Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Europeiska unionens sjunde ramprogram för forskning, teknisk utveckling och demonstration, bidragsavtal nr 305134. Zsuzsanna Izsvák finansierades av Europeiska forskningsrådet, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Författarna vill tacka Anna Dobias och Antje Schiefer (Institutionen för oftalmologi, Universitetssjukhuset RWTH Aachen) för utmärkt teknisk support och Aachen Cornea Bank (Institutionen för oftalmologi, Universitetssjukhuset RWTH Aachen) för att ge de mänskliga donatorögonen.

Mänskliga donatorögon erhölls från Aachen Cornea Bank vid avdelningen för oftalmologi (Universitetssjukhuset RWTH Aachen) efter att ha fått informerat samtycke i enlighet med Helsingforsdeklarationens protokoll. Förfaranden för insamling och användning av humanprover har godkänts av den institutionella etiska kommittén.
1. Isolering av primära humana RPE-celler
<ol><li>Lägg ut sterila skyddskläder och handskar. Placera ett sterilt draperi under ett laminärt flöde.</li>
	<li>P...

I vårt projekt strävar vi efter icke-viral produktion av genetiskt modifierade primära humana RPE-celler som kontinuerligt överuttrycker och utsöndrar en effektiv faktor för att kunna använda de transfekterade cellerna som långsiktig terapeutisk för etablering och underhåll av en skyddande miljö. Vi har etablerat introduktionen av genen som kodar för PEDF, ett allestädes närvarande uttryckt multifunktionellt protein med anti-angiogena och neuroprotektiva funktioner. Protokollet som beskrivs här kan använd...

Hög ålder beskrivs som den största risken för neurodegenerativa sjukdomar. Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), en polygen sjukdom som leder till svår synförlust hos patienter äldre än 60 år, tillhör de fyra vanligaste orsakerna till blindhet och synnedsättning1 och förväntas öka till 288 miljoner människor 20402. Dysfunktioner i retinal pigmentepitel (RPE), ett enda lager av tätt packade celler belägna mellan choriocapillaris och retinala fotoreceptorer, bidrar till patogenesen av AMD. RPE uppfyller flera uppgifter som är väsentliga för en normal retinal funktion3 och utsöndrar en mängd olika tillväxtfaktorer och faktorer som är väsentliga för att upprätthålla den strukturella integriteten hos näthinnan och choriokapillaris, vilket stöder fotoreceptoröverlevnad och ger en grund för cirkulationen och tillförseln av näringsämnen.
I friska ögon är pigmentepitel-härledd faktor (PEDF) ansvarig för att balansera effekterna av vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) och skyddar neuroner mot apoptos, förhindrar endotelcellsproliferation och stabiliserar kapillärendotelet. Ett skiftat VEGF-till-PEDF-förhållande är relaterat till okulär neovaskularisering, vilket observerades i djurmodeller 4,5 samt i prover av patienter med koroidal neovaskularisering (CNV) på grund av AMD och proliferativ diabetisk retinopati 6,7,8,9,10 . Den förbättrade VEGF-koncentrationen är målet för den nuvarande standardbehandlingen. Anti-VEGF-läkemedlen bevacizumab, ranibizumab, aflibercept och senast brolucizumab förbättrar synskärpan hos cirka en tredjedel av CNV-patienterna eller snarare stabiliserar synen i 90% av fallen11,12,13. De frekventa, ofta månatliga, intravitreala injektionerna medför dock risken för biverkningar14, försämrar patienternas efterlevnad och utgör en betydande ekonomisk börda för hälso- och sjukvårdssystemen15. Dessutom svarar en viss andel av patienterna (2%-20%) inte eller reagerar bara dåligt på anti-VEGF-behandlingen16,17,18,19. Dessa negativa samtidiga kräver utveckling av alternativa behandlingar, t.ex. intraokulära implantat, cell- och/eller genterapeutiska metoder.
Genterapi har utvecklats som lovande behandling för ärftliga och icke-ärftliga sjukdomar och avser att återställa icke-funktionella gensekvenser eller undertrycka felaktiga sådana. För polygena sjukdomar, där identifiering och ersättning av orsaksfaktorerna knappast är möjlig, syftar strategierna till kontinuerlig leverans av en skyddande faktor. När det gäller AMD har olika additiva terapier utvecklats, såsom det stabila uttrycket av endostatin och angiostatin 20, VEGF-antagonisten lösligt fms-liknande tyrosinkinas-1 (sFLT-1)21,22, komplementet reglerande proteinkluster av differentiering 59 (CD59)23 eller PEDF 24,25 . Ögat, och särskilt näthinnan, är ett utmärkt mål för en genbaserad medicinering på grund av den slutna strukturen, god tillgänglighet, liten storlek och immunprivilegium, vilket möjliggör en lokal leverans av låga terapeutiska doser och gör transplantationer mindre mottagliga för avstötning. Dessutom möjliggör ögat icke-invasiv övervakning, och näthinnan kan undersökas med olika bildtekniker.
Virala vektorer är, på grund av deras höga transduktionseffektivitet, det viktigaste fordonet för att leverera terapeutiska gener till målceller. Beroende på vilken virusvektor som används har dock olika biverkningar beskrivits, såsom immun- och inflammatoriska svar26, mutagena och onkogena effekter 27,28 eller spridning i andra vävnader29. Praktiska begränsningar inkluderar en begränsad förpackningsstorlek30 samt svårigheter och kostnader i samband med produktionen av partier31,32 av klinisk kvalitet. Dessa nackdelar har främjat den fortsatta utvecklingen av icke-virala, plasmidbaserade vektorer som överförs via lipo-/polyplexer, ultraljud eller elektroporering. Emellertid främjas inte genomisk integration av transgenen i värdgenomet vanligtvis inte med plasmidvektorer, vilket resulterar i ett övergående uttryck.
Transposoner är naturligt förekommande DNA-fragment som ändrar sin position i genomet, en egenskap som har antagits för genterapi. På grund av en aktiv integrationsmekanism möjliggör transposonbaserade vektorsystem ett kontinuerligt och konstant uttryck av den införda transgenen. Törnrosa (SB) transposon, rekonstituerad från en gammal Tc1/mariner-typ transposon som hittades i fisk33 och förbättrades ytterligare genom molekylär evolution vilket resulterade i den hyperaktiva varianten SB100X34, möjliggjorde effektiv transponering i olika primära celler och användes för fenotypisk korrigering i olika sjukdomsmodeller35. För närvarande har 13 kliniska prövningar inletts med hjälp av SB-transposonsystemet. SB100X-transposonsystemet består av två komponenter: transposonen, som består av genen av intresse flankerad av terminala inverterade upprepningar (TIR), och transposaset, som mobiliserar transposonen. Efter plasmid-DNA-leverans till cellerna binder transposaset TIR: erna och katalyserar excisionen och integrationen av transposonen i cellens genom.
Vi har utvecklat en icke-viral cellbaserad additiv terapi för behandling av neovaskulär AMD. Tillvägagångssättet omfattar elektroporationsbaserad införande av PEDF-genen i primära pigmentepitelceller (PE) med hjälp av SB100X-transposonsystemet 36,37,38. Den genetiska informationen om transposas och PEDF tillhandahålls på separata plasmider, vilket möjliggör justering av det ideala SB100X-till-PEDF-transposonförhållandet. Elektroporering utförs med hjälp av ett pipettbaserat kapillärtransfektionssystem som kännetecknas av en maximerad gapstorlek mellan elektroderna samtidigt som deras ytarea minimeras. Enheten visade sig uppnå utmärkta transfektionshastigheter i ett brett spektrum av däggdjursceller 39,40,41. Den lilla elektrodytan ger ett jämnt elektriskt fält och minskar de olika biverkningarna av elektrolys42.
Den anti-angiogena funktionaliteten hos PEDF som utsöndras av transfekterade pigmentepitelceller visades i olika in vitro-experiment som analyserade spridning, migration och apoptos av humana navelvenendotelceller43. Dessutom visade transplantation av PEDF-transfekterade celler i en kaninmodell av hornhinnans neovaskularisering44 samt en råttmodell av CNV43,45,46 nedgång av neovaskularisering.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för stabil insättning av PEDF-genen i primära humana RPE-celler via SB100X-transposonsystemet med hjälp av ett kapillärtransfektionssystem. De transfekterade cellerna hölls i odling i 21 dagar och analyserades därefter med avseende på PEDF-genuttryck genom kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) och i termer av PEDF-proteinsekretion genom immunoblotting och enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA, figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

Vårt allt äldre samhälle leder till en växande förekomst av neurodegenerativa sjukdomar. Hittills är de patologiska mekanismerna otillräckligt förstådda, vilket hindrar upprättandet av definierade behandlingar. Cellbaserade additiva genterapier för ökat uttryck av en skyddande faktor anses vara ett lovande alternativ för att medicinera neurodegenerativa sjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Vi har utvecklat en metod för stabilt uttryck av den genkodande pigmentepitel-härledda faktorn (PEDF), som karakteriseras som ett neuroprotektivt och antiangiogent protein i nervsystemet, in i genomet hos primära humana pigmentepitelceller (PE) med hjälp av Törnrosa (SB) transposonsystem. Primära PE-celler isolerades från mänskliga donatorögon och upprätthölls i odling. Efter att ha nått sammanflödet suspenderades 1 x 104 celler i 11 μl resuspensionsbuffert och kombinerades med 2 μL av en renad lösning innehållande 30 ng hyperaktiv SB (SB100X) transposasplasmid och 470 ng PEDF-transposonplasmid. Genetisk modifiering utfördes med ett kapillärelektroporationssystem med användning av följande parametrar: två pulser med en spänning på 1 100 V och en bredd på 20 ms. Transfekterade celler överfördes till odlingsplattor innehållande medium kompletterat med fetalt bovint serum; Antibiotika och antimykotika tillsattes med det första medieutbytet. Framgångsrik transfektion demonstrerades i självständigt utförda experiment. Kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) visade det ökade uttrycket av PEDF-transgenen. PEDF-sekretionen var signifikant förhöjd och förblev stabil, vilket utvärderades genom immunoblotting och kvantifierades med enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA). SB100X-medierad överföring möjliggjorde en stabil PEDF-genintegration i genomet hos PE-celler och säkerställde kontinuerlig utsöndring av PEDF, vilket är avgörande för utvecklingen av en cellbaserad genadditionsterapi för att behandla AMD eller andra retinala degenerativa sjukdomar. Dessutom indikerade analys av integrationsprofilen för PEDF-transposonen till mänskliga PE-celler en nästan slumpmässig genomisk fördelning.

Odling och elektroporering av primära humana RPE-celler Vi har visat att sådd av ett tillräckligt antal primära RPE-celler av animaliskt ursprung möjliggör odling och tillväxt till ett integrerat monolager av pigmenterade, sexkantigt formade celler36,37,48. Deras förmåga att bilda täta korsningar, att uppvisa fagocytisk aktivitet och att uttrycka specifika markörgen...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Vi har utvecklat ett protokoll för att transfektera primära humana pigmentepitelceller genom elektroporering med genen som kodar för pigmentepitel-härledd faktor (PEDF) med hjälp av Törnrosa (SB) transposonsystem. Framgångsrik transfektion demonstrerades genom kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR), immunoblotting och enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA).

Elektroporationsbaserad genetisk modifiering av primära mänskliga pigmentepitelceller med hjälp av Törnrosa Transposon System

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Denna metod demonstrerar elektroporationsbaserad transfektion av primära humana pigmentepitelceller med hjälp av Sleeping Beauty Transposon System, ett bevis för transgenuttryck och proteinsekretion. Kombinationen av Törnrosatransposonsystemet och elektroporering möjliggör effektiv transfektion av primära humana pigmentepitelceller, såväl som stabilt och ihållande transgenuttryck och proteinsekretion. Det övergripande målet är att etablera en cellbaserad genadditionsterapi för behandling av retinala degenerativa sjukdomar, vilket kräver stabil och ihållande utsöndring av det terapeutiskt aktiva proteinet.Demonstrerar proceduren kommer att vara Anne Freialdenhoven och Antje Schiefer, medicinska tekniska assistenter från laboratoriet. För att förbereda plasmid-DNA för primär human RPE-cellelektroporation, använd en mikrovolymspektrofotometer för att kvantifiera plasmid-DNA-innehållet och justera koncentrationen till 250 nanogram per mikroliter i 10 millimolar Tris-HCL. Blanda en volym på 250 nanogram per mikroliter SB100X-transposasplasmid-DNA med 16 volymer på 250 nanogram per mikroliter pigmentepitel härledd faktortransposon Plasmid DNA.Tillsätt två mikroliter av den resulterande plasmablandningen i ett sterilt 1,5 ml säkert låsmikrocentrifugrör på is och fyll ett buffertrör med tre milliliter buffert E.Sätt sedan in röret i pipettstationen tills ett klick hörs och ställ in transfektionsanordningen på 1 100 volt, en pulsbredd på 20 millisekunder och två pulser. För att förbereda cellerna för elektroporering. Kontrollera först morfologin för de primära RPE-cellkulturerna via faskontrastmikroskopi för att bedöma deras tillväxt och sammanflöde.Behandla cellerna med 500 mikroliter 0,05% Trypsin EDTA per brunn i sju till 15 minuter i cellodlingsinkubatorn. När cellerna har lossnat samla cellerna genom centrifugering, återsuspendera cellerna i en milliliter PBS och centrifugera en till 10 gånger 10 till de fyra cellalikvoterna per transfektionsreaktion. Återsuspendera pelletsen i 11 mikroliter buffert R per rör och tillsätt två mikroliter av den beredda plasmidblandningen till varje rör.Sätt in huvudet på en transfektionspipett i en 10 mikroliter transfektionsspets tills klämman helt tar upp kolvens monteringsstam och laddar cellen och plasmidlösningen i transfektionsspetsen. Sätt in transfektionspipetten i buffertröret som placeras i pipettstationen tills ett klick hörs och tryck på start för att starta elektroporeringsprocessen. Efter transfekten avlägsnas försiktigt transfektionspipetten från pipettstationen och pipettera omedelbart cellen och plasmidlösningen i de beredda brunnarna i cellodlingsplattan.För att rena hans taggade pigmentepitel härledda faktorfusionsproteiner från RPE-cellodlingssupernatanter. Använd först en avfasad spets för att samla en 30 mikroliter alikvot av nickel NTA-uppslamning per prov och pelletera nickel NTA-hartset genom centrifugering. Återsuspendera försiktigt nickel NTA-hartset med 200 mikroliter One X-inkubationsbuffert och pellet lösningen med en ytterligare centrifugering två gånger.Efter den andra centrifugeringen, återsuspendera försiktigt nickel NTA-hartspellets med 40 mikroliter Four X inkubationsbuffert per prov. Blanda sedan 55 mikroliter av en alikvot av förbehandlad nickel NTA-uppslamning med 260 mikroliter Four X-inkubationsbuffert och 900 mikroliter av varje transefcted RPE-cellodlingssupernatant. Inkubera blandningen på en gungande shaker vid rumstemperatur i 60 minuter och pelletera nickel NTA-hartsblandningarna igen.Återsuspendera försiktigt pelletsen i 175 mikroliter One X-inkubationsbuffert och centrifugera blandningarna ytterligare två gånger. Efter den andra centrifugeringen återsuspenderar försiktigt NTA-hartspelletsen i 30 mikroliter elueringsbuffert under en 20 minuters inkubation vid rumstemperatur med skakning och centrifugering av proverna igen. Samla sedan försiktigt supernatanterna och blanda dem med två X SDS-provbuffert för västerländsk blodanalys av de renade proteinerna.Odlade primära RPE-celler isolerade från mänskliga donatorögon visar en typisk kullerstensmorfologi oavsett givarens ålder, isoleringstid efter döden eller odlingstid. Tillämpningen av kortvariga elektriska pulser på primära humana RPE-celler. Användning av kapillärtransfektionssystemet påverkar inte epitelmorfologin negativt.Västerländsk blodanalys av transfekterade primära humana RPE-cellodlingssupernatanter visar pigmentepitelhärledd faktorsekretion vid konsekventa nivåer utan transgendämpning i mer än 500 dagar. Som observerats i denna representativa västerländska blodanalys av cellodlingsmedium från seriellt utförda transfektioner observeras en universellt högre pigmentepitelhärledd faktorsekretionshastighet vid 21 dagar efter transfektion. I en eftersträvad kultur varar långvarig förhöjd PEDF-utsöndring i minst 165 dagar.Dessutom avslöjar ELISA-baserad kvantifiering en 20-faldig ökning av total pigmentepitelhärledd faktorsekretion i transfekterade primära humana RPE-celler jämfört med respektive icke-transfekterade kontrollceller. Denna ökning bekräftades också på genuttrycksnivån vid vilken det totala PEDF-uttrycket höjdes mer än 30 gånger. När du försöker detta protokoll är det viktigt att använda pigmentepitelceller vars morfologi motsvarar In Vivo-statusen.Kom också ihåg att dra upp celllösningen i transfektionsspetsen utan luftbubblor. De stabilt transfekterade cellerna kan användas i olika Ex Vivo- eller In vivo-modeller för att verifiera funktionaliteten hos denna cellbaserade genadditionsterapi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Skin stansbiopsi Explantationsersättning Kultur för Derivering av primära humana fibroblaster

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifiering av<em&gt; Törnrosa</em&gt; Transposoninsättningar i solida tumörer med Linker-medierad PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse avbildning av primära preneoplastiska bröstepitelialceller celler från genetiskt modifierade musmodeller av bröstcancer

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolering, Frysförvaring och kultur för mänskliga amnion epitelceller för kliniska tillämpningar

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Utföra subretinal injektioner i Gnagare att leverera pigmentepitelet celler i suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypic hög genomströmning system för karakterisering av läkemedelskänslighet av primära multipelt myelom celler

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Induktion av accelererad åderförkalkning hos möss: "Wire-skada" Modell

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Isolering av primära mänskliga Decidual celler från foster hinnor av termen efterbörd

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Visualisering av endogena Mitofagkomplex in situ i mänskliga bukspottskörteln beta celler använder närhet ligation assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer

Mätning av karotenoider i Perifovea med hjälp av makulapigmentets reflektor

The macular pigment reflectometer (MPR) objectively measures the overall macular pigment optical density (MPOD) and further provides the lutein optical ...