Name: electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system
Uploaded: 2021-02-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin araştırma, teknolojik geliştirme ve gösterim için Yedinci Çerçeve Programı, 305134 no'lu hibe anlaşması ile desteklenmiştir. Zsuzsanna Izsvák, Avrupa Araştırma Konseyi, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742) tarafından finanse edildi. Yazarlar, mükemmel teknik destek için Anna Dobias ve Antje Schiefer'e (Oftalmoloji Bölümü, Üniversite Hastanesi RWTH Aachen) ve insan donör gözlerini sağladıkları için Aachen Cornea Bank'a (Oftalmoloji Bölümü, Üniversite Hastanesi RWTH Aachen) teşekkür eder.

İnsan donör gözleri, Helsinki protokolleri Deklarasyonu'na uygun olarak bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra Oftalmoloji Bölümü Aachen Cornea Bankası'ndan (RWTH Aachen Üniversite Hastanesi) alınmıştır. İnsan örneklerinin toplanması ve kullanılmasına ilişkin prosedürler kurumsal etik kurul tarafından onaylanmıştır.
1. Birincil insan RPE hücrelerinin izolasyonu
<ol><li>Steril koruyucu giysiler ve eldivenler yerleştirin. Laminer bir akışın altına steril bir ör...

Projemizde, transfekte edilen hücrelerin koruyucu bir ortamın kurulması ve sürdürülmesi için uzun süreli terapötik olarak kullanılması amacıyla sürekli olarak aşırı eksprese edilen ve etkili bir faktör salgılayan genetiği değiştirilmiş primer RPE hücrelerinin viral olmayan üretimini hedefliyoruz. Anti-anjiyojenik ve nöroprotektif fonksiyonlara sahip, her yerde eksprese edilen çok fonksiyonlu bir protein olan PEDF'yi kodlayan genin tanıtımını yaptık. Burada açıklanan protokol, SB100X</...

İleri yaş, nörodejeneratif hastalıklar için ana risk olarak tanımlanmaktadır. 60 yaşından büyük hastalarda ciddi görme kaybına yol açan poligenik bir hastalık olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), körlük ve görme bozukluğunun en yaygın dört nedenine aittir1 ve 2040 yılında 288 milyon kişiye yükselmesi beklenmektedir2. Koryokapillaris ve retinal fotoreseptörler arasında sıkıca paketlenmiş hücrelerin tek bir tabakası olan retinal pigment epitelinin (RPE) disfonksiyonları, AMD'nin patogenezine katkıda bulunur. RPE, normal bir retina fonksiyonu3 için gerekli olan birçok görevi yerine getirir ve retinanın ve koryokapilarisin yapısal bütünlüğünü korumak için gerekli olan çeşitli büyüme faktörlerini ve faktörlerini salgılar, böylece fotoreseptör sağkalımını destekler ve dolaşım ve besin tedariki için bir temel sağlar.
Sağlıklı gözlerde, pigment epitel kaynaklı faktör (PEDF), vasküler endotelyal büyüme faktörünün (VEGF) etkilerini dengelemekten sorumludur ve nöronları apoptoza karşı korur, endotel hücre proliferasyonunu önler ve kılcal endoteli stabilize eder. Değişmiş bir VEGF-PEDF oranı, hayvan modelleri 4,5'te ve AMD ve proliferatif diyabetik retinopatiye bağlı koroidal neovaskülarizasyon (CNV) olan hastaların örneklerinde gözlenen oküler neovaskülarizasyon ile ilişkilidir 6,7,8,9,10 . Gelişmiş VEGF konsantrasyonu, mevcut standart tedavinin hedefidir. Anti-VEGF farmasötikler bevacizumab, ranibizumab, aflibercept ve en son brolucizumab CNV hastalarının yaklaşık üçte birinde görme keskinliğini arttırır veya vakaların% 90'ında görmeyi stabilize eder11,12,13. Bununla birlikte, sıklıkla, genellikle aylık intravitreal enjeksiyonlar, advers olay riski taşır14, hasta uyumunu bozar ve sağlık sistemleri için önemli bir ekonomik yük oluşturur15. Ayrıca, hastaların belirli bir yüzdesi (% 2-% 20) anti-VEGF tedavisine cevap vermemekte veya sadece zayıf tepki vermektedir16,17,18,19. Bu negatif eşlik edenler, göz içi implantlar, hücre ve/veya gen terapötik yaklaşımlar gibi alternatif tedavilerin geliştirilmesini gerektirmektedir.
Gen terapisi, kalıtsal ve kalıtsal olmayan hastalıklar için umut verici bir tedavi olarak gelişmiştir ve fonksiyonel olmayan gen dizilerini restore etmeyi veya arızalı olanları bastırmayı amaçlamaktadır. Etken faktörlerin tanımlanması ve değiştirilmesinin pek mümkün olmadığı poligenik hastalıklar için, stratejiler koruyucu bir faktörün sürekli olarak verilmesini amaçlamaktadır. AMD durumunda, endostatin ve anjiyostatin20'nin kararlı ekspresyonu, VEGF antagonisti çözünür fms benzeri tirozin kinaz-1 (sFLT-1) 21,22, farklılaşmanın tamamlayıcı düzenleyici protein kümesi 59 (CD59)23 veya PEDF24,25 gibi çeşitli katkı tedavileri geliştirilmiştir. . Göz ve özellikle retina, kapalı yapısı, iyi erişilebilirliği, küçük boyutu ve bağışıklık ayrıcalığı nedeniyle gen bazlı bir ilaç için mükemmel bir hedeftir, böylece düşük terapötik dozların lokalize bir şekilde verilmesine izin verir ve nakillerin reddedilmeye daha az duyarlı hale getirilmesine izin verir. Ayrıca, göz non-invaziv izlemeye olanak tanır ve retina farklı görüntüleme teknikleri ile incelenebilir.
Viral vektörler, yüksek transdüksiyon verimlilikleri nedeniyle, terapötik genleri hedef hücrelere iletmek için ana araçtır. Bununla birlikte, kullanılan viral vektöre bağlı olarak, immün ve inflamatuar yanıtlar26, mutajenik ve onkojenik etkiler 27,28 veya diğer dokularda yayılma29 gibi farklı advers reaksiyonlar tanımlanmıştır. Pratik sınırlamalar arasında sınırlı bir ambalaj boyutu30'un yanı sıra31,32 klinik sınıf lotlarının üretimi ile ilgili zorluklar ve maliyetler bulunmaktadır. Bu dezavantajlar, lipo / polipleksler, ultrason veya elektroporasyon yoluyla aktarılan viral olmayan, plazmid bazlı vektörlerin daha da geliştirilmesini teşvik etmiştir. Bununla birlikte, transgenin konakçı genomuna genomik entegrasyonu genellikle plazmid vektörleri ile desteklenmez, böylece geçici bir ekspresyon ile sonuçlanır.
Transpozonlar, genom içindeki konumlarını değiştiren doğal olarak oluşan DNA fragmanlarıdır, bu da gen terapisi için benimsenmiş bir özelliktir. Aktif bir entegrasyon mekanizması nedeniyle, transpozon tabanlı vektör sistemleri, yerleştirilen transgenin sürekli ve sabit bir ifadesine izin verir. Uyuyan Güzel (SB) transpozonu, balık33'te bulunan eski bir Tc1 / denizci tipi transpozondan yeniden oluşturulmuş ve hiperaktif varyant SB100X34 ile sonuçlanan moleküler evrimle daha da geliştirilmiş, çeşitli birincil hücrelerde verimli transpozisyon sağlamıştır ve farklı hastalık modellerinde fenotipik düzeltme için kullanılmıştır35. Şu anda, SB transpozon sistemi kullanılarak 13 klinik çalışma başlatılmıştır. SB100X transpozon sistemi iki bileşenden oluşur: terminal ters çevrilmiş tekrarlar (TIR'lar) tarafından kuşatılan ilgi genini içeren transpozon ve transpozonu harekete geçiren transpozaz. Plazmid DNA'sının hücrelere verilmesini takiben, transpozaz TIR'ları bağlar ve transpozonun eksizyonunu ve hücrenin genomuna entegrasyonunu katalize eder.
Neovasküler AMD tedavisi için viral olmayan hücre bazlı bir katkı maddesi tedavisi geliştirdik. Yaklaşım, PEDF geninin SB100X transpozon sistemi 36,37,38 aracılığıyla primer pigment epitel (PE) hücrelerine elektroporasyon bazlı yerleştirilmesini içerir. Transpozaz ve PEDF'nin genetik bilgisi ayrı plazmidler üzerinde sağlanır, böylece ideal SB100X-PEDF transpozon oranının ayarlanmasını sağlar. Elektroporasyon, yüzey alanlarını en aza indirirken elektrotlar arasında maksimum boşluk boyutu ile karakterize edilen pipet bazlı bir kılcal transfeksiyon sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. Cihazın çok çeşitli memeli hücrelerinde mükemmel transfeksiyon oranları elde ettiği gösterilmiştir 39,40,41. Küçük elektrot yüzey alanı düzgün bir elektrik alanı sağlar ve elektroliz42'nin çeşitli yan etkilerini azaltır.
Transfekte pigment epitel hücreleri tarafından salgılanan PEDF'nin anti-anjiyojenik işlevselliği, insan göbek damarı endotel hücrelerinin filizlenme, göç ve apoptozunu analiz eden çeşitli in vitro deneylerde gösterilmiştir43. Ek olarak, kornea neovaskülarizasyonunun tavşan modelinde PEDF-transfekte hücrelerin transplantasyonu44 ve CNV 43,45,46'nın sıçan modelinde neovaskülarizasyonun azaldığını göstermiştir.
Burada, kılcal transfeksiyon sistemi kullanarak SB100X transpozon sistemi aracılığıyla PEDF geninin birincil insan RPE hücrelerine kararlı bir şekilde yerleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Transfekte edilen hücreler 21 gün boyunca kültürde tutuldu ve daha sonra kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile PEDF gen ekspresyonu ve immünoblotasyon ve enzime bağlı immünosorbent testi ile PEDF protein sekresyonu açısından analiz edildi (ELISA, Şekil 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isolation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Forceps</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel (No. 11)</td>
			<td>Feather, Osaka, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Pointed Eye Scissor&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-19405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Brand, Wertheim, Germany</td>
			<td>747715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Drape</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher, Rengsdorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gauze Compress&#160;</td>
			<td>Fink-Walter, Merchweiler, Germany</td>
			<td>321063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Sempermed, Wien, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm)</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Surgical Gown</td>
			<td>Halyard Health, Alpharetta, GA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Iris Forceps&#160;</td>
			<td>Geuder, Heidelberg, Germany</td>
			<td>G-18855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation of primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>150628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>0030722019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Leica DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Transfection System (Neon Transfection System)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+</td>
			<td>Biochrom, Berlin, Germany</td>
			<td>L182-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>12163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyses of transfected primary human RPE cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS-Polyacrylamide Gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x SDS Sample Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Protran Supported 0.2 &#181;m&#160;Nitrocellulose Blotting Membrane</td>
			<td>Cytiva, Marlborough, MA</td>
			<td>10600015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B [250 &#181;g/mL] (AmphoB)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>AB-PEDF1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal)</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>34660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Ham&#8217;s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P04-41150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum [0.2 &#181;m Sterile Filtered] (FBS)</td>
			<td>PAN-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer (Neubauer Chamber)</td>
			<td>Paul Marienfeld, Lauda-K&#246;nigshofen, Germany</td>
			<td>0640110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal)</td>
			<td>Agilent Dako, Santa Clara, CA</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td>
			<td>ab6721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human PEDF ELISA Kit&#160;</td>
			<td>BioProducts, Middletown, MD</td>
			<td>PED613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm, Minato, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 1.2 Instrument</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>12239264001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#160;Capillaries (20 &#956;l)</td>
			<td>Roche Life Science, Penzberg, Germany</td>
			<td>4929292001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Cell Casting Module</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN&#160;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>30410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep)</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (10 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips (200 &#181;L)</td>
			<td>Starlab, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcription System&#160;</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom</td>
			<td>SSM3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (0.1-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Pipette (10-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany</td>
			<td>1704150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05&#160;%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation-based genetic modification of primary human pigment epithelial cells using the sleeping beauty transposon system

Giderek yaşlanan toplumumuz, nörodejeneratif hastalıkların artan insidansına yol açmaktadır. Şimdiye kadar, patolojik mekanizmalar yeterince anlaşılmamış, bu nedenle tanımlanmış tedavilerin kurulmasını engellemiştir. Koruyucu bir faktörün artan ekspresyonu için hücre bazlı katkı gen tedavileri, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmek için umut verici bir seçenek olarak kabul edilir. Sinir sisteminde nöroprotektif ve anti-anjiyojenik bir protein olarak karakterize edilen pigment epitel kaynaklı faktörü (PEDF) kodlayan genin, Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak primer insan pigment epitel (PE) hücrelerinin genomuna stabil ekspresyonu için bir yöntem geliştirdik. Primer PE hücreleri insan donör gözlerinden izole edildi ve kültürde tutuldu. Birleşmeye ulaştıktan sonra, 11 μL resüspansiyon tamponunda 1 x 104 hücre askıya alındı ve 30 ng hiperaktif SB (SB100X) transpozaz plazmidi ve 470 ng PEDF transpozon plazmidi içeren 2 μL saflaştırılmış bir çözelti ile birleştirildi. Genetik modifikasyon, aşağıdaki parametreler kullanılarak kılcal bir elektroporasyon sistemi ile gerçekleştirildi: 1.100 V voltajlı ve 20 ms genişliğinde iki darbe. Transfekte hücreler, fetal sığır serumu ile desteklenmiş ortam içeren kültür plakalarına aktarıldı; antibiyotikler ve antimikotikler ilk orta değişim ile eklendi. Başarılı transfeksiyon bağımsız olarak yapılan deneylerde gösterilmiştir. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), PEDF transgeninin artmış ekspresyonunu gösterdi. PEDF sekresyonu, immünoblotlama ile değerlendirildiği ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile ölçüldüğü gibi anlamlı derecede yükselmiş ve stabil kalmıştır. SB100X aracılı transfer, PE hücrelerinin genomuna stabil bir PEDF gen entegrasyonuna izin verdi ve AMD veya diğer retinal dejeneratif hastalıkları tedavi etmek için hücre bazlı bir gen ekleme tedavisinin geliştirilmesi için kritik olan PEDF'nin sürekli salgılanmasını sağladı. Dahası, PEDF transpozonunun insan PE hücrelerine entegrasyon profilinin analizi, neredeyse rastgele bir genomik dağılım olduğunu göstermiştir.

Birincil insan RPE hücrelerinin yetiştirilmesi ve elektroporasyonu Yeterli sayıda hayvansal kökenli birincil RPE hücresinin tohumlanmasının, pigmentli, altıgen şekilli hücrelerin entegre bir tek katmanlı 36,37,48'e yetiştirilmesine ve büyümesine izin verdiğini gösterdik. Sıkı kavşaklar oluşturma, fagositik aktivite gösterme ve spesifik belirteç genlerini ...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System at JoVE.com

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak pigment epitel türevi faktörü (PEDF) kodlayan gen ile elektroporasyon yoluyla primer insan pigment epitel hücrelerini transfekte etmek için bir protokol geliştirdik. Başarılı transfeksiyon, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), immünoblotlama ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile gösterilmiştir.

Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi Kullanılarak Primer İnsan Pigment Epitel Hücrelerinin Elektroporasyon Tabanlı Genetik Modifikasyonu

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Bu yöntem, transgen ekspresyonu ve protein sekresyonu için bir kanıt olan Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi kullanılarak birincil insan pigment epitel hücrelerinin elektroporasyon bazlı transfeksiyonunu göstermektedir. Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi ve elektroporasyonun kombinasyonu, birincil insan pigment epitel hücrelerinin etkili transfeksiyonunun yanı sıra stabil ve kalıcı transgen ekspresyonu ve protein sekresyonunu sağlar. Genel amaç, terapötik olarak aktif proteinin stabil ve kalıcı olarak salgılanmasını gerektiren retinal dejeneratif hastalıkların tedavisi için hücre bazlı bir gen ilavesi tedavisi oluşturmaktır.Prosedürü gösterenler, laboratuvardan tıbbi teknik asistanlar olan Anne Freialdenhoven ve Antje Schiefer olacak. Plasmid DNA'sını birincil insan RPE hücresi elektroporasyonuna hazırlamak için, Plazmid DNA içeriğini ölçmek için bir mikro hacimli spektrofotometre kullanın ve konsantrasyonu 10 milimolar Tris-HCL'de mikrolitre başına 250 nanograma ayarlayın. SB100X transpozaz Plazmid DNA'sının mikrolitresi başına 250 nanogramlık bir hacmi, mikrolitre pigment epiteli kaynaklı faktör transpozon Plazmid DNA'sı başına 16 hacim 250 nanogram ile karıştırın.Elde edilen plazma karışımının iki mikrolitresini buz üzerinde steril bir 1,5 mililitre güvenli kilit mikro santrifüj tüpüne ekleyin ve bir tampon tüpünü üç mililitre tampon E. ile doldurun Daha sonra bir tıklama duyulana kadar tüpü pipet istasyonuna yerleştirin ve transfeksiyon cihazını 1.100 volta, 20 milisaniyelik bir darbe genişliğine ve iki darbeye ayarlayın. Hücreleri elektroporasyona hazırlamak. İlk olarak, büyümelerini ve akıcılıklarını değerlendirmek için faz kontrast mikroskobu ile primer RPE hücre kültürlerinin morfolojisini kontrol edin.Hücreleri, hücre kültürü inkübatöründe yedi ila 15 dakika boyunca kuyu başına 500 mikrolitre% 0.05 Tripsin EDTA ile tedavi edin. Hücreler ayrıldığında, hücreleri santrifüjleme yoluyla toplayın, hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya alın ve transfeksiyon reaksiyonu başına dört hücre alikotuna bir ila 10 kez 10 santrifüj yapın. Peletleri tüp başına 11 mikrolitre tampon R içinde yeniden askıya alın ve hazırlanan plazmid karışımının iki mikrolitresini her tüpe ekleyin.Bir transfeksiyon pipetinin kafasını, kelepçe pistonun montaj gövdesini tamamen alana ve hücre ve plazmid çözeltisini transfeksiyon ucuna yükleyene kadar 10 mikrolitrelik bir transfeksiyon ucuna yerleştirin. Transfeksiyon pipetini, bir tıklama duyulana kadar pipet istasyonu içine yerleştirilen tampon tüpüne yerleştirin ve elektroporasyon işlemine başlamak için başlat düğmesine basın. Transfeksiyondan sonra, transfeksiyon pipetini pipet istasyonundan dikkatlice çıkarın ve hemen hücre ve plazmid çözeltisini hücre kültürü plakasının hazırlanan kuyucuklarına pipetleyin.Etiketli pigment epiteli kaynaklı faktör füzyon proteinlerini RPE hücre kültürü süpernatantlarından arındırmak için. İlk olarak, numune başına bir adet 30 mikrolitre nikel NTA bulamacı aliquot toplamak için bir konik kesim ucu kullanın ve nikel NTA reçinesini santrifüjleme ile pelet edin. Nikel NTA reçinesini 200 mikrolitre One X inkübasyon tamponu ile dikkatlice askıya alın ve çözeltiyi iki kez ek bir santrifüjleme ile pelet edin.İkinci santrifüjlemeden sonra, nikel NTA reçine peletlerini numune başına 40 mikrolitre Four X inkübasyon tamponu ile dikkatlice yeniden askıya alın. Daha sonra 55 mikrolitre bir aliquot ön işlemden geçirilmiş nikel NTA bulamacı, 260 mikrolitre Dört X inkübasyon tamponu ve her transefcted RPE hücre kültürü süpernatan 900 mikrolitre ile karıştırın. Karışımı 60 dakika boyunca oda sıcaklığında sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin ve nikel NTA reçine karışımlarını tekrar pelet edin.Peletleri 175 mikrolitre One X inkübasyon tamponunda dikkatlice askıya alın ve karışımları iki kez daha santrifüj edin. İkinci santrifüjlemeden sonra, nikel NTA reçine peletlerini 30 mikrolitre Elüsyon tamponunda oda sıcaklığında 20 dakikalık bir inkübasyon için dikkatlice yeniden askıya alın ve numuneleri tekrar çalkalayın ve santrifüj yapın. Daha sonra süpernatantları dikkatlice toplayın ve saflaştırılmış proteinlerin batı kan analizi için İki X SDS numune tamponu ile karıştırın.İnsan donör gözlerinden izole edilen ekili primer RPE hücreleri, donörün yaşına, ölüm sonrası izolasyon zamanına veya ekim zamanına bakılmaksızın tipik bir parke taşı morfolojisi göstermektedir. Kısa süreli elektrik darbelerinin birincil insan RPE hücrelerine uygulanması. Kılcal transfeksiyon sisteminin kullanılması epitel morfolojisini olumsuz yönde etkilemez.Transfekte primer insan RPE hücre kültürü süpernatantlarının Batı kan analizi, 500 günden fazla bir süre boyunca transgen susturulmadan tutarlı seviyelerde pigment epitel kaynaklı faktör sekresyonunu göstermektedir. Seri olarak gerçekleştirilen transfeksiyonlardan hücre kültürü ortamının bu temsili Batı kan analizinde gözlemlendiği gibi, transfeksiyondan 21 gün sonra evrensel olarak daha yüksek pigment epitel kaynaklı faktör sekresyon hızı gözlenmektedir. Takip edilen bir kültürde, uzun süreli yüksek PEDF sekresyonu en az 165 gün sürer.Ek olarak, ELISA bazlı niceleme, transfekte primer insan RPE hücrelerinde toplam pigment epitel kaynaklı faktör sekresyonunun, transfekte edilmemiş kontrol hücrelerine kıyasla 20 kat arttığını ortaya koymaktadır. Bu artış, toplam PEDF ekspresyonunun 30 kattan fazla yükseltildiği gen ekspresyon seviyesinde de doğrulandı. Bu protokolü denerken, morfolojisi In Vivo durumuna karşılık gelen pigment epitel hücrelerinin kullanılması önemlidir.Ayrıca, hücre çözeltisini hava kabarcıkları olmadan transfeksiyon ucuna çekmeyi unutmayın. İstikrarlı transfekte hücreler, bu hücre bazlı gen ekleme tedavisinin işlevselliğini doğrulamak için farklı Ex Vivo veya In vivo modellerinde kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

İlköğretim İnsan Fibroblastlar türetilmesi için Cilt Punch Biyopsi Eksplantın Kültür

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Tanımlanması<em&gt; Sleeping Beauty</emLinker-aracılı PCR kullanarak Solid Tümörlerde&gt; Transposon Eklemeler

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Farelerde Hızlandırılmış Ateroskleroz Indüksiyonu: "Tel-Yaralanma" Modeli

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Yakınlık ligasyon assay kullanarak ınsan pankreatik Beta hücrelerinde situ Içinde endojen Mitophagy kompleksleri görselleştirme

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Measurement of Carotenoids in Perifovea using the Macular Pigment Reflectometer

Makula Pigment Reflektometresi Kullanılarak Perifovea'daki Karotenoidlerin Ölçülmesi

The macular pigment reflectometer (MPR) objectively measures the overall macular pigment optical density (MPOD) and further provides the lutein optical ...