Name: studying cavitation enhanced therapy
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Cavitation Enhanced Therapy at JoVE.com

De auteurs danken de Onderzoeksraad voor Ingenieurswetenschappen en Exacte Wetenschappen voor hun steun aan dit werk door middel van subsidie EP/L024012/1. VB wordt ook ondersteund door de Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) en Medical Research Council (MRC) (subsidie EP/L016052/1). VB en AV bedanken de Clarendon Foundation voor Post Graduate Scholarships. AV bedankt ook Exeter College voor een Santander-beurs. De auteurs zijn James Fisk en David Salisbury te schuld voor hun onschatbare hulp bij de productie van het apparaat. Ze erkennen ook dankbaar de bijdragen van Drs. Dario Carugo en Joshua Owen in de ontwikkeling van eerdere prototype SATs.

De auteurs hebben niets bekend te maken.

De kritische stappen voor elke akoestische meting werden in 1981 door Apfel ingekapseld als "ken uw vloeistof, ken uw geluidsveld, weet wanneer er iets gebeurt." In de context van dit protocol omvatten deze de kalibratie en uitlijning van de transducer en de watervoorbereidings- en bellenbehandelingsstappen. Ten eerste is het essentieel dat de hydrofoon die wordt gebruikt om de aandrijfomvormer en/of de PCD te kalibreren, zelf nauwkeurig wordt gekalibreerd door middel van regelmatig extern onderhoud of interne vergelijking met een referentiestandaard. Evenzo moet de respons van zowel de aandrijvende transducer als PCD regelmatig worden gekarakteriseerd om te controleren op een verandering in de output en/of verlies van gevoeligheid. Als de rijomstandigheden en de gevoeligheid van het systeem onbekend zijn, is het onmogelijk om een betekenisvol verband te concluderen tussen blootstellingsomstandigheden, bio-effecten en akoestische emissies. De uitlijning van de transducers op elkaar en de monsterkamer moet zorgvuldig worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de blootstellingsomstandigheden in de kamer naar verwachting zijn en dat het bemonsteringsvolume voor de PCD overeenkomt met het interessegebied. Zoals aangegeven , kunnen de temperatuur en het gasgehalte van het opschortende medium de uiteindelijke resultaten aanzienlijk beïnvloeden en is consistentie in dit opzicht uiterst belangrijk77,78. Evenzo vereisen de bereiding, karakterisering en behandeling van de suspensie van het cavitatiemiddel zeer nauwe aandacht om ervoor te zorgen dat de verwachte grootteverdeling en concentratie van deeltjes in het monster aanwezig is. Als de concentratie van bellen bijvoorbeeld te hoog is, zal het monstervolume effectief worden afgeschermd van het amerikaanse veld. MB-middelen zijn bijzonder gevoelig voor vernietiging en coalescentie en verdere richtlijnen voor de behandeling ervan zijn te vinden in Mulvana et. al. (2012)79.
Een veel voorkomend probleem bij het detecteren van cavitatiesignalen is het bereiken van een adequate SNR. Dit komt deels door de aard van het signaal zelf, zoals beschreven, maar kan ook te wijten zijn aan bronnen van elektrische ruis binnen de experimentele opstelling. Het controleren van de verbindingen tussen systeemcomponenten, met name die met coaxiale kabels, kan helpen om sommige van deze te elimineren. Het vervangen of repareren van coaxiale kabels kan nodig zijn. Het identificeren en verwijderen of deactiveren van andere apparatuur in het laboratorium, zoals pompen die elektrisch geluid kunnen veroorzaken, kan ook helpen. Een slechte afstemming van elektrische impedantie tussen systeemcomponenten kan een verdere oorzaak zijn van een slechte signaal-ruisverhouding en mogelijk ook van schade aan apparatuur en moet zorgvuldig worden gecontroleerd. De activeringsinstellingen op de signaalgenerator en oscilloscoop moeten op dezelfde manier worden gecontroleerd om te bevestigen dat ze op de juiste manier zijn geconfigureerd voor het experiment en niet zijn teruggekeerd naar de standaardinstellingen van de fabrikant. Als er tijdens het hanteren een aanzienlijke vernietiging van bellen is, kan het in het geval van de SAT2 nuttig zijn om een tweede spuit aan de uitlaatpoort te bevestigen en deze te gebruiken om voorzichtig vloeistof uit de kamer te extraheren, waardoor de suspensie wordt intrek. Dit kan ook helpen bij het elimineren van macrobubbels of het inschakelen van stroom tijdens amerikaanse blootstelling, indien gewenst.
Het is niet mogelijk om akoestische reflecties in de monsterkamer volledig te elimineren en daarom zal het incidentveld niet volledig uniform zijn over het hele monstervolume. Zoals vermeld in de stappen 1.3.2 en 1.3.3, zal de overdraagbaarheid van akoestische ramen frequentieafhankelijk zijn en daarom moet zorgvuldig worden nagedacht over de gewenste bandbreedte voor akoestische emissiemetingen. In het bijzonder kunnen er significante meervoudige reflecties van componenten met een hogere frequentie zijn. Dit is een andere reden waarom kalibratie van het veld binnen het volledig geassembleerde systeem zo belangrijk is om de onzekerheid in incidentdruk te minimaliseren. Er moet ook worden overwogen de effecten van meervoudige reflecties tot een minimum te beperken. Het gebruik van commerciële apparaten voor het gemak en de noodzaak van akoestische transparantie betekent dat enige optische transparantie moet worden opgeofferd. Dit kan van invloed zijn op de kwaliteit van latere beeldvorming, bijvoorbeeld om de levensvatbaarheid van cellen of de opname van geneesmiddelen te beoordelen. Sommige membranen die in commerciële apparaten worden gebruikt, zijn ook poreus en daarom treedt onvolmaakte isolatie op tussen de monsterkamer en het omringende waterbad. Zoals hierboven vermeld, kan het overeenkomstige besmettingsrisico worden beperkt door een kleinere subkamer te gebruiken, waarvan de inhoud regelmatig kan worden vervangen. De celkweekapparaten die in de tabel met materialen worden aangegeven, zijn voornamelijk geschikt voor celmonolagen die mogelijk niet representatief zijn voor weefsels in termen van alle door de VS/cavitatie gemedieerde bio-effecten. De nabijheid van de cellen tot een vast oppervlak zal ook de MB-dynamiek beïnvloeden op een manier die mogelijk niet de omstandigheden in vivo weerspiegelt, bijvoorbeeld het bevorderen van microstreaming en microjetting zoals beschreven in de inleiding. Deze beperkingen kunnen echter worden aangepakt door een eenvoudige vervanging van alternatieve weefselmodellen.
Het doel van de voorstellen van de SATs is een middel te bieden om de reproduceerbaarheid van akoestische blootstellingsomstandigheden en akoestische emissies tussen studies van door de VS gemedieerde bio-effecten te verbeteren, waardoor hopelijk een beter begrip van de onderliggende mechanismen en de ontwikkeling van behandelingsbewakingstechnieken worden vergemakkelijkt om de veiligheid en werkzaamheid te verbeteren. De systemen zijn ontworpen om compatibel te zijn met in de handel verkrijgbare celkweekapparaten, waardoor een breed scala aan biologische test kan worden uitgevoerd op basis van de toepassing van interesse en de uitvoering van experimenten met hoge doorvoer mogelijk wordt, waardoor tijdrovende uitlijningsprocedures tussen runs overbodig worden. Door protocollen te standaardiseren voor de karakterisering van blootstellingsomstandigheden en het opvangen van akoestische emissies, kan de systeemafhankelijke variabiliteit hopelijk worden verminderd. Het bereik van parameters die voor een bepaald experiment moeten worden onderzocht, hangt af van de toepassing (gewenst bio-effect, celtype, diepte van het doelweefsel indien in vivo enz.) en de aard van elk cavitatiemiddel dat wordt gebruikt. Gezien het grote aantal variabelen (Amerikaanse frequentie, drukamplitude, pulslengte, pulsherhalingsfrequentie enz.) is het onwaarschijnlijk dat het volledig verkennen van de hele parameterruimte haalbaar is. Een voordeel van het voorgestelde protocol is dat het mogelijk is om bepaalde grenzen op deze parameterruimte snel vast te stellen. Het maakt het bijvoorbeeld mogelijk om de minimale druk te bepalen waarbij een cavitatiesignaal wordt gegenereerd, de maximale druk of pulslengte die kan worden gebruikt voordat celloslating / dood optreedt, en de druk waarbij fractionele harmonischen of breedbandgeluid worden geproduceerd. Het wordt aanbevolen om een dergelijke reeks scopingmetingen uit te voeren als een eerste stap in elk onderzoek.
Zoals gepresenteerd, zijn de SATs ontworpen voor real-time monitoring van akoestische emissies, waarbij biologische assays buiten het experiment worden uitgevoerd. Het zou echter relatief eenvoudig zijn om de SAT aan te passen om directe optische observatie van de monsterkamer via een microscoopdoelstelling mogelijk te maken. Dit kan op zijn beurt worden gekoppeld aan een fluorescentie- en/of high-speed microscopiesysteem om bijvoorbeeld observatie van de opname van geneesmiddelen en de dynamiek van de bellen mogelijk te maken. De PCD-uitgang zoals momenteel gepresenteerd in termen van spanning geeft aan: i) de soorten cavitatiegedrag en hun relatieve verhoudingen; ii) hoe lang deze cavitatiegedragingen aanhouden; iii) of de waargenomen tijd-cumulatieve blootstellingskenmerken gecorreleerd zijn met een bepaald bio-effect; en iv) of de relatieve niveaus en tijdsafhankelijke gedragingen consistent zijn met eerdere experimenten in het blootstellingssysteem. Hoewel de ontvangstgevoeligheid van de PCD kan worden gekwantificeerd, is aanvullende ruimtelijke informatie vereist om de akoestische emissies betrouwbaar te karakteriseren in termen van absolute energie. Dit kan worden bereikt door de PCD te vervangen door een arraysonde om passieve akoestische mapping (PAM) te implementeren80. Dit zou echter de complexiteit van signaalverwerking en de benodigde rekentijd en -kracht vergroten.
Andere instrumenten voor het meten van de elektrische weerstand van het membraan of de toepassing van fysische richtmethoden, bijvoorbeeld magnetische velden, kunnen ook worden opgenomen. Het zou ook mogelijk zijn om driedimensionale weefselstructuren zoals tumorsferoïden, organoïden of zelfs ex vivo weefselmonsters te gebruiken op akoestisch "zachte" gelsubstraten in plaats van de celmonolagen om amerikaanse en cavitatiegemedieerde effecten in meer realistische weefselomgevingen te bestuderen.

Echografie (VS) is op grote schaal gebruikt als een diagnostische beeldvormingstechniek vanwege het veilige en niet-invasieve karakter, het gemak van implementatie aan het bed van een patiënt en de kosteneffectiviteit1. Naast zijn diagnostische en monitoringmogelijkheden heeft de VS een aanzienlijk potentieel voor therapeutische toepassingen. Vroeg werk onderzocht het gebruik ervan in trombolyse, DNA-transfectie en medicijnafgifte2,3,4 en therapeutische VS vertegenwoordigt nu een zeer actief onderzoeksgebied, met toepassingen zoals tumorbehandeling5,6,7,immunotherapie8,9, verstoring van de bloed- hersenbarrière (BBB)10,11,12,trombolyse13,14,15en behandeling van bacteriële infecties16,17. Een belangrijk fenomeen dat aan deze toepassingen ten grondslag ligt, is cavitatie: de nucleatie, groei en oscillatie van gasvormige holtes als gevolg van veranderingen in vloeistofdruk18,19.
Er is een reeks mechanismen waarmee cavitatie biologische effecten veroorzaakt. Bijvoorbeeld, de hoogst niet-lineaire aard van bellenschommelingen onder invloed van een toegepast Amerikaans veld kan microstreaming in de omringende vloeistof genereren die zowel medicijnconvectie20 kan verbeteren als schuifspanningen kan uitoefenen op het weefsel in de buurt van de bubbels. Dit komt met name voor wanneer bellen zich in de buurt van een grens bevinden, waardoor bellen niet-bolvormig oscilleren , en mogelijk de opname van geneesmiddelen bevorderen door door afschuiving geïnduceerde permeabilisatie21,22,23,24. Bij hogere drukken worden grotere amplitudeschommelingen en snelle instorting van de bellen waargenomen, waardoor directe mechanische stress25 wordt veroorzaakt en vaak schokgolven worden gegenereerd, en als gevolg daarvan grote drukgradiënten die weefsels kunnen verstoren en permeabiliseren26,27. Het instorten van bellen in de buurt van een oppervlak kan ook leiden tot de vorming van vloeistofmicrojets met hoge snelheid28,29,30. Deze microjets kunnen weefsel binnendringen, mogelijk poriën creëren of secundaire stressgolven veroorzaken31,32. De permeabilisatie van biologische membranen op zowel weefsel- als cellulaire niveaus wordt verschillende worden sonoforese genoemd, voornamelijk gebruikt in de context van door de VS geïnduceerde verbetering van de huidpermeabiliteit33,34en sonoporatie, voornamelijk gebruikt om de reversibele permeabilisatie van het cellulaire membraan als gevolg van de vorming van membraanporiën35,36te beschrijven .
Viskeuze absorptie in de vloeistof direct rond de oscillerende bel kan een aanzienlijk verwarmingseffect veroorzaken37. Bovendien produceren de zeer niet-lineaire oscillaties akoestische straling bij frequenties die hoger zijn dan het rijdende Amerikaanse veld. Dit leidt tot een verhoogde absorptie in het omliggende weefsel en verdere verwarming38. Bubble collapse kan ook gepaard gaan met chemische effecten als gevolg van de voorbijgaande hoge temperaturen en druk in de bubbelkern, zoals het genereren van zeer reactieve soorten en elektromagnetische straling, bekend als sonoluminescentie32. Deze effecten zijn onderzocht om mogelijke schade en/of activering van relevante cellulaire trajecten voor levering39 te beoordelen en worden benut bij lokale activering van lichtgevoelige geneesmiddelen in een benadering die bekend staat als sonodynamische therapie40,41,42,43.
Veel door de VS gemedieerde bio-effecten kunnen uitsluitend worden geïnitieerd door controle van amerikaanse veldparameters (drukamplitude, frequentie, pulslengte en herhalingsfrequentie en duur van blootstelling), maar het betrouwbaar genereren van cavitatie in biologisch weefsel vereist vaak hoge inputenergieën en draagt daarom een verhoogd risico op schade met zich mee. De introductie van exogene of kunstmatige cavitatiekernen kan de inputenergie die nodig is om het brede scala aan effecten te produceren die hierboven zijn besproken, aanzienlijk verminderen en introduceert verder extra effecten die mogelijk niet mogelijk zijn met alleen de VS. Cavitatiekernen omvatten gasbellen26,44, vloeibare druppels45,46,47 en vaste deeltjes48,49,50, waarbij nanoschaal cavitatiekernen een emergent onderzoeksgebied zijn voor hun voordelen in termen van verlengde circulatietijd, verbeterde extravasatie en langdurige cavitatieactiviteit49,51,52,53.
De meest gebruikte kernen zijn gasmicrobubbles (MB's), oorspronkelijk gebruikt als contrastmiddelen in diagnostische beeldvorming. Ze hebben een diameter van meestal 1-2 micrometer en bevatten een kern van een gas met een hoog molecuulgewicht met een lage waterige oplosbaarheid in het omringende medium. De kern is omgeven door een beschermende lipide, eiwit of polymeer shell meestal bestaande uit fosfolipiden54. Wanneer ze worden blootgesteld aan een Amerikaans veld, zorgt de samendrukbaarheid van de MB's ervoor dat ze volumetrische oscillaties ondergaan, waardoor sterke akoestische verstrooiing ontstaat, wat verantwoordelijk is voor het succes van MB's als contrastmiddel. Zoals gezegd leiden deze oscillaties ook tot de bovengenoemde mechanische, thermische en chemische effecten die kunnen worden gebruikt in therapeutische toepassingen. Het MB-coatingproces biedt ook een mechanisme voor het inkapselen van geneesmiddelen binnen de MB-structuur en voor het bevestigen van geneesmiddelen en/of targetingsoorten aan het MB-oppervlak. Deze techniek vergemakkelijkt de geactiveerde afgifte van geneesmiddelen om systemische toxiciteit te verminderen55. Onlangs is ook aangetoond dat materiaal van het MB-oppervlak kan worden overgebracht naar biologische structuren, waardoor de afgifte van geneesmiddelen wordt verbeterd door middel van zogenaamde "sonoprinting"56,57,58.
Monitoring van door de VS gemedieerde cavitatieactiviteit kan inzicht geven in de resulterende biologische effecten, zowel in vitro als in vivo, en maakt mogelijk het afstemmen en optimaliseren van deze effecten mogelijk. De twee meest toegepaste methoden voor het monitoren van cavitatieactiviteit zijn i) optisch, die ultrasnelle videomicroscopie gebruiken en over het algemeen niet haalbaar zijn in vivo; en ii) akoestisch, die de opnieuw uitgestraalde geluidsvelden opnemen die worden geproduceerd door oscillerende en / of instortende bubbels. Zowel de amplitude- als frequentiecomponenten van het akoestische signaal bevatten informatie over het gedrag van de bellen. Van lage concentraties bellen bij lage incidentele Amerikaanse amplitudes is aangetoond dat ze overwegend harmonische emissies (gehele veelvouden van de rijfrequentie) produceren59. Naarmate de rijdruk toeneemt, kan het bubbelemissiespectrum ook fractionele componenten bevatten die bekend staan als subharmonica en ultraharmonica60 die wijzen op sterker niet-lineair gedrag, evenals breedbandruis, wat wijst op traagheids cavitatie. Integer harmonischen zijn een primaire indicator van bubble oscillatie, maar kunnen ook worden veroorzaakt door niet-lineariteiten overal in een experimenteel systeem, bijvoorbeeld als gevolg van niet-lineaire propagatie. Fractionele harmonischen en breedbandruis daarentegen zijn zeer sterk gecorreleerd met bellendynamiek.
De relatie tussen bellengedrag en de gedetecteerde akoestische emissies kan gecompliceerd zijn door factoren zoals het amerikaanse veld van het incident, de nucleatieomgeving en de kenmerken van het detectietraject60. Niettemin kan belangrijke informatie over bellengedrag en hun interacties met cellen worden verkregen door trends in frequentie en energie in het akoestische spectrum te onderscheiden. Deze gegevens kunnen ook waardevolle informatie opleveren die kan worden gebruikt om de basis te vormen voor klinische behandelingsbewakingstechnieken. Om deze informatie volledig te benutten, is de ontwikkeling van robuuste, vertaalbare en reproduceerbare experimentele methoden vereist.
Momenteel is er aanzienlijke variatie in gerapporteerde protocollen voor het ontwerpen van systemen en het uitvoeren van studies ter ondersteuning van de ontwikkeling van cavitatie-ondersteunde therapieën. Wat het apparaat betreft, is een reeks ontwerpbenaderingen uitgevoerd. Verschillende groepen hebben gebruik gemaakt van parallelplaatkamers56,61,62,63,op maat gemaakt of in de handel verkrijgbaar (bijv. OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et al. (2013) ontwikkelden een celkamer in combinatie met een Amerikaanse sonicatiemodule en real-time confocale beeldvorming64, Carugo et al. (2015) gebruikten een systeem bestaande uit een commercieel verkrijgbaar celkweekschaaltje met een op maat gemaakt PDMS-deksel om onderdompeling in een waterbad mogelijk te maken tijdens Amerikaanse blootstelling65, en Pereno et al. (2018) gebruikten een apparaat dat bestaat uit gelaagde acoustof. Het gebruik van op maat gemaakte en toepassingsspecifieke ontwerpen bemoeilijkt de karakterisering van het Amerikaanse veld en andere omgevingsblootstellingsomstandigheden, waardoor vergelijkingen tussen studies uitdagend zijn. Er is bijvoorbeeld een aanzienlijke variatie in de Amerikaanse parameters die zijn geïdentificeerd voor het bereiken van succesvolle sonoporatie, waaronder centrumfrequenties variërend van 0,02 tot 15 MHz, bedrijfscycli variërend van 1% tot continue golf en zeldzamefactionele drukken variërend van 0,1 tot 20 MPa23,64,67,68,69,70 ( Tabel1). Er is eveneens een aanzienlijke variatie in de spectrale componenten (harmonischen, subharmonischen enz.) die zijn geïdentificeerd als geassocieerd met bepaalde bio-effecten.
Het doel van dit werk is daarom om een gemakkelijk reproduceerbaar systeemontwerp- en implementatiekader te bieden voor de in vitro studie van cavitatie-geïnduceerde cellulaire bio-effecten met de specifieke opname van een cavitatiebewakingscapaciteit.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorber</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>APTFlex F28 panel</td>
			<td>1.0 cm standard thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (power)</td>
			<td>E&#38;I Ltd.</td>
			<td>1040L</td>
			<td>400W power amplifier to drive ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (pre)</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR445A</td>
			<td>Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium heater</td>
			<td>Aquael</td>
			<td>Ultra 50W</td>
			<td>Different models for different tank sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>TiePie Engineering</td>
			<td>HS5-110-XM</td>
			<td>Extended memory option: 32M points per channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>FOH</td>
			<td>0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>SonoVue</td>
			<td>FDA approved microbubbles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD mirror (SAT3)</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>F-102</td>
			<td>90 degree beam reflection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD transducer</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>V320-SU</td>
			<td>Immersion transducer, 7.5MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD waterproof cable</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>BCU-58-1 W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (SAT2 compartment lid)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer rod (SAT2 seal)</td>
			<td>Zeus</td>
			<td>PTFE monofilament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber plug (SAT3 lid/seal)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-2101</td>
			<td>6mm bottom dia., 8mm top dia., red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>33250</td>
			<td>Waveform generator for ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>&#181;-Dish 35mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT3</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Transwell 6.5mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound source (SAT3)</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>H107 with central hole</td>
			<td>Use of a HIFU-capable source allows pressures &#62;1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying cavitation enhanced therapy

De interesse in de therapeutische toepassingen van echografie is aanzienlijk en groeit, met potentiële klinische doelen variërend van kanker tot de ziekte van Alzheimer. Cavitatie - de vorming en daaropvolgende beweging van bubbels binnen een echografieveld - vertegenwoordigt een belangrijk fenomeen dat ten grondslag ligt aan veel van deze behandelingen. Er blijft echter grote onzekerheid bestaan over de gedetailleerde werkingsmechanismen waarmee cavitatie therapeutische effecten bevordert en er is behoefte aan het ontwikkelen van betrouwbare monitoringtechnieken die klinisch kunnen worden geïmplementeerd. Er is met name een aanzienlijke variatie tussen studies in de blootstellingsparameters die worden gerapporteerd als succesvol leverende therapeutische effecten en de bijbehorende akoestische emissies. Het doel van dit document is om ontwerprichtlijnen en een experimenteel protocol te bieden met behulp van breed beschikbare componenten voor het uitvoeren van studies naar cavitatiegemedieerde bio-effecten, en om real-time akoestische monitoring op te nemen. Het is te hopen dat het protocol een meer wijdverbreide integratie van akoestische monitoring in therapeutische ultrasone experimenten mogelijk zal maken en een gemakkelijkere vergelijking tussen studies over blootstellingsomstandigheden en hun correlatie met relevante bio-effecten zal vergemakkelijken.

Figuur 4 toont voorbeelden van pcd-reacties op tijd- en frequentiedomeinen, die drie verschillende cavitatiegedragingen illustreren. Alle gegevens werden verzameld op SAT3 met behulp van SonoVue MB's verdund 5x in PBS, met een uiteindelijke concentratie van ~2*107 MB/ml. De temperatuur voor alle voorbeelden in deze sectie was 19 ± 1 °C. De Amerikaanse bron werd aangedreven met een puls van 2,0 ms bij 0,5 MHz om incidentpieknegatieve drukken van 0,20 (figuur 4A en 4B), 0,30(figuur 4C en 4D)en 0,70 MPa(figuur 4E en 4F) te bereiken. De signaalopnamen begonnen 1,4 ms vóór de t = 0 start van de Amerikaanse puls. De ingezette sporen tonen het signaal zoals opgenomen (rood) en met een 2 MHz high pass filter (blauw) voor een tijdvenster gecentreerd op het moment van vlucht van bron naar celblootstellingscompartiment naar PCD. De lage respons vóór deze tijd is te wijten aan direct ontvangen straling van de bron, wat gebruikelijk is in configuraties waar de PCD zich achter de Amerikaanse bron bevindt.
Bij de laagste incidentdruk bestaat de PCD-respons volledig uit gehele harmonischen van de 0,5 MHz fundamentele Amerikaanse frequentie. Het verhogen van 0,20 naar 0,30 MPa resulteert in uitgesproken ultraharmonica in het spectrum naast verdere verhoogde gehele harmonischen. De tijddomeingolfvormen bij deze twee drukken lijken op elkaar, hoewel de 0,30 MPa-resultaten meer variabiliteit vertonen over de pulsduur. Bij de hoogste druk is de amplitude van de tijddomeingolfvorm niet lineair gegroeid ten opzichte van de lagere druk als gevolg van duidelijk verhoogde breedbandruis die zichtbaar is in het spectrum. Dit geluid wordt algemeen beschouwd als een gevolg van traagheidsholte en komt in dit voorbeeld overeen met vernietiging van MB's.
Om dit duidelijker te zien, worden pcd-reacties als functie van de tijd weergegeven in figuur 5. In het linkerpaneel (figuur 5A) worden volledige spectra weergegeven gedurende een belichtingstijd van 50 seconden, waarbij de bron elke 0,20 seconden 2,0 ms pulsen uitstraalt. Overeenkomstige totale, harmonische en breedbandvermogens worden in het rechterpaneel weergegeven (figuur 5B). De VS werd ingeschakeld op t = 3 ,0 s, op welk moment breedbandresponsen met grote amplitude werden gezien. De initiële piek wordt verondersteld overeen te komen met de vernietiging van de grootste bubbels in de suspensie (SonoVue is polydisperse) en is een veel voorkomende observatie in cavitatie-experimenten met gedopte bubbels en zelfs met niet-ontgaste media (bijv. PBS).
Na een paar seconden nam de breedbandrespons snel af, blijkbaar als gevolg van bubbelvernietiging, en het signaal bestaat voornamelijk uit harmonischen. Dit suggereert dat het vrijgevelijk gas en de resterende MB's stabiel en niet-traag trillen. Bij t ~ 50s is de breedbandcomponent gedaald tot het niveau van het oorspronkelijke achtergrondgeluid. Blootstellingstests zoals deze zijn daarom belangrijk bij het proberen te begrijpen van de tijdschalen waarin verschillende bubbeleffecten op de cellen in de kamer kunnen werken.
Bellen zullen zich waarschijnlijk vertalen als reactie op stralingskrachten die worden gegenereerd tijdens blootstelling in de VS en beweging van MB's in en uit het PCD-gezichtsveld kan leiden tot verhoogde variabiliteit in het bewaakte cavitatiesignaal, vooral bij het omgaan met verdunde suspensussingen. Het gevoelige gebied van de PCD moet daarom zoveel mogelijk van het celblootstellingsoppervlak omvatten. Een vergelijking van de responsgerichte en niet-gerichte PCD's met identieke centrumfrequenties (zie figuur 2) wordt weergegeven in figuur 6, met behulp van een 20:1 verdunning van MB's in normale PBS is SAT2. Uit de tijd en de steekproefgemiddelde spectra in paneel figuur 6A blijkt dat de niet-gerichte PCD een sterkere breedbandrespons bevat, vergezeld van verminderde sample-to-sample variabiliteit in zowel harmonische (Figuur 6B) als ultraharmonische vermogens (Figuur 6C).
Het is belangrijk om te erkennen dat media die worden gebruikt voor in vitro celwerk niet worden ontgast en een verhoogd achtergrondniveau van bubbelactiviteit kunnen vertonen. Figuur 7 toont de respons in SAT2 van PBS die in de door de leverancier geleverde vorm werd gebruikt en na twee uur ontgassen onder vacuüm, waarna de luchtverzadiging werd verlaagd van 92% naar 46% zoals bepaald met een optische sensor (PreSens, Duitsland). De spectra in figuur 7A werden gemiddeld over de blootstellingstijd en herhaald met vijf onafhankelijke monsters, en laten duidelijk verhoogde ultraharmonica zien in normale PBS. Krachten opgeteld over drie harmonischen (figuur 7B) liggen ruim binnen de standaardafwijking van elke experimentele output. De ultraharmonische sommen in figuur 7C laten daarentegen zien dat normale PBS bijna een orde van grootte hoger niveau en aanzienlijk hogere variabiliteit tussen monsters heeft. Deze voorbeelden geven aan dat een gemeenschappelijk celcompatibel medium gedrag kan vertonen dat (onjuist) kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van MB's. Aangezien het meestal onpraktisch is om het kweekmedium te ontgassen vanwege de negatieve impact op de stabiliteit van cellen en/of cavitatiemiddelen, is het van cruciaal belang om geschikte controles uit te voeren in een cavitatiegerelateerd onderzoek.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg"> Figuur 1: Illustraties van twee Amerikaanse belichtingssysteemontwerpen met cavitatiebewaking: SAT3 (D-F). (A) SAT2 geannoteerde montage met zijwand verwijderd voor de duidelijkheid. (B) SAT2 met zijwand intact. (C) SAT2 celblootstellingscompartiment, gedemonteerd. (D) SAT3 geannoteerde assemblage. (E) SAT3 in normale (links) en lens (rechts) configuraties voor bundelbreedte matching op verschillende frequenties. (F) SAT3 celblootstellingscompartiment, gedemonteerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg"> Figuur 2: Berekeningen van halve amplitude drukveldcontouren voor 12,7 mm diameter ongericht (links) en bolvormig gerichte (rechts) transducers. Frequenties van respectievelijk 2, 4 en 8 MHz worden weergegeven als rode, blauwe en groene contouren voor een PCD-element bij de coördinatenoorsprong (0,0). De buitenste contouren van het ongerichte apparaat zijn relatief ongevoelig voor frequentie, maar de binnenstructuur is frequentieafhankelijk. Het bolvormig gerichte veld trekt samen naarmate de frequentie toeneemt, maar binnen de contouren variëren de velden soepel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg"> Figuur 3: Instrumentatie voor cavitatiesignaalconditionering en -opname (blauwe pijlen), Amerikaanse bron excitatie (rode lijnen) en triggering van gegevensverzameling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg"> Figuur 4: Tijd (links) en frequentie (rechts) domein PCD-reacties geregistreerd met MB's verwaterd 5x in PBS. Incident piek negatieve drukken waren (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, allemaal op 0,5 MHz. Signaalopnamen beginnen 1,4 ms vóór de t = 0 start van de 2,0 ms duur ultrasone puls. (A, C, E) Tijddomeinsignalen (rood) worden weergegeven op een vaste verticale schaal, wat aangeeft hoe het responsniveau verandert met incidentdruk. De ingezette sporen tonen het signaal zoals opgenomen (rood) en met een 2 MHz high pass filter (blauw) voor een tijdvenster gecentreerd op het moment van vlucht van bron naar celblootstellingscompartiment naar PCD. (B, D, F) Ruis en signaalvermogen spectrale dichtheden worden berekend voor respectievelijk t<0 en t>0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg"> Figuur 5: Spectrumgeschiedenissen over een blootstelling van 50 seconden van een suspensie van MB's verdund 5x in PBS. (A) Volledige spectra en (B) totale, harmonische en breedband signaalkrachten, allemaal als functie van de tijd. De aandrijfomstandigheden waren 0,5 MHz, 0,7 MPa pieknegatieve druk, 2,0 ms pulsduur, 200 ms pulsherhalingsperiode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg"> Figuur 6: Effect van PCD-scherpstelgeometrie geregistreerd met een 20:1 verdunning van microbubbels in normale PBS. De rijomstandigheden waren: 1,0 MHz, 0,50 MPa pieknegatieve druk, 3,0 ms pulsduur, 10 ms pulsherhalingsperiode. (A) Volledige spectra gemiddeld over de blootstellingstijd en drie onafhankelijke monsterherhalingen. (B) Vermogen in 3, 4 en 5 MHz harmonischen, en (C) vermogen in 2,5, 3,5 en 4,5 MHz ultraharmonica. Dikke lijnen zijn monstermiddelen, gearceerde gebieden geven +/- 1 standaarddeviatie aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg"> Figuur 7: Effect van ontgaste media opgenomen met PBS. (A) Volledige spectra gemiddeld over de blootstellingstijd en vijf onafhankelijke monsterherhalingen. (B) Vermogen in 3, 4 en 5 MHz harmonischen, en (C) vermogen in 2,5, 3,5 en 4,5 MHz ultraharmonica. Dikke lijnen zijn monstermiddelen, gearceerde gebieden geven +/- 1 standaarddeviatie aan. De aandrijfomstandigheden waren 1,0 MHz, 0,50 MPa pieknegatieve druk, 1,0 ms pulsduur, 200 ms pulsherhalingsperiode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>parameter</td>
			<td>eenheid</td>
			<td>minimum</td>
			<td>maximum</td>
		</tr>
<tr>
<td>frequentie</td>
			<td>Mhz</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>druk (piek negatief)</td>
			<td>Mpa</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>pulslengte</td>
			<td>Cycli</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>duty cycle</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>belichtingstijd</td>
			<td>s</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Samenvatting van het scala aan gerapporteerde parameters die sonoporatie in vitro vergemakkelijken.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Cavitation Enhanced Therapy at JoVE.com

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Het gepresenteerde experimentele protocol kan worden gebruikt om real-time metingen uit te voeren van cavitatieactiviteit in een celkweekapparaat met als doel onderzoek mogelijk te maken naar de voorwaarden die nodig zijn voor een succesvolle medicijnafgifte en/of andere bio-effecten.

Cavitatie verbeterde therapie bestuderen

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Deze bench-top systeemontwerp-, dataverzamelings- en analyseprincipes kunnen worden gebruikt als een rationele basis voor de in-vitrostudie van cavitatieversterkte therapieën. Onze technieken maken testen met hoge doorvoer mogelijk met behoud van de kritische experimentele kenmerken van interval cavitatiebewaking, herhaalbare monsteruitlijning en compatibiliteit met gangbare cellulaire analysemethoden. Cavitatie verbeterde therapie heeft meerdere potentiële toepassingen, waaronder de behandeling van ziekten zoals kanker en beroerte.Door de onderliggende mechanismen beter te begrijpen, kunnen we betere therapieën ontwikkelen. Dit werk biedt een gemakkelijk reproduceerbaar systeemontwerp- en implementatiekader om onderzoek naar een breed scala aan cavitatie-geïnduceerde cellulaire bio-effecten mogelijk te maken. Inclusief medicijnafgifte, sonoporatie en sonoprinting.Om een zinvol resultaat te verkrijgen, moet reproduceerbaarheid en controle voor alle variabelen in het experiment worden gewaarborgd. Het is absoluut noodzakelijk om alle relevante bedieningselementen uit te voeren en het elektrische geluid te meten. Voor de bereiding van de systemen voor akoestische transfectie ontgast u de vulvloeistof gedurende ten minste twee uur onder een druk van 100 kPa om de kans op cavitatie in het voortplantingspad te minimaliseren.Bevestiging met een opgeloste zuurstofsonde dat de partiële zuurstofdruk lager is dan 10kPa wordt aanbevolen. Vul de testkamer langzaam om de herintroductie van lucht in de ontgaste vloeistof te minimaliseren en verwijder onmiddellijk eventuele resterende bellen van de transducer- en mediumcontaineroppervlakken. Laat de ultrasone bron eindversterker opwarmen volgens de aanbeveling van de fabrikant, zodat de versterking en output stabiel zijn met betrekking tot de tijd.En verdun het cavitatiemiddel terwijl u zachtjes en continu roert om een uniforme suspensie te maken zonder macrobellen in te sluiten of het middel te vernietigen. Wanneer u met microbellen werkt, zorg er dan voor dat u er zorgvuldig mee omgaat. Gebruik voor de sat2-bereiding, voordat u met het experiment begint, ethanol om het deksel van de PDMs te steriliseren.Druk op het gesteriliseerde deksel van de kweekschaal om het celcompartiment te vormen en laad een spuit van 10 milliliter uitgerust met een stompe naald van 18 gauge met 10 milliliter vulvloeistof. Steek de naald door een van de PDMs vulgaten en vul de kamer langzaam tijdens het kantelen, zodat macrobellen door het open vulgat kunnen ontsnappen. Wanneer de kamer is gevuld, plaatst u een polymeerstaaf van vier tot vijf millimeter in het open gat en plaatst u de montage zo dat de gaten horizontaal zijn.Verwijder de naald terwijl u extra vloeistof injecteert, zodat er geen lucht in de kamer wordt getrokken en sluit het vulgat met een andere polymeerstaaf. Controleer het compartiment visueel op bewijs van ingesloten macrobellen en druk op het celblootstellingscompartiment in de compartimenthouder. Houd rekening met het drijfvermogen van de deeltjes in suspensie en hoe hun drijfvermogen hun contact met cellen zal beïnvloeden bij het bepalen van de oriëntatie van het celblootstellingscompartiment.Laat vervolgens het deksel van de kamer onder een horizontale hoek zakken om macrobellen te ontmoedigen om op de ondergedompelde delen van het apparaat te rusten, installeer het deksel op de bovenkant van de kamer. Laat de suspensie, voordat u de experimentele metingen uitvoert, thermisch gelijk zijn aan de kamertemperatuur. Gebruik een fijne naald thermokoppel om te bevestigen dat de temperatuur in de kamer is gestabiliseerd.Als u de experimenten in realtime wilt volgen, in zowel tijd- als frequentiedomeinen, start u het gegevensverzamelingsproces en schakelt u het ultrasone bronstationsignaal in. Gebruik een hoogspanningssonde om het uitgangssignaal van de versterker te bewaken dat de ultrasone bron tijdens het experiment aandrijft om ervoor te zorgen dat de blootstelling verloopt zoals verwacht. En zorg ervoor dat de oscilloscoop is ingesteld om de demping van de sonde te compenseren.Tijddomeinbewaking van de passieve cavitatiedetector laat zien of signalen geschikt zijn voor de huidige instrumentatie-instellingen en of de cavitatiesignalen eerder worden gezien dan verwacht. Frequentiedomeinbewaking maakt analyse van het type bellengedrag mogelijk en kan worden gebruikt om de schijfniveaus zo nodig aan te passen om de gewenste celprikkel te bereiken. In deze analyse bestond bij de laagste incidentdruk de passieve cavitatiedetectorrespons volledig uit gehele harmonischen van de 0,5 MHz fundamentele ultrasone frequentie.Het verhogen van 0.2 tot 0.3MPa resulteerde in uitgesproken ultra harmonischen in het spectrum naast een verdere verhoogde gehele gehele harmonischen. De tijddomeingolfvormen bij deze twee drukken leken op elkaar, hoewel de 0,3 MPa-resultaten meer variabiliteit over de pulsduur aantoonden. Bij de hoogste druk groeide de amplitude van de tijddomeingolfvorm niet-lineair ten opzichte van de lagere drukken als gevolg van duidelijk verhoogd breedbandgeluid, waarschijnlijk als gevolg van traagheidsholte veroorzaakt door microbelvernietiging.Hier worden volledige spectra weergegeven gedurende een belichtingstijd van 50 seconden waarin de bron elke 0,2 seconden twee milliseconde pulsen uitzond. Zoals waargenomen in deze grafiek, die de overeenkomstige totale harmonische en breedbandkrachten illustreert, werden grote amplitudebreedbandreacties gegenereerd met de initiële piek die werd geacht te correleren met de vernietiging van de grootste bubbels. Na een paar seconden neemt de breedbandrespons snel af, blijkbaar als gevolg van bubbelvernietiging.In deze analyse met behulp van een verdunning van 20 tot 1 microbellen en normale PBS, toonden de tijd- en monstergemiddelde spectra aan dat de niet-gerichte passieve cavitatiedetector een sterkere breedbandrespons bevatte dan de scherpsteldetector. Vergezeld van een gereduceerd monster om variabiliteit in zowel de harmonische als ultra harmonische krachten te bemonsteren. Cavitatie geïnduceerde bio-effecten kunnen worden beoordeeld met behulp van technieken zoals fluorescentiemicroscopie, flowcytometrie of biologische assays.Dit maakt het mogelijk om een robuuste relatie te vestigen tussen cavitatieactiviteit en de biologische effecten. Deze techniek heeft ons in staat gesteld om de relaties tussen bubbelgedrag en biologische effecten beter te identificeren, die enkele potentiële nieuwe mechanismen hebben onthuld die de cavitatie gemedieerde medicijnafgifte ondersteunen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Studeren Cell Rolling Trajecten op Asymmetrische Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

Gebruik van plasmonische en fotonisch kristal nanostructuren voor Enhanced micro-en nanodeeltjes Manipulatie

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Microfluïdische Mixers voor het bestuderen van eiwitten vouwen

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Diagnosis of Neoplasia in Barrett&#8217;s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Diagnosis of Neoplasia in BarrettÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Diagnose van Neoplasia in Barrett-slokdarm met behulp van Vital-dye Enhanced fluorescentie beeldvorming

The ability to differentiate benign metaplasia in Barrett&#8217;s Esophagus (BE) from neoplasia in vivo remains difficult as both tissue types can be flat ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Synthese van gouden nanodeeltjes geïntegreerde Photo-responsieve liposomen en waardering van hun Microbel Cavitatie bij Pulse Laser Excitatie

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Robotic Mirror Therapy System voor functioneel herstel van Hemiplegische Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

Een microfluïdische systeem met patronen aan oppervlakken voor het onderzoeken van Cavitatie Bubble (s)-cel interactie en de daaruit voortvloeiende Bioeffects bij de single-cell niveau

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...