Name: studying cavitation enhanced therapy
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Cavitation Enhanced Therapy at JoVE.com

Forfatterne takker Engineering and Physical Sciences Research Council for at støtte dette arbejde gennem tilskud EP/L024012/1. VB støttes også af Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) og Medical Research Council (MRC) (grant EP/L016052/1). VB og AV takker Clarendon Foundation for Post Graduate Scholarships. AV også tak Exeter College for en Santander stipendium. Forfatterne står i gæld til James Fisk og David Salisbury for deres uvurderlige hjælp til fremstilling af apparatet. De anerkender også taknemmeligt bidragene fra Drs. Dario Carugo og Joshua Owen i udviklingen af tidligere prototype SATs.

Forfatterne har intet at afsløre.

De kritiske skridt for enhver akustisk måling blev indkapslet af Apfel i 198176 som "kend din væske, kend dit lydfelt, ved, hvornår der sker noget." I forbindelse med denne protokol omfatter disse transducerkalibrering og -justering samt vandforberedelses- og boblehåndteringstrinnene. For det første er det vigtigt, at den hydrofon, der anvendes til kalibrering af den drivende transducer og/eller PCD, selv er nøjagtigt kalibreret gennem regelmæssig ekstern service eller intern sammenligning med en referencestandard. På samme måde skal reaktionen fra både køretransduceren og PCD regelmæssigt karakteriseres for at kontrollere, om der er ændringer i outputtet og/eller tab af følsomhed. Hvis systemets kørselsforhold og modtage følsomhed er ukendte, vil det være umuligt at udlede nogen meningsfuld sammenhæng mellem eksponeringsforhold, biovirkninger og akustiske emissioner. Direkte i denne forbindelse skal transducernes tilpasning til hinanden og prøvekammeret kontrolleres nøje for at sikre, at eksponeringsbetingelserne i kammeret er som forventet, og at prøvetagningsvolumen for pcd'et svarer til det pågældende område. Som nævnt kan temperatur- og gasindholdet i ophængningsmediet påvirke de endelige resultater betydeligt, og konsistens er yderst vigtig i denne henseende77,78. På samme måde kræver præparatet, karakteriseringen og håndteringen af suspensionen af kavitationsmidlet meget nøje opmærksomhed for at sikre, at den forventede størrelsesfordeling og koncentration af partikler er til stede i prøven. For eksempel, hvis koncentrationen af bobler er for høj, vil der være effektiv afskærmning af prøvevolumen fra hændelsen amerikanske felt. MB-agenser er særligt modtagelige for ødelæggelse og sammensmeltning, og yderligere vejledning om håndteringen af dem findes i Mulvana et. al. (2012)79.
Et meget almindeligt problem med påvisning af kavitationssignaler er at opnå en passende SNR. Dette skyldes til dels selve signalets art, som beskrevet, men kan også skyldes kilder til elektrisk støj inden for forsøgsopsætningen. Kontrol af forbindelserne mellem systemkomponenter, især dem, der involverer koaksialkabler, kan bidrage til at fjerne nogle af disse. Udskiftning eller reparation af koaksialkabler kan være nødvendig. Identifikation og fjernelse eller deaktivering af andet udstyr i laboratoriet, såsom pumper, der kan forårsage elektrisk støj, kan også hjælpe. Dårlig elektrisk impedansmatchning mellem systemkomponenter kan være en yderligere årsag til dårligt signal til støjforhold og også potentielt skade på udstyr og bør kontrolleres omhyggeligt. De udløsende indstillinger på signalgeneratoren og oscilloskopet bør ligeledes kontrolleres for at bekræfte, at de er konfigureret korrekt til eksperimentet og ikke er vendt tilbage til producentens standardindstillinger. Hvis der er betydelig ødelæggelse af bobler under håndtering, i tilfælde af SAT2, kan det være nyttigt at fastgøre en anden sprøjte til udløbsporten og bruge dette til forsigtigt at udtrække væske fra kammeret og derved trække i suspensionen. Dette kan også hjælpe med at eliminere makrobobler eller aktivere flow under amerikansk eksponering, hvis det ønskes.
Det er ikke muligt helt at eliminere akustiske refleksioner i prøvekammeret, og derfor vil hændelsesfeltet ikke være helt ensartet over hele prøvevolumenet. Som nævnt i trin 1.3.2 og 1.3.3 vil muligheden for at overføre akustiske vinduer være frekvensafhængig, og den ønskede båndbredde til akustiske emissionsmålinger bør derfor overvejes nøje. Der kan især være betydelige flere refleksioner af højere frekvenskomponenter. Dette er en anden grund til, at kalibrering af feltet i det fuldt samlede system er så vigtig for at minimere usikkerheden i hændelsestrykket. Passende gating af de registrerede signaler bør også overvejes for at minimere virkningerne af flere refleksioner. Brugen af kommercielle anordninger for nemheds skyld og behovet for akustisk gennemsigtighed betyder, at en vis optisk gennemsigtighed skal ofres. Dette kan påvirke kvaliteten af efterfølgende billeddannelse, f.eks. Nogle af de membraner, der anvendes i kommercielle enheder, er også porøse, og der opstår således ufuldkommen isolation mellem prøvekammeret og det omgivende vandbad. Som ovenfor kan den tilsvarende risiko for kontaminering mindskes ved hjælp af et mindre underkammer, hvis indhold regelmæssigt kan udskiftes. De cellekulturanordninger, der er angivet i materialetabellen, er primært egnet til cellemonomer, der muligvis ikke er repræsentative for væv, hvad angår alle amerikanske/kavitationsmedierede biovirkninger. Cellernes nærhed til en fast overflade vil også påvirke MB-dynamikken på en måde, der måske ikke afspejler forholdene in vivo, f.eks. Disse begrænsninger kan imidlertid afhjælpes ved blot at erstatte alternative vævsmodeller.
Formålet med at foreslå SATs er at tilvejebringe et middel til at forbedre reproducerbarheden af akustiske eksponeringsforhold og akustiske emissioner mellem undersøgelser af amerikansk medierede biovirkninger, hvilket forhåbentlig vil lette en bedre forståelse af de underliggende mekanismer og udviklingen af behandlingsovervågningsteknikker for at forbedre sikkerheden og effektiviteten. Systemerne er designet til at være kompatible med kommercielt tilgængelige cellekulturudstyr, hvilket gør det muligt at udføre en bred vifte af biologiske assays i henhold til anvendelse af interesse og muliggøre udførelsen af eksperimenter med høj gennemløb, hvilket fjerner behovet for tidskrævende tilpasningsprocedurer mellem kørsler. Ved at standardisere protokoller for karakterisering af eksponeringsforhold og opsamling af akustiske emissioner kan systemets afhængige variabilitet forhåbentlig reduceres. Den række parametre, der bør undersøges for et bestemt forsøg, vil afhænge af anvendelsen (ønsket bioeffekt, celletype, dybde af målvæv, hvis in vivo osv.) og arten af ethvert kavitationsmiddel, der anvendes. I betragtning af det store antal variabler (amerikansk frekvens, trykforstærkning, pulslængde, pulsgentagelsesfrekvens osv.) er det usandsynligt, at det vil være praktisk muligt at udforske hele parameterrummet fuldt ud. En fordel ved den foreslåede protokol er, at den gør det muligt hurtigt at oprette nogle grænser for dette parameterområde. For eksempel gør det det muligt at bestemme det mindste tryk, hvor der genereres et kavitationssignal, det maksimale tryk eller pulslængde, der kan bruges, før celleafmontering / død opstår, og det tryk, hvor der produceres fraktioneret harmoniske eller bredbåndsstøj. Det anbefales, at et sådant sæt afgrænsningsmålinger udføres som et første skridt i enhver undersøgelse.
Som præsenteret er SAT'erne designet til realtidsovervågning af akustiske emissioner, hvor biologiske assays udføres uden for eksperimentet. Det ville imidlertid være forholdsvis enkelt at ændre SAT for at muliggøre direkte optisk observation af prøvekammeret via et mikroskopmål. Dette kan igen kobles til et fluorescens- og/eller højhastighedsmikroskopisystem for f.eks. PCD-outputtet, som det i øjeblikket præsenteres med hensyn til spænding, indikerer: i) typerne af kavitationsadfærd og deres relative proportioner; ii) hvor længe disse kavitationsadfærd fortsætter; iii) om de observerede tids-kumulative eksponeringskarakteristika er korreleret med en bestemt bioeffektiv virkning og iv) om de relative niveauer og tidsafhængige adfærd er i overensstemmelse med tidligere forsøg i eksponeringssystemet. Mens pcd'ets modtagefølsomhed kan kvantificeres for pålideligt at karakterisere de akustiske emissioner i form af absolut energi, kræves der yderligere rumlig information. Dette kan opnås ved at erstatte PCD med en array sonde til at gennemføre passiv akustisk kortlægning (PAM)80. Dette vil imidlertid øge kompleksiteten af signalbehandling og den beregningsmæssige tid og strøm, der kræves.
Andre instrumenter til måling af membranens elektriske modstand eller anvendelse af fysiske målretningsmetoder, f.eks. Det ville også være muligt at bruge tre-dimensionelle væv strukturer såsom tumor sfæroider, organoider, eller endda ex vivo vævsprøver på akustisk "bløde" gel substrater i stedet for cellen monolayers at studere USA og kavitation-medieret effekter i mere realistiske væv miljøer.

Ultralyd (US) er blevet brugt bredt som en diagnostisk billeddannelse teknik på grund af sin sikre og ikke-invasive karakter, dens let gennemførelse på en patients seng, og dens omkostningseffektivitet1. Ved siden af sin diagnostiske og overvågning kapaciteter, USA har et betydeligt potentiale for terapeutiske applikationer. Tidligt arbejde udforskede dets anvendelse i trombolyse, DNA-transfekt, og levering af lægemidler2,3,4 og terapeutisk USA repræsenterer nu et meget aktivt forskningsområde med applikationer, herunder tumorbehandling5,6,7,immunterapi8,9, blod-hjerne-barriere (BBB) forstyrrelse10,11,12, trombolyse13,14,15og bakteriel infektionsbehandling16,17. Et centralt fænomen, der understøtter disse applikationer, er kavitation: nukleation, vækst og svingning af gasformige hulrum på grund af ændringer i væsketryk18,19.
Der er en række mekanismer, hvorved kavitation giver biologiske virkninger. For eksempel kan den meget ikke-lineære karakter af boble svingninger under påvirkning af en anvendt amerikansk felt generere microstreaming i den omgivende væske, der både kan forbedre stof konvektion20 og udøve forskydning understreger på vævet i nærheden af boblerne. Dette er især udbredt, når bobler er i nærheden af en grænse, hvilket får bobler til at svinge ikke-sfærisk og potentielt kan fremme optagelse af lægemidler gennem forskydningsinduceret gennemtrængningsgennemtrængning21,22,23,24. Ved højere tryk observeres større amplitude svingninger og hurtigt boblekollaps, der giver direkte mekanisk stress25 og ofte genererer chokbølger og deraf følgende store trykgradienter, der kan forstyrre og gennemtrænge væv26,27. Sammenbruddet af bobler nær en overflade kan også resultere i dannelsen af høj hastighed flydende mikrojets28,29,30. Disse mikrojets kan trænge ind i væv, potentielt skabe porer eller fremkalde sekundære stressbølger31,32. Gennemtrængning af biologiske membraner på både væv og cellulære niveauer kaldes skiftevis sonophoresis, der primært anvendes i forbindelse med amerikansk induceret forbedring i hudens permeabilitet33,34og sonoporation, der hovedsagelig bruges til at beskrive den reversible gennemtrængning af cellemembranen på grund af dannelsen af membranporer35,36.
Tyktflydende absorption i væsken umiddelbart omkring svingboblen kan give en betydelig varmeeffekt37. Desuden producerer de meget ikke-lineære svingninger akustisk stråling ved frekvenser, der er højere end det drivende amerikanske felt. Dette fører til øget absorption i det omgivende væv og yderligere opvarmning38. Boblekollaps kan også ledsages af kemiske virkninger på grund af de forbigående høje temperaturer og tryk i boblekernen, såsom generering af meget reaktive arter og elektromagnetisk stråling, kendt som sonoluminescens32. Disse virkninger er blevet undersøgt for at vurdere potentielle skader og/eller aktivering af relevante cellulære veje til levering39 og udnyttet ved lokal aktivering af lysfølsomme lægemidler i en såkaldt sonodynamisk behandling40,41,42,43.
Mange amerikansk medierede biovirkninger kan kun påbegyndes gennem kontrol af amerikanske feltparametre (trykforstærkning, frekvens, pulslængde og gentagelsesfrekvens og eksponeringsvarighed), men pålideligt genererer kavitation i biologisk væv kræver ofte høj inputenergi og indebærer derfor en forhøjet risiko for skade. Indførelse af eksogene eller kunstige kavitationskerner kan i væsentlig grad reducere den tilførselsenergi, der er nødvendig for at producere den brede vifte af virkninger, der er beskrevet ovenfor, og yderligere introducerer yderligere virkninger, som måske ikke er mulige med USA alene. Kavitationskerner omfatter gasbobler26,44, flydende dråber45,46,47 og faste partikler48,49,50, hvor nanoskala kavitationskerner er et spirende undersøgelsesområde til deres fordele med hensyn til langvarig cirkulationstid, forbedret ekstravasation og langvarig kavitationsaktivitet49,51,52,53.
De mest almindeligt anvendte kerner er gasmikrobobler (MB), der oprindeligt blev brugt som kontraststoffer i diagnostisk billeddannelse. De er typisk 1-2 mikrometer i diameter og indeholder en kerne af en højmolekylær-vægt gas med lav vandig opløselighed i det omgivende medium. Kernen er omgivet af en beskyttende lipid, protein eller polymerskal, der oftest består af fosforlipider54. Når de udsættes for et amerikansk felt, får MBs kompressibilitet dem til at gennemgå volumetriske svingninger, hvilket giver stærk akustisk spredning, som er ansvarlig for MBs succes som kontrastmiddel. Som nævnt fører disse svingninger også til de førnævnte mekaniske, termiske og kemiske virkninger, der kan udnyttes i terapeutiske applikationer. MB-belægningsprocessen tilbyder også en mekanisme til indkapsling af lægemidler inden for MB-strukturen og til fastgørelse af lægemidler og/eller målretning af arter til MB-overfladen. Denne teknik letter den udløste frigivelse af lægemidler for at reducere systemisktoksicitet 55. Det er også for nylig blevet påvist, at materiale fra MB-overfladen kan overføres til biologiske strukturer, hvilket forbedrer lægemiddellevering gennem såkaldt "sonoprinting"56,57,58.
Overvågning af usa-medieret kavitationsaktivitet kan give indsigt i de resulterende biologiske virkninger både in vitro og in vivo og giver potentielt mulighed for tuning og optimering af disse virkninger. De to mest anvendte metoder til overvågning af kavitationsaktivitet er i) optisk, som anvender ultrahurtsbåndsvideomikroskopi og generelt ikke er mulige in vivo; og ii) akustiske, som registrerer de udstrålede lydfelter, der produceres af oscillerende og/eller kollapsende bobler. Både amplitud- og frekvenskomponenterne i det akustiske signal indeholder oplysninger om bobleadfærd. Lave koncentrationer af bobler ved lav hændelse amerikanske amplituder har vist sig at producere overvejende harmoniske emissioner (heltals multipla af kørefrekvensen)59. Efterhånden som kørselspresset stiger, kan bobleemissionsspektret også indeholde fraktionerede komponenter kendt som subharmonics og ultraharmonics60, der indikerer stærkere ikke-lineær adfærd samt bredbåndsstøj, hvilket er tegn på inertiel kavitation. Heltalsharmoniker er en primær indikator for boblesvingninger, men kan også være forårsaget af ikke-lineære forhold overalt i et forsøgssystem, f.eks. Derimod er fraktioneret harmoniske og bredbåndsstøj meget stærkt korreleret med bobledynamik.
Forholdet mellem bobleadfærd og de fundne akustiske emissioner kan kompliceres af faktorer, herunder hændelsen amerikanske felt, nukleationsmiljøet og egenskaberne ved detektionsvejen60. Ikke desto mindre kan vigtige oplysninger om bobleadfærd og deres interaktioner med celler opnås ved at skelne tendenser i frekvens og energi i det akustiske spektrum. Disse data kan også give værdifulde oplysninger, der kan bruges til at danne grundlag for kliniske behandlingsovervågningsteknikker. For fuldt ud at udnytte disse oplysninger er det nødvendigt at udvikle robuste, omsættelige og reproducerbare forsøgsmetoder.
I øjeblikket er der betydelig variation i rapporterede protokoller for at designe systemer og gennemføre undersøgelser for at støtte udviklingen af kavitation-støttede behandlinger. Med hensyn til apparatet er der foretaget en række konstruktionsmetoder. Flere grupper har gjort brug af parallel-pladekamre 56,61,62,63, enten specialbygget eller kommercielt tilgængelige (f.eks OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et al. (2013) udviklede et cellekammer kombineret med et amerikansk sonikeringsmodul og confocal imaging i realtid64, Carugo et al. (2015) anvendte et system bestående af en kommercielt tilgængelig cellekulturskål med et skræddersyet PDMS-låg for at muliggøre dykning i et vandbad under amerikansk eksponering65, og Pereno et al. (2018) brugte en enhed bestående af lagdelte acoustofluidic resonatorer, der giver mulighed for samtidig optisk og akustisk karakterisering af bobledynamik og boblecelleinteraktioner66. Brugen af specialfremstillede og anvendelsesspecifikke design komplicerer karakteriseringen af det amerikanske felt og andre miljøeksponeringsforhold, hvilket gør krydsstudiesammenligninger udfordrende. For eksempel er der betydelig variation i de amerikanske parametre identificeret for at opnå en vellykket sonoporation, som omfatter centerfrekvenser fra 0,02 til 15 MHz, arbejdscyklusser varierende fra 1% til kontinuerlig bølge, og sjældnefactional tryk spænder fra 0,1 til 20 MPa23,64,67,68,69,70 ( Tabel1). Der er ligeledes betydelig variation i spektralkomponenterne (harmoniske komponenter, subharmonier osv.), som er blevet identificeret som værende forbundet med særlige biovirkninger.
Formålet med dette arbejde er derfor at skabe en let reproducerbar systemudformnings- og gennemførelsesramme for den in vitro-undersøgelse af kavitationsfremkaldte cellulære biovirkninger med specifik inddragelse af en kavitationsovervågningskapacitet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorber</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>APTFlex F28 panel</td>
			<td>1.0 cm standard thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (power)</td>
			<td>E&#38;I Ltd.</td>
			<td>1040L</td>
			<td>400W power amplifier to drive ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (pre)</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR445A</td>
			<td>Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium heater</td>
			<td>Aquael</td>
			<td>Ultra 50W</td>
			<td>Different models for different tank sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>TiePie Engineering</td>
			<td>HS5-110-XM</td>
			<td>Extended memory option: 32M points per channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>FOH</td>
			<td>0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>SonoVue</td>
			<td>FDA approved microbubbles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD mirror (SAT3)</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>F-102</td>
			<td>90 degree beam reflection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD transducer</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>V320-SU</td>
			<td>Immersion transducer, 7.5MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD waterproof cable</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>BCU-58-1 W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (SAT2 compartment lid)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer rod (SAT2 seal)</td>
			<td>Zeus</td>
			<td>PTFE monofilament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber plug (SAT3 lid/seal)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-2101</td>
			<td>6mm bottom dia., 8mm top dia., red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>33250</td>
			<td>Waveform generator for ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>&#181;-Dish 35mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT3</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Transwell 6.5mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound source (SAT3)</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>H107 with central hole</td>
			<td>Use of a HIFU-capable source allows pressures &#62;1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying cavitation enhanced therapy

Interessen for ultralyds terapeutiske anvendelser er betydelig og voksende, med potentielle kliniske mål lige fra kræft til Alzheimers sygdom. Kavitation - dannelsen og den efterfølgende bevægelse af bobler inden for et ultralydsfelt - repræsenterer et nøglefænomen, der understøtter mange af disse behandlinger. Der er dog fortsat betydelig usikkerhed med hensyn til de detaljerede virkningsmekanismer, hvorved kavitation fremmer terapeutiske virkninger, og der er behov for at udvikle pålidelige overvågningsteknikker, der kan gennemføres klinisk. Der er især betydelig variation mellem undersøgelser i de eksponeringsparametre, der rapporteres som havende kunnet levere terapeutiske virkninger, og de tilsvarende akustiske emissioner. Formålet med dette dokument er at give design retningslinjer og en eksperimentel protokol ved hjælp af bredt tilgængelige komponenter til at udføre undersøgelser af kavitation-medierede biovirkninger, og omfatter real-time akustisk overvågning. Det er håbet, at protokollen vil muliggøre en mere udbredt inkorporering af akustisk overvågning i terapeutiske ultralydseksperimenter og lette lettere sammenligning på tværs af undersøgelser af eksponeringsforhold og deres korrelation til relevante bioeffekter.

Figur 4 viser eksempler på pcd-svar for tids- og frekvensdomæne, hvilket illustrerer tre forskellige kavitationsadfærd. Alle data blev indsamlet på SAT3 ved hjælp af SonoVue MBs fortyndet 5x i PBS, med en endelig koncentration på ~ 2 * 107 MB / ml. Temperaturen for alle eksempler i dette afsnit var 19 ± 1 °C. Den amerikanske kilde blev drevet med en 2,0 ms puls ved 0,5 MHz for at opnå et faldstop negativt tryk på 0,20 (Figur 4A og 4B), 0,30 (Figur 4C og 4D) og 0,70 MPa (Figur 4E og 4F). Signaloptagelserne begyndte 1,4 ms før t = 0 starten af den amerikanske puls. De indsat spor viser signalet som registreret (rød) og med en 2 MHz høj pass filter (blå) for et tidsvindue centreret på tidspunktet for flyvningen fra kilde til celle eksponering rum til PCD. Den lave respons før dette tidspunkt skyldes direkte modtaget stråling fra kilden, hvilket er almindeligt i konfigurationer, hvor PCD'et er bag den amerikanske kilde.
Ved det laveste hændelsestryk består PCD-responsen udelukkende af heltalsharmoniker af 0,5 MHz grundlæggende amerikanske frekvens. Stigende fra 0,20 til 0,30 MPa resulterer i udtalt ultraharmonics i spektret ud over yderligere forhøjet heltal harmoniske. Den tid domæne bølgeformer på disse to tryk ser ens ud, selv om 0,30 MPa resultater viser mere variation over pulsen varighed. Ved det højeste tryk er tidsdomænets bølgeforme amplitude vokset ulineært i forhold til det lavere tryk som følge af klart forhøjet bredbåndsstøj, der er synlig i spektret. Denne støj anses almindeligvis for at være et resultat af inertiel kavitation og svarer i dette eksempel til ødelæggelse af MB' er.
Hvis du vil se dette tydeligere, vises PCD-svar som en funktion af tiden i figur 5. I venstre panel (Figur 5A) vises fuld spektre over en 50 sekunders eksponeringstid, hvor kilden udsendte 2,0 ms pulser hvert 0,20 sekund. Tilsvarende samlede, harmoniske og bredbåndskræfter vises i højre panel (Figur 5B). USA blev tændt på t = 3 ,0 s, på hvilket tidspunkt store amplitude bredbånd svar blev set. Den oprindelige spike menes at svare til ødelæggelsen af de største bobler i suspensionen (SonoVue er polydisperse) og er en almindelig observation i kavitationseksperimenter med afskallede bobler og endda med ikke-afgassede medier (f.eks PBS).
Efter et par sekunder faldt bredbåndsresponsen hurtigt, tilsyneladende på grund af bobledestruktion, og signalet består overvejende af harmoniske. Dette tyder på, at den frigjorte gas og de resterende MB vibrerer stabilt og ikke-inertially. Ved 50'erne er bredbåndskomponenten faldet til niveauet for den oprindelige baggrundsstøj. Eksponeringstest som denne er derfor vigtige, når man forsøger at forstå de tidsskalaer, hvor forskellige bobleeffekter kan virke på cellerne i kammeret.
Bobler vil sandsynligvis oversætte som reaktion på strålingskræfter genereret under amerikansk eksponering og bevægelse af MB ind og ud af PCD synsfeltet kan føre til øget variation i det overvågede kavitationssignal, især når der beskæftiger sig med fortyndede suspensioner. Pcd'ens følsomme område bør derfor strække sig over så meget af celleeksponeringsoverfladen som muligt. En sammenligning af de fokuserede og ufokuserede pct. med identiske centerfrekvenser (se figur 2) er vist i figur 6, hvor der foretages en 20:1-fortynding af MB i normal PBS SAT2. Tids- og stikprøvegennemsnittet i panelet Figur 6A viser, at det ufokuserede PCD indeholder en stærkere bredbåndsrespons ledsaget af reduceret variation fra stikprøve til stikprøve i både harmoniske (figur 6B) og ultraharmoniske kræfter (figur 6C).
Det er vigtigt at erkende, at medier, der anvendes til in vitro-cellearbejde, ikke afgasses og kan udgøre et forbedret baggrundsniveau for bobleaktivitet. Figur 7 viser reaktionen i SAT2 på PBS, der anvendes i leverandørformen, og efter to timers afgasning under vakuum, hvorefter luftmætningen blev reduceret fra 92 % til 46 % som bestemt med en optisk sensor (PreSens, Tyskland). Spektre i figur 7A blev i gennemsnit over eksponeringstid og gentagelser med fem uafhængige prøver, og viser tydeligt tydeligt forhøjede ultraharmonikere i normal PBS. Beføjelser, der lægges sammen over tre harmoniske(figur 7B),ligger et godt stykke inden for standardafvigelsen for hver forsøgsproduktion. I modsætning hertil viser de ultraharmoniske beløb i figur 7C, at normal PBS har næsten en størrelsesorden højere niveau og væsentligt højere variation mellem prøverne. Disse eksempler angiver, at et almindeligt cellekompatibelt medie kan udvise funktionsmåder, der (fejlagtigt) kan tilskrives tilstedeværelsen af MB'er. Da det normalt er upraktisk at degaskulturmediet på grund af den negative indvirkning på celler og/eller kavitationsstabilitet, er det afgørende at udføre passende kontroller i enhver kavitationsrelateret undersøgelse.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg"> Figur 1: Illustrationer af to amerikanske eksponeringssystemdesign, der omfatter kavitationsovervågning: SAT3 (D-F). (A) SAT2 kommenteret samling med sidevæg fjernet for klarhed. (B)SAT2 med sidevæg intakt. (C) SAT2 celleeksponeringsrum, adskilt. (D) SAT3 kommenteret samling. (E) SAT3 i normale (venstre) og linsede (højre) konfigurationer for strålebredde, der matcher ved forskellige frekvenser. (F) SAT3 celleeksponeringsrum, adskilt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg"> Figur 2: Beregninger af halv amplitudetryksfeltkonturer for 12,7 mm diameter ufokuseret (venstre) og sfærisk fokuserede (højre) transducere. Frekvenser på henholdsvis 2, 4 og 8 MHz vises som henholdsvis røde, blå og grønne konturer for et PCD-element ved koordinatens oprindelse (0,0). Den ufokuserede enheds yderste konturer er relativt ufølsomme over for frekvens, men den indvendige struktur er frekvensafhængig. De sfærisk fokuserede feltkontrakter, efterhånden som frekvensen øges, men inde i konturerne varierer felterne jævnt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg"> Figur 3: Instrumentering til kavitationssignalkonditionering og -registrering (blå pile), amerikansk kildeledning (røde linjer) og udløsning af dataindsamling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg"> Figur 4: Tid (venstre) og frekvens (højre) domæne PCD svar registreret med MB fortyndet 5x i PBS. Hændelse peak negative tryk var (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, alle på 0,5 MHz. Signal optagelser begynder 1,4 ms før t = 0 starten af 2,0 ms varighed ultralyd puls. (A, C, E) Tidsdomænesignaler (rød) vises på en fast lodret skala, der angiver, hvordan responsniveauet ændrer sig med hændelsestryk. De indsat spor viser signalet som registreret (rød) og med en 2 MHz høj pass filter (blå) for et tidsvindue centreret på tidspunktet for flyvningen fra kilde til celle eksponering rum til PCD. (B, D, F) Støj- og signaleffektspektrale tætheder beregnes for henholdsvis t<0 og t>0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg"> Figur 5: Frekvenshistorik over 50 sekunders eksponering af en suspension af MB fortyndet 5x i PBS. (A) Fuld spektre og (B) samlede, harmoniske og bredbåndssignal beføjelser, alle som en funktion af tid. Drev betingelser var 0,5 MHz, 0,7 MPa peak undertryk, 2,0 ms puls varighed, 200 ms puls gentagelse periode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg"> Figur 6: Effekt af PCD-fokuseringsgeometri registreret med en 20:1-fortynding af mikrobobler i normal PBS. Kørselsforhold var: 1,0 MHz, 0,50 MPa peak undertryk, 3,0 ms puls varighed, 10 ms puls gentagelse periode. (A) Fuld spektre gennemsnit over eksponeringstid og tre uafhængige prøve gentager. (B) Effekt i 3, 4 og 5 MHz harmoniske, og (C) magt i 2,5, 3,5 og 4,5 MHz ultraharmonics. Tykke linjer er prøvemidler, skyggeområder angiver +/- 1 standardafvigelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg"> Figur 7: Effekt af afgassede medier optaget med PBS. (a)Fuld spektre gennemsnit over eksponeringstid og fem uafhængige prøve gentagelser. (B) Effekt i 3, 4 og 5 MHz harmoniske, og (C) magt i 2,5, 3,5 og 4,5 MHz ultraharmonics. Tykke linjer er prøvemidler, skyggeområder angiver +/- 1 standardafvigelse. Drev betingelser var 1,0 MHz, 0,50 MPa peak undertryk, 1,0 ms puls varighed, 200 ms puls gentagelse periode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>parameter</td>
			<td>enhed</td>
			<td>minimum</td>
			<td>maksimal</td>
		</tr>
<tr>
<td>frekvens</td>
			<td>Mhz</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>tryk (peak negativ)</td>
			<td>Mpa</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>pulslængde</td>
			<td>Cykler</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>Maksimalydelse</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>eksponeringstid</td>
			<td>s</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Resumé af rækken af rapporterede parametre, der letter sonoporation in vitro.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Cavitation Enhanced Therapy at JoVE.com

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Den præsenterede eksperimentelle protokol kan bruges til at udføre realtidsmålinger af kavitationsaktivitet i en cellekulturenhed med det formål at muliggøre undersøgelse af de betingelser, der kræves for vellykket lægemiddellevering og / eller andre biovirkninger.

Undersøgelse Cavitation Forbedret Terapi

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Disse bench-top system design, dataindsamling og analyse principper kan bruges som et rationelt grundlag for in-vitro undersøgelse af kavitation forbedrede behandlinger. Vores teknikker muliggør test af høj overførselshastighed, samtidig med at de kritiske eksperimentelle egenskaber ved overvågning af intervalkavitation, gentagelig prøvejustering og kompatibilitet med almindelige cellulære analysemetoder bevares. Cavitation forbedret terapi har flere potentielle anvendelser, herunder behandling af sygdomme som kræft og slagtilfælde.Ved bedre at forstå de understøttende mekanismer kan vi udvikle bedre behandlingsformer. Dette arbejde giver en let reproducerbar system design og implementering rammer for at muliggøre forskning i en bred vifte af kavitation induceret cellulære bio effekter. Herunder medicin levering, sonoporation og sonoprinting.At få meningsfulde resultater kræver at sikre reproducerbarhed og kontrol for alle variabler i eksperimentet. Det er bydende nødvendigt at udføre alle relevante kontroller og måle den elektriske støj. Til fremstilling af systemer til akustisk transfekt afgases påfyldningsvæsken under et tryk på 100kPa i mindst to timer for at minimere sandsynligheden for kavitation i formeringsstien.Bekræftelse med en opløst iltsonde af, at det delvise ilttryk er under 10kPa, anbefales. Testkammeret fyldes langsomt for at minimere genintroduktionen af luft i den afgassede væske og straks fjerne eventuelle resterende bobler fra transduceren og de mellemstore beholderoverflader. Lad ultralydskildens effektforstærker varme op i henhold til producentens anbefaling, så forstærkningen og outputtet er stabilt med hensyn til tid.Og fortynd kavitationsmidlet under forsigtigt og kontinuerlig omrøring for at lave en ensartet suspension uden at fange makrobobler eller ødelægge midlet. Når du arbejder med mikrobobler, skal du sørge for at håndtere dem omhyggeligt. Til SAT2-forberedelse skal du bruge ethanol til at sterilisere PDMs-låget, før du begynder på eksperimentet.Tryk det steriliserede låg på kulturretten for at danne cellerummet og læg en 10 milliliter sprøjte udstyret med en 18 gauge stump nål med 10 milliliter af fyldvæsken. Sæt nålen gennem en af PPM'erne, fyld hullerne, og fyld langsomt kammeret, mens du vipper, så makrobobler kan slippe gennem det åbne fyldhul. Når kammeret er fyldt, skal du indsætte en fire til fem millimeter polymerstang i det åbne hul og placere samlingen, så hullerne er vandrette.Fjern nålen, mens du injicerer ekstra væske, så der ikke trækkes luft ind i kammeret, og luk fyldhullet med en anden polymerstang. Kontroller rummet visuelt for at se, om der er tegn på indspændte makrobobler, og tryk på celleeksponeringsrummet ind i rumholderen. Overvej opdriften af partiklerne i suspension, og hvordan deres opdrift vil påvirke deres kontakt med cellerne, når de beslutter retningen af celleeksponeringsrummet.Sænk derefter kammerlåget i en vandret vinkel for at afskrække makrobobler fra at hvile på enhedens nedsænkede dele, installer låget på toppen af kammeret. Før du udfører de eksperimentelle målinger, skal suspensionen være termisk lige udlignelig med kammertemperaturen. Brug af en fin nål termoelement til at bekræfte, at temperaturen i kammeret har stabiliseret sig.For at overvåge eksperimenterne i realtid, i både tids- og frekvensdomæner, skal du starte dataindsamlingsprocessen og tænde ultralydskildedrevsignalet. Brug en højspændingssonde til at overvåge forstærkerudgangssignalet, der driver ultralydskilden under hele eksperimentet for at sikre, at eksponeringen fortsætter som forventet. Og sørg for, at oscilloskopet er indstillet til at kompensere for sondens attenuation.Overvågning af tidsdomæne af den passive kavitationsdetektor afslører, om signalerne er dimensioneret korrekt til de aktuelle instrumenteringsindstillinger, og om kavitationssignalerne ses tidligere end forventet. Frekvensdomæneovervågning gør det muligt at analysere typen af bobleadfærd og kan bruges til at justere drevniveauer efter behov for at opnå den ønskede cellestimulering. I denne analyse bestod den passive kavitationsdetektorrespons ved det laveste hændelsestryk udelukkende af heltalsharmonier af 0,5 MHz grundlæggende ultralydsfrekvens.Stigende fra 0,2 til 0,3MPa resulterede i udtalt ultra harmoniske i spektret ud over en yderligere forhøjet heltal harmoniske. Den tid domæne bølge former på disse to tryk så ens, selv om 0.3MPa resultater vist mere variation over pulsen varighed. Ved det højeste tryk voksede tidsdomænebølgeformen amplitude ikke-lineært i forhold til det lavere tryk som følge af klart forhøjet bredbåndsstøj, sandsynligvis på grund af inertial kavitation forårsaget af mikrobobledestruktion.Her vises fuld spektre over en 50 sekunders eksponeringstid, hvor kilden udsendte to millisekundimpulser hvert 0,2 sekund. Som det fremgår af denne graf, der illustrerer de tilsvarende samlede harmoniske og bredbåndskræfter, blev der genereret store amplitudebredbåndsresponser med den oprindelige stigning, der blev anset for at korrelere med ødelæggelsen af de største bobler. Efter et par sekunder, hurtigt bredbånd svar mindskes, tilsyneladende på grund af boble ødelæggelse.I denne analyse ved hjælp af en 20 til 1 fortynding af mikrobobler og normal PBS viste tids- og prøvegennemspektre, at den ufokuserede passive kavitationsdetektor indeholdt en stærkere bredbåndsrespons end fokusdetektoren. Ledsaget af en reduceret prøve for at prøvevariation i både harmoniske og ultraharmoniske kræfter. Kavitationsinducerede bioeffekter kan vurderes ved hjælp af teknikker som fluorescensmikroskopi, flowcytometry eller biologiske assays.Dette gør det muligt at etablere et robust forhold mellem kavitationsaktivitet og de biologiske virkninger. Denne teknik har gjort det muligt for os bedre at identificere forholdet mellem boble adfærd og biologiske virkninger, som har afsløret nogle potentielle nye mekanismer, der understøtter kavitation medieret stof levering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Mikrofluidenheder Blandere til at studere proteinfoldning

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

En mikrofluid enhed for at studere flere forskellige stammer

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Diagnosis of Neoplasia in Barrett&#8217;s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Diagnosis of Neoplasia in BarrettÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Diagnose for neoplasi i Barretts øsofagus hjælp Vital-dye Forbedret fluorescensimagografi

The ability to differentiate benign metaplasia in Barrett&#8217;s Esophagus (BE) from neoplasia in vivo remains difficult as both tissue types can be flat ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Syntese af Gold Nanopartikel Integrated Foto-responsive Liposomer og måling af deres Mikroboble Kavitation på Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Robotic Mirror Therapy System for Funktionel Inddrivelse af hemiplegisk Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

En mikrofluidsystem med Surface mønster for Undersøgelse Kavitation Bubble (r)-Cell Interaktion og de resulterende bioeffekter på Single-celle niveau

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...