточной культуры RPE. Во-первых, используйте конический режущий наконечник для сбора одной 30-микролитровой аликвоты никелевой NTA-суспензии на образец и гранулируйте никелевую смолу NTA путем центрифугирования. Тщательно повторно суспендируйте никелевую смолу NTA 200 микролитрами инкубационного буфера One X и гранулируйте раствор с дополнительной центрифугированием два раза.После второй центрифугирования тщательно повторно суспендируйте гранулы никелевой смолы NTA с 40 микролитрами инкубационного буфера Four X на образец. Далее смешайте 55 микролитров одной аликвоты предварительно обработанной никелевой суспензии NTA с 260 микролитрами инкубационного буфера Four X и 900 микролитрами каждого трансефктированного супернатанта клеточной культуры RPE. Инкубируйте смесь на качающемся шейкере при комнатной температуре в течение 60 минут и снова гранулируйте смеси никелевой смолы NTA.Тщательно повторно суспендируйте гранулы в 175 микролитрах инкубационного буфера One X и центрифугируйте смеси еще два раза. После второй центрифугирования тщательно повторно суспендируют гранулы никелевой смолы NTA в 30 микролитрах буфера Элюирования для 20-минутной инкубации при комнатной температуре с встряхиванием и центрифугированием образцов снова. Затем тщательно соберите супернатанты и смешайте их с буфером образцов Two X SDS для западного анализа очищенных белков в крови.Культивируемые первичные клетки RPE, выделенные из глаз донора человека, демонстрируют типичную морфологию булыжника независимо от возраста донора, посмертного времени изоляции или времени культивирования. Применение кратковременных электрических импульсов к первичным клеткам RPE человека. Использование системы капиллярной трансфекции не оказывает негативного влияния на морфологию эпителия.Западный анализ крови трансфектированных супернатантов первичной культуры клеток RPE человека демонстрирует секрецию фактора, полученного из пигментного эпителия, на постоянных уровнях без глушения трансгенов в течение более 500 дней. Как наблюдается в этом репрезентативном анализе крови клеточной культуральной среды от серийно выполняемых трансфекций, повсеместно более высокая скорость секреции фактора пигментного эпителия наблюдается через 21 день после трансфекции. В исследуемой культуре долгосрочная повышенная секреция PEDF длится не менее 165 дней.Кроме того, количественная оценка на основе ИФА показывает 20-кратное увеличение общей секреции фактора, полученного из пигментного эпителия, в трансфектированных первичных клетках RPE человека по сравнению с соответствующими нетрансфектированными контрольными клетками. Это увеличение было также подтверждено на уровне экспрессии генов, на котором общая экспрессия PEDF была повышена более чем в 30 раз. При попытке этого протокола важно использовать пигментные эпителиальные клетки, морфология которых соответствует статусу In Vivo.Кроме того, не забудьте втянуть клеточный раствор в наконечник трансфекции без пузырьков воздуха. Стабильно трансфектированные клетки могут быть использованы в различных моделях Ex Vivo или In vivo для проверки функциональности этой клеточной генной аддитивной терапии.

Research

JoVE Journal

Medicine

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Кожа биопсии эксплантата культуры для отвлечения Первичные человеческие фибробласты

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Идентификация<em&gt; Спящая красавица</em&gt; Транспозонов вставки в твердых опухолей с использованием Linker-опосредованного ПЦР

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Время изображений в заданный промежуток первичной предраковых эпителиальные клетки молочной железы, полученных из генно-инженерных мышей модели рака молочной железы

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Изоляция, криоконсервации и культура клеток человека Амнион Эпителиальные для клинического применения

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Выполнение субретинальных инъекции грызунов для доставки пигментного эпителия сетчатки клеток в суспензии

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Органотипической Высокая пропускная система для характеризации наркотиками чувствительности первичных клетки множественной миеломы

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Индукция ускоренного атеросклероза у мышей: модель "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Изоляции первичных клеток человека децидуальной от плода мембраны термин Роль162

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Визуализация эндогенных митофагных комплексов на месте в бета-клетках поджелудочной железы человека, используя асссы Лигации близости

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer

Измерение каротиноидов в Перифовеа с помощью масляного пигментного отражательного метра

The macular pigment reflectometer (MPR) objectively measures the overall macular pigment optical density (MPOD) and further provides the lutein optical ...