Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Séptimo Programa Marco de la Unión Europea para la investigación, el desarrollo tecnológico y la demostración, acuerdo de subvención no. 305134. Zsuzsanna Izsvák fue financiada por el Consejo Europeo de Investigación, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Los autores desean agradecer a Anna Dobias y Antje Schiefer (Departamento de Oftalmología, Hospital Universitario RWTH Aachen) por su excelente apoyo técnico, y al Banco de Córnea de Aquisgrán (Departamento de Oftalmología, Hospital Universitario RWTH Aachen) por proporcionar los ojos del donante humano.

Los ojos de donantes humanos se obtuvieron del Banco de Córnea de Aquisgrán del Departamento de Oftalmología (Hospital Universitario RWTH Aachen) después de obtener el consentimiento informado de acuerdo con los protocolos de la Declaración de Helsinki. Los procedimientos para la recolección y uso de muestras humanas han sido aprobados por el comité de ética institucional.
1. Aislamiento de células RPE humanas primarias
<ol><li>Coloque ropa protectora estéril y guantes. Coloque una...

En nuestro proyecto, nuestro objetivo es la producción no viral de células RPE humanas primarias modificadas genéticamente que continuamente sobreexpresan y secretan un factor eficaz para utilizar las células transfectadas como terapéuticas a largo plazo para el establecimiento y mantenimiento de un entorno protector. Hemos establecido la introducción del gen que codifica PEDF, una proteína multifuncional expresada ubicuamente con funciones antiangiogénicas y neuroprotectoras. El protocolo descrito aquí se puede...

La edad avanzada se describe como el principal riesgo de enfermedades neurodegenerativas. La degeneración macular asociada a la edad (DMAE), una enfermedad poligénica que conduce a una pérdida grave de la visión en pacientes mayores de 60 años, pertenece a las cuatro causas más comunes de ceguera y discapacidad visual1 y se espera que aumente a 288 millones de personas en 20402. Las disfunciones del epitelio pigmentario de la retina (EPR), una sola capa de células estrechamente empaquetadas ubicadas entre el coriocapilar y los fotorreceptores retinianos, contribuyen a la patogénesis de la DMAE. El EPR cumple múltiples tareas que son esenciales para una función normal de la retina3 y secreta una variedad de factores de crecimiento y factores esenciales para mantener la integridad estructural de la retina y el coriocapilar, apoyando así la supervivencia de los fotorreceptores y proporcionando una base para la circulación y el suministro de nutrientes.
En ojos sanos, el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) es responsable de equilibrar los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y protege a las neuronas contra la apoptosis, previene la proliferación de células endoteliales y estabiliza el endotelio capilar. El cambio de la relación VEGF-PEDF está relacionado con la neovascularización ocular, que se observó en modelos animales 4,5, así como en muestras de pacientes con neovascularización coroidea (NVC) por DMAE y retinopatía diabética proliferativa 6,7,8,9,10 . La concentración mejorada de VEGF es el objetivo del tratamiento estándar actual. Los fármacos anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept y, más recientemente, brolucizumab mejoran la agudeza visual en aproximadamente un tercio de los pacientes con NVC o más bien estabilizan la visión en el 90% de los casos11,12,13. Sin embargo, las inyecciones intravítreas frecuentes, a menudo mensuales, conllevan el riesgo de eventos adversos14, perjudican el cumplimiento del paciente y representan una carga económica significativa para los sistemas de salud15. Además, un cierto porcentaje de pacientes (2%-20%) no responden o sólo reaccionan mal a la terapia anti-VEGF16,17,18,19. Estos concomitantes negativos requieren el desarrollo de tratamientos alternativos, por ejemplo, implantes intraoculares, enfoques terapéuticos celulares y / o genéticos.
La terapia génica ha evolucionado como un tratamiento prometedor para enfermedades hereditarias y no hereditarias y tiene la intención de restaurar secuencias de genes no funcionales o suprimir las que funcionan mal. Para las enfermedades poligénicas, donde la identificación y el reemplazo de los factores causales es casi imposible, las estrategias apuntan a la administración continua de un factor protector. En el caso de la DMAE, se han desarrollado diversas terapias aditivas, como la expresión estable de endostatina y angiostatina 20, el antagonista del VEGF soluble fms-like tirosina quinasa-1 (sFLT-1)21,22, el grupo de proteínas reguladoras del complemento de diferenciación 59 (CD59)23 o PEDF 24,25 . El ojo, y especialmente la retina, es un excelente objetivo para un medicamento basado en genes debido a la estructura cerrada, la buena accesibilidad, el tamaño pequeño y el privilegio inmunológico, lo que permite una administración localizada de dosis terapéuticas bajas y hace que los trasplantes sean menos susceptibles al rechazo. Además, el ojo permite una monitorización no invasiva, y la retina puede ser examinada por diferentes técnicas de imagen.
Los vectores virales son, debido a su alta eficiencia de transducción, el principal vehículo para administrar genes terapéuticos en las células diana. Sin embargo, dependiendo del vector viral utilizado, se han descrito diferentes reacciones adversas, como respuestas inmunes e inflamatorias26, efectos mutagénicos y oncogénicos 27,28 o diseminación en otros tejidos29. Las limitaciones prácticas incluyen un tamaño de embalaje restringido30, así como dificultades y costos asociados con la producción de lotes de grado clínico31,32. Estos inconvenientes han promovido el desarrollo de vectores no virales basados en plásmidos que se transfieren a través de lipo / poliplexes, ultrasonido o electroporación. Sin embargo, la integración genómica del transgén en el genoma del huésped generalmente no se promueve con vectores plásmidos, lo que resulta en una expresión transitoria.
Los transposones son fragmentos de ADN naturales que cambian su posición dentro del genoma, una característica que se ha adoptado para la terapia génica. Debido a un mecanismo de integración activo, los sistemas vectoriales basados en transposones permiten una expresión continua y constante del transgén insertado. El transposón de la Bella Durmiente (SB), reconstituido a partir de un antiguo transposón de tipo Tc1/marinero encontrado en peces33 y mejorado aún más por la evolución molecular que resultó en la variante hiperactiva SB100X34, permitió la transposición eficiente en varias células primarias y fue utilizado para la corrección fenotípica en diferentes modelos de enfermedad35. En la actualidad, se han iniciado 13 ensayos clínicos utilizando el sistema de transposones SB . El sistema de transposones SB100X consta de dos componentes: el transposón, que comprende el gen de interés flanqueado por repeticiones invertidas terminales (TIR), y la transposasa, que moviliza el transposón. Después de la entrega de ADN plásmido a las células, la transposasa se une a los TIR y cataliza la escisión e integración del transposón en el genoma de la célula.
Hemos desarrollado una terapia aditiva basada en células no virales para el tratamiento de la DMAE neovascular. El enfoque comprende la inserción basada en electroporación del gen PEDF en células epiteliales pigmentarias primarias (PE) por medio del sistema de transposón SB100X 36,37,38. La información genética de la transposasa y el PEDF se proporciona en plásmidos separados, lo que permite el ajuste de la relación ideal de transposones SB100X a PEPF. La electroporación se realiza utilizando un sistema de transfección capilar basado en pipeta que se caracteriza por un tamaño de espacio maximizado entre los electrodos y minimiza su área de superficie. Se demostró que el dispositivo logra excelentes tasas de transfección en una amplia gama de células de mamíferos 39,40,41. La pequeña superficie del electrodo proporciona un campo eléctrico uniforme y reduce los diversos efectos secundarios de la electrólisis42.
La funcionalidad antiangiogénica del PEDF secretado por células epiteliales pigmentarias transfectadas fue demostrada en varios experimentos in vitro que analizaron la brotación, migración y apoptosis de células endoteliales de la vena umbilical humana43. Además, el trasplante de células transfectadas con PEDF en un modelo de conejo de neovascularización corneal44, así como un modelo de rata de CNV43,45,46 mostraron disminución de la neovascularización.
Aquí, describimos un protocolo detallado para la inserción estable del gen PEDF en células RPE humanas primarias a través del sistema de transposón SB100X utilizando un sistema de transfección capilar. Las células transfectadas se mantuvieron en cultivo durante 21 días y posteriormente se analizaron en términos de expresión génica PEDF por reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR) y en términos de secreción de proteína PEDF por inmunotransferencia y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

Nuestra sociedad cada vez más envejecida conduce a una creciente incidencia de enfermedades neurodegenerativas. Hasta ahora, los mecanismos patológicos no se comprenden adecuadamente, lo que impide el establecimiento de tratamientos definidos. Las terapias génicas aditivas basadas en células para aumentar la expresión de un factor protector se consideran una opción prometedora para medicar enfermedades neurodegenerativas, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). Hemos desarrollado un método para la expresión estable del gen que codifica el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF), que se caracteriza como una proteína neuroprotectora y antiangiogénica en el sistema nervioso, en el genoma de las células epiteliales pigmentarias humanas primarias (PE) utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente (SB). Las células primarias de PE se aislaron de los ojos de donantes humanos y se mantuvieron en cultivo. Después de alcanzar la confluencia, se suspendieron 1 x 104 células en 11 μL de tampón de resuspensión y se combinaron con 2 μL de una solución purificada que contenía 30 ng de plásmido transposasa SB (SB100X) hiperactivo y 470 ng de plásmido transposón PEDF. La modificación genética se realizó con un sistema de electroporación capilar utilizando los siguientes parámetros: dos pulsos con una tensión de 1.100 V y una anchura de 20 ms. Las células transfectadas se transfirieron a placas de cultivo que contenían medio suplementado con suero bovino fetal; Se agregaron antibióticos y antimicóticos con el primer intercambio medio. La transfección exitosa se demostró en experimentos realizados de forma independiente. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) mostró el aumento de la expresión del transgén PEDF. La secreción de PEDF se elevó significativamente y se mantuvo estable, según lo evaluado por inmunotransferencia y cuantificado por el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La transferencia mediada por SB100X permitió una integración estable del gen PEDF en el genoma de las células PE y aseguró la secreción continua de PEDF, que es fundamental para el desarrollo de una terapia de adición de genes basada en células para tratar la DMAE u otras enfermedades degenerativas de la retina. Además, el análisis del perfil de integración del transposón PEDF en células PE humanas indicó una distribución genómica casi aleatoria.

Cultivo y electroporación de células RPE humanas primarias Hemos demostrado que la siembra de un número suficiente de células primarias del EPR de origen animal permite el cultivo y crecimiento a una monocapa integrada de células pigmentadas, de forma hexagonal36,37,48. Su capacidad para formar uniones estrechas, exhibir actividad fagocítica y expresar genes marcadores e...

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Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Hemos desarrollado un protocolo para transfectar células epiteliales pigmentarias humanas primarias por electroporación con el gen que codifica el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente (SB). La transfección exitosa se demostró mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR), inmunotransferencia y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Modificación genética basada en electroporación de células epiteliales pigmentarias humanas primarias utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Este método demuestra la transfección basada en electroporación de células epiteliales pigmentarias humanas primarias utilizando el Sistema de Transposones de la Bella Durmiente, una evidencia de expresión transgénica y secreción de proteínas. La combinación del sistema de transposón de la Bella Durmiente y la electroporación permite la transfección eficiente de las células epiteliales pigmentarias humanas primarias, así como la expresión transgénica estable y persistente y la secreción de proteínas. El objetivo general es establecer una terapia de adición génica basada en células para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina, que requiere una secreción estable y persistente de la proteína terapéuticamente activa.Demostrando el procedimiento estarán Anne Freialdenhoven y Antje Schiefer, asistentes técnicos médicos del laboratorio. Para preparar el ADN plásmido para la electroporación primaria de células RPE humanas, use un espectrofotómetro de microvolumen para cuantificar el contenido de ADN plásmido y ajuste la concentración a 250 nanogramos por microlitro en 10 milimolares Tris-HCL. Mezcle un volumen de 250 nanogramos por microlitro de ADN plásmido transposasa SB100X con 16 volúmenes de 250 nanogramos por microlitro de ADN plásmido del factor de epitelio derivado del epitelio pigmentario.Agregue dos microlitros de la mezcla de plasma resultante en un tubo de microcentrífuga estéril de bloqueo seguro de 1.5 mililitros en hielo y llene un tubo amortiguador con tres mililitros de tampón E. Luego inserte el tubo en la estación de pipetas hasta que se escuche un clic y ajuste el dispositivo de transfección a 1, 100 voltios, un ancho de pulso de 20 milisegundos y dos pulsos. Preparar las células para la electroporación. Primero, verifique la morfología de los cultivos celulares primarios de EPR mediante microscopía de contraste de fase para evaluar su crecimiento y confluencia.Tratar las células con 500 microlitros de 0,05% de tripsina EDTA por pocillo durante siete a 15 minutos en la incubadora de cultivo celular. Cuando las células se hayan desprendido, recoger las células por centrifugación, resuspender las células en un mililitro de PBS y centrifugar de una a 10 veces 10 a las cuatro alícuotas celulares por reacción de transfección. Resuspender los pellets en 11 microlitros de tampón R por tubo y añadir dos microlitros de la mezcla de plásmidos preparada a cada tubo.Inserte la cabeza de una pipeta de transfección en una punta de transfección de 10 microlitros hasta que la abrazadera recoja completamente el vástago de montaje del pistón y cargue la célula y la solución plásmida en la punta de transfección. Inserte la pipeta de transfección en el tubo tampón colocado dentro de la estación de pipetas hasta que se escuche un clic y pulse start para comenzar el proceso de electroporación. Después de la transfección, retire cuidadosamente la pipeta de transfección de la estación de pipetas e inmediatamente pipetear la célula y la solución plásmida en los pocillos preparados de la placa de cultivo celular.Purificar sus proteínas de fusión de factores derivados del epitelio pigmentario marcadas a partir de sobrenadantes de cultivo celular RPE. Primero, use una punta de corte cónico para recolectar una alícuota de 30 microlitros de suspensión de níquel NTA por muestra y granular la resina de níquel NTA por centrifugación. Resuspenda cuidadosamente la resina NTA de níquel con 200 microlitros de tampón de incubación One X y granule la solución con una centrifugación adicional dos veces.Después de la segunda centrifugación, resuspenda cuidadosamente los gránulos de resina NTA de níquel con 40 microlitros de tampón de incubación Four X por muestra. A continuación, mezcle 55 microlitros de una alícuota de lodo NTA de níquel pretratado con 260 microlitros de tampón de incubación Four X y 900 microlitros de cada sobrenadante de cultivo celular RPE transefcado. Incubar la mezcla en una coctelera a temperatura ambiente durante 60 minutos y granular las mezclas de resina NTA de níquel nuevamente.Resuspenda cuidadosamente los gránulos en 175 microlitros de tampón de incubación One X y centrifugue las mezclas dos veces más. Después de la segunda centrifugación, resuspenda cuidadosamente los gránulos de resina NTA de níquel en 30 microlitros de tampón Elution durante una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente agitando y centrifugando las muestras nuevamente. Luego recoja cuidadosamente los sobrenadantes y mézclelos con un tampón de muestra Two X SDS para el análisis de sangre occidental de las proteínas purificadas.Las células RPE primarias cultivadas aisladas de ojos de donantes humanos demuestran una morfología típica de adoquines independientemente de la edad del donante, el tiempo postmortem de aislamiento o el tiempo de cultivo. La aplicación de pulsos eléctricos a corto plazo a las células humanas primarias del EPR. El uso del sistema de transfección capilar no afecta negativamente a la morfología epitelial.El análisis de sangre occidental de sobrenadantes de cultivo de células RPE humanas primarias transfectadas demuestra la secreción de factor derivado del epitelio pigmentario a niveles consistentes sin silenciamiento transgénico durante más de 500 días. Como se observa en este análisis de sangre occidental representativo del medio de cultivo celular de transfecciones realizadas en serie, se observa una tasa de secreción de factor derivado del epitelio pigmentario universalmente más alta a los 21 días después de la transfección. En un cultivo perseguido, la secreción elevada de PEDF a largo plazo dura al menos 165 días.Además, la cuantificación basada en ELISA revela un aumento de 20 veces de la secreción total del factor derivado del epitelio pigmentario en las células RPE humanas primarias transfectadas en comparación con las respectivas células de control no transfectadas. Este incremento también se afirmó en el nivel de expresión génica en el que la expresión total de PEDF se elevó más de 30 veces. Al intentar este protocolo, es importante utilizar células epiteliales pigmentarias cuya morfología corresponda al estado In Vivo.Además, recuerde extraer la solución celular en la punta de transfección sin burbujas de aire. Las células transfectadas de manera estable se pueden usar en diferentes modelos Ex Vivo o In vivo para verificar la funcionalidad de esta terapia de adición génica basada en células.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Investigación

Medicina

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