Name: studying cavitation enhanced therapy
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00
Duration: 7 min 36 s
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Les auteurs remercient le Conseil de recherches en génie et en sciences physiques d’avoir soutenu ces travaux par le biais de la subvention EP/L024012/1. VB est également soutenu par le Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) et le Medical Research Council (MRC) (subvention EP/L016052/1). VB et AV remercient la Fondation Clarendon pour les bourses d’études supérieures. AV remercie également Exeter College pour une bourse Santander. Les auteurs sont redevables à James Fisk et David Salisbury pour leur aide inestimable dans la fabrication de l’appareil. Ils remercient également les Drs Dario Carugo et Joshua Owen pour leur contribution à l’élaboration de prototypes antérieurs de SAT.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les étapes critiques pour toute mesure acoustique ont été encapsulées par Apfel en 198176 comme « connais ton liquide, connais ton champ sonore, sache quand quelque chose se passe. » Dans le contexte de ce protocole, ceux-ci englobent l’étalonnage et l’alignement du transducteur ainsi que les étapes de préparation de l’eau et de manipulation des bulles. Tout d’abord, il est essentiel que l’hydrophone utilisé pour étalonner le transducteur d’entraînement et/ou le PCD soit lui-même étalonné avec précision grâce à un entretien externe régulier ou à une comparaison interne avec un étalon de référence. De même, la réponse du transducteur de conduite et du PCD doit être régulièrement caractérisée pour vérifier tout changement de sortie et/ou perte de sensibilité. Si les conditions de conduite et la sensibilité de réception du système sont inconnues, il sera alors impossible de déduire une relation significative entre les conditions d’exposition, les effets biologiques et les émissions acoustiques. Directement lié à cela, l’alignement des transducteurs les uns sur les autres et de la chambre d’échantillonnage doit être soigneusement vérifié pour s’assurer que les conditions d’exposition à l’intérieur de la chambre sont conformes aux attentes et que le volume d’échantillonnage pour le PCD correspond à la région d’intérêt. Comme indiqué, la température et la teneur en gaz du milieu de suspension peuvent affecter de manière significative les résultats finaux et la cohérence est extrêmement importante à cet égard77,78. De même, la préparation, la caractérisation et la manipulation de la suspension de l’agent de cavitation nécessitent une attention toute particulière pour s’assurer que la distribution granurique et la concentration attendues des particules sont présentes dans l’échantillon. Par exemple, si la concentration de bulles est trop élevée, il y aura un blindage efficace du volume d’échantillon du champ américain incident. Les agents mb sont particulièrement sensibles à la destruction et à la coalescence et d’autres conseils sur leur manipulation peuvent être trouvés dans Mulvana et. (2012)79.
Un problème très courant avec la détection des signaux de cavitation est d’obtenir un SNR adéquat. Cela est dû en partie à la nature du signal lui-même, tel que décrit, mais peut également être dû à des sources de bruit électrique au sein de l’installation expérimentale. La vérification des connexions entre les composants du système, en particulier ceux impliquant des câbles coaxiaux, peut aider à éliminer certains d’entre eux. Il peut être nécessaire de remplacer ou de réparer les câbles coaxiaux. Il peut également être utile d’identifier et de retirer ou de désactiver d’autres équipements en laboratoire, comme les pompes qui peuvent causer du bruit électrique. Une mauvaise adaptation de l’impédance électrique entre les composants du système peut être une autre cause de mauvais rapport signal/bruit et aussi potentiellement de dommages à l’équipement et doit être soigneusement vérifiée. Les paramètres de déclenchement sur le générateur de signaux et l’oscilloscope doivent également être vérifiés pour confirmer qu’ils sont configurés de manière appropriée pour l’expérience et qu’ils ne sont pas revenus aux paramètres par défaut du fabricant. S’il y a une destruction importante des bulles pendant la manipulation, dans le cas du SAT2, il peut être utile de fixer une deuxième seringue à l’orifice de sortie et de l’utiliser pour extraire doucement le fluide de la chambre, attirant ainsi la suspension. Cela peut également aider à éliminer les macrobulles ou à permettre le flux pendant l’exposition aux États-Unis, si vous le souhaitez.
Il n’est pas possible d’éliminer complètement les réflexions acoustiques à l’intérieur de la chambre d’échantillonnage et, par conséquent, le champ incident ne sera pas complètement uniforme sur l’ensemble du volume de l’échantillon. Comme indiqué aux étapes 1.3.2 et 1.3.3, la transmissibilité des fenêtres acoustiques dépendra de la fréquence et la largeur de bande souhaitée pour les mesures des émissions acoustiques devrait donc être soigneusement examinée. En particulier, il peut y avoir des réflexions multiples significatives de composants de fréquence plus élevée. C’est une autre raison pour laquelle l’étalonnage du champ dans le système entièrement assemblé est si important pour minimiser l’incertitude de la pression incidente. Un gating approprié des signaux enregistrés devrait également être envisagé pour minimiser les effets des réflexions multiples. L’utilisation de dispositifs commerciaux pour des raisons de commodité et le besoin de transparence acoustique signifient qu’une certaine transparence optique doit être sacrifiée. Cela peut avoir une incidence sur la qualité de l’imagerie subséquente, p. ex., pour évaluer la viabilité cellulaire ou l’absorption du médicament. Certaines des membranes utilisées dans les dispositifs commerciaux sont également poreuses et, par conséquent, une isolation imparfaite se produit entre la chambre d’échantillonnage et le bain-marie environnant. Comme ci-dessus, le risque de contamination correspondant peut être atténué en utilisant une sous-chambre plus petite, dont le contenu peut être régulièrement remplacé. Les dispositifs de culture cellulaire indiqués dans la table des matériaux conviennent principalement aux monocouches cellulaires qui peuvent ne pas être représentatives des tissus en termes de tous les effets biologiques médiés par les États-Unis et la cavitation. La proximité des cellules par rapport à une surface solide affectera également la dynamique du bromure de méthyle d’une manière qui peut ne pas refléter les conditions in vivo, p. ex., en favorisant le microstreaming et le microjetting comme décrit dans l’introduction. Ces limitations peuvent être abordées, cependant, par une simple substitution des modèles alternatifs de tissu.
L’objectif de la proposition des SAT est de fournir un moyen d’améliorer la reproductibilité des conditions d’exposition acoustique et des émissions acoustiques entre les études des bioeffets médiés par les États-Unis, facilitant ainsi, espérons-le, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents et le développement de techniques de surveillance du traitement pour améliorer la sécurité et l’efficacité. Les systèmes sont conçus pour être compatibles avec les dispositifs de culture cellulaire disponibles dans le commerce, permettant d’effectuer un large éventail d’essais biologiques en fonction de l’application d’intérêt et permettant la réalisation d’expériences à haut débit, éliminant ainsi le besoin de procédures d’alignement fastidieuses entre les essais. En normalisant les protocoles de caractérisation des conditions d’exposition et de capture des émissions acoustiques, nous espérons que la variabilité dépendante du système pourra être réduite. La gamme de paramètres qui devraient être explorés pour une expérience particulière dépendra de l’application (bio-effet désiré, type de cellule, profondeur du tissu cible si in vivo, etc.) et de la nature de tout agent de cavitation utilisé. Étant donné le grand nombre de variables (fréquence us, amplitude de pression, longueur d’impulsion, fréquence de répétition d’impulsions, etc.), il est peu probable qu’il soit possible d’explorer pleinement l’ensemble de l’espace des paramètres. Un avantage du protocole proposé est qu’il permet d’établir rapidement certaines limites de cet espace de paramètres. Par exemple, il permet de déterminer la pression minimale à laquelle un signal de cavitation est généré, la pression maximale ou la longueur d’impulsion qui peut être utilisée avant le détachement / mort de la cellule, et la pression à laquelle les harmoniques fractionnaires ou le bruit à large bande sont produits. Il est recommandé qu’un tel ensemble de mesures de la portée soit effectué comme première étape de toute étude.
Comme nous l’avons présenté, les SAT sont conçus pour la surveillance en temps réel des émissions acoustiques, des essais biologiques étant effectués en dehors de l’expérience. Il serait cependant relativement simple de modifier le SAT pour permettre l’observation optique directe de la chambre d’échantillonnage via un objectif de microscope. Cela pourrait à son tour être couplé à un système de fluorescence et /ou de microscopie à grande vitesse pour permettre l’observation de l’absorption des médicaments et de la dynamique des bulles, par exemple. La sortie PCD telle qu’elle est actuellement présentée en termes de tension indique: i) les types de comportement de cavitation et leurs proportions relatives; ii) combien de temps ces comportements de cavitation persistent; iii) si les caractéristiques d’exposition cumulative dans le temps observées sont corrélées à un effet biologique particulier; et iv) si les niveaux relatifs et les comportements dépendant du temps sont compatibles avec les expériences précédentes dans le système d’exposition. Bien que la sensibilité à la réception de la PCD puisse être quantifiée, afin de caractériser de manière fiable les émissions acoustiques en termes d’énergie absolue, des informations spatiales supplémentaires sont nécessaires. Cela pourrait être réalisé en remplaçant le PCD par une sonde réseau pour mettre en œuvre la cartographie acoustique passive (PAM)80. Cela augmenterait toutefois la complexité du traitement du signal ainsi que le temps de calcul et la puissance nécessaires.
D’autres instruments de mesure de la résistance électrique de la membrane ou d’application de méthodes de ciblage physique, par exemple des champs magnétiques, pourraient également être incorporés. Il serait également possible d’utiliser des structures tissulaires tridimensionnelles telles que des sphéroïdes tumoraux, des organoïdes ou même des échantillons de tissus ex vivo sur des substrats de gel acoustiquement « mous » à la place des monocouches cellulaires pour étudier les effets américains et médiés par la cavitation dans des environnements tissulaires plus réalistes.

L’échographie (US) a été largement utilisée comme technique d’imagerie diagnostique en raison de sa nature sûre et non invasive, de sa facilité de mise en œuvre au chevet d’un patient et de sa rentabilité1. En plus de ses capacités de diagnostic et de surveillance, les États-Unis ont un potentiel considérable pour des applications thérapeutiques. Les premiers travaux ont exploré son utilisation dans la thrombolyse, la transfection de l’ADN et l’administration demédicaments2,3,4 et les États-Unis thérapeutiques représentent maintenant un domaine de recherche très actif, avec des applications comprenant le traitement tumoral5,6,7,l’immunothérapie8,9,la perturbation de la barrière hémato-encéphalique (BHE)10,11,12,la thrombolyse13,14,15et le traitement des infections bactériennes16,17. Un phénomène clé qui sous-tend ces applications est la cavitation: la nucléation, la croissance et l’oscillation des cavités gazeuses dues aux changements de pression du fluide18,19.
Il existe une gamme de mécanismes par lesquels la cavitation produit des effets biologiques. Par exemple, la nature hautement non linéaire des oscillations de bulles sous l’influence d’un champ us appliqué peut générer un microstreaming dans le liquide environnant qui peut à la fois améliorer la convectionmédicamenteuse 20 et exercer des contraintes de cisaillement sur le tissu à proximité des bulles. Ceci est particulièrement répandu lorsque les bulles se trouvent à proximité d’une limite, provoquant l’oscillation non sphérique des bulles, et pouvant potentiellement favoriser l’absorption de médicaments par perméabilisation induite par cisaillement21,22,23,24. À des pressions plus élevées, on observe des oscillations de plus grande amplitude et un effondrement rapide des bulles, conférant une contrainte mécanique directe25 et générant fréquemment des ondes de choc, et donc de grands gradients de pression qui peuvent perturber et perméabiliser les tissus26,27. L’effondrement de bulles près d’une surface peut également entraîner la formation de microjets liquides à grande vitesse28,29,30. Ces microjets peuvent pénétrer dans les tissus, créant potentiellement des pores ou induisant des ondes de stress secondaires31,32. La perméabilisation des membranes biologiques tant au niveau tissulaire qu’au niveau cellulaire est diversement appelée sonophorèse, utilisée principalement dans le contexte de l’amélioration induite par les États-Unis de la perméabilité de la peau33,34,et de la sonoporation, utilisée principalement pour décrire la perméabilisation réversible de la membrane cellulaire due à la formation de pores membranaires35,36.
L’absorption visqueuse dans le liquide entourant immédiatement la bulle oscillante peut produire un effet de chauffage substantiel37. De plus, les oscillations hautement non linéaires produisent un rayonnement acoustique à des fréquences supérieures à celles du champ us de conduite. Cela conduit à une absorption accrue dans les tissus environnants et à un chauffage supplémentaire38. L’effondrement de la bulle peut également s’accompagner d’effets chimiques dus aux températures et pressions élevées transitoires dans le noyau de la bulle, tels que la génération d’espèces hautement réactives et le rayonnement électromagnétique, connu sous le nom de sonoluminescence32. Ces effets ont été étudiés pour évaluer les dommages potentiels et/ou l’activation des voies cellulaires pertinentes pour l’administration39 et exploités dans l’activation locale de médicaments sensibles à la lumière dans une approche connue sous le nom de thérapie sonodynamique40,41,42,43.
De nombreux bioeffets médiés par les États-Unis peuvent être initiés uniquement par le contrôle des paramètres de champ américains (amplitude de la pression, fréquence, longueur d’impulsion et fréquence de répétition, et durée de l’exposition), mais générer de manière fiable une cavitation dans les tissus biologiques nécessite souvent des énergies d’entrée élevées et comporte donc un risque élevé de dommages. L’introduction de noyaux de cavitation exogènes ou artificiels peut réduire considérablement l’énergie d’entrée nécessaire pour produire le large éventail d’effets discutés ci-dessus et introduit en outre des effets supplémentaires qui peuvent ne pas être possibles avec les États-Unis seuls. Les noyaux de cavitation comprennent les bulles de gaz26,44,les gouttelettes liquides45,46,47 et les particules solides48,49,50,les noyaux de cavitation à l’échelle nanométrique étant un domaine d’investigation émergent pour leurs avantages en termes de temps de circulation prolongé, d’extravasation améliorée et d’activité de cavitation prolongée49,51,52,53.
Les noyaux les plus couramment utilisés sont les microbulles gazeuses (MBs), utilisés à l’origine comme agents de contraste en imagerie diagnostique. Ils ont généralement un diamètre de 1 à 2 micromètres et contiennent un noyau de gaz de poids moléculaire élevé à faible solubilité aqueuse dans le milieu environnant. Le noyau est entouré d’une enveloppe protectrice lipidique, protéique ou polymère le plus souvent constituée de phospholipides54. Lorsqu’ils sont exposés à un champ US, la compressibilité des MBs les fait subir des oscillations volumétriques, produisant par conséquent une forte diffusion acoustique, ce qui est responsable du succès des MBs en tant qu’agent de contraste. Comme mentionné, ces oscillations conduisent également aux effets mécaniques, thermiques et chimiques susmentionnés qui peuvent être exploités dans des applications thérapeutiques. Le procédé de revêtement mb offre également un mécanisme pour encapsulant des médicaments dans la structure mb et pour attacher des médicaments et/ou cibler des espèces à la surface mb. Cette technique facilite la libération déclenchée de médicaments pour réduire la toxicité systémique55. Il a également été récemment démontré que le matériel de la surface du MB peut être transféré à des structures biologiques, améliorant l’administration de médicaments par ce qu’on appelle la « sonoimpression »56,57,58.
La surveillance de l’activité de cavitation médiée par les États-Unis peut fournir des informations sur les effets biologiques qui en résultent in vitro et in vivo et permet potentiellement le réglage et l’optimisation de ces effets. Les deux méthodes les plus largement utilisées pour surveiller l’activité de cavitation sont i) optiques, qui utilisent la microscopie vidéo à très grande vitesse et ne sont généralement pas réalisables invivo; et ii) acoustiques, qui enregistrent les champs sonores re-rayonnés produits par les bulles oscillantes et/ou qui s’effondrent. Les composantes amplitude et fréquence du signal acoustique contiennent des informations sur le comportement des bulles. Il a été démontré que de faibles concentrations de bulles à de faibles amplitudes incidentes aux États-Unis produisent principalement des émissions harmoniques (multiples entiers de la fréquence de conduite)59. À mesure que les pressions d’entraînement augmentent, le spectre d’émission de bulles peut également contenir des composants fractionnaires connus sous le nom de sous-harmoniques et d’ultraharmoniques60 qui indiquent un comportement non linéaire plus fort, ainsi que du bruit à large bande, qui indique une cavitation inertielle. Les harmoniques entières sont un indicateur primaire de l’oscillation des bulles, mais peuvent également être causées par des non-linéarités n’importe où dans un système expérimental, par exemple, en raison d’une propagation non linéaire. En revanche, les harmoniques fractionnaires et le bruit à large bande sont très fortement corrélés avec la dynamique des bulles.
La relation entre le comportement des bulles et les émissions acoustiques détectées peut être compliquée par des facteurs tels que le champ us incident, l’environnement de nucléation, et les caractéristiques de la voie de détection60. Néanmoins, des informations importantes sur le comportement des bulles et leurs interactions avec les cellules peuvent être obtenues en discernant les tendances de fréquence et d’énergie dans le spectre acoustique. Ces données peuvent également fournir des informations précieuses qui peuvent être utilisées pour former la base des techniques de surveillance du traitement clinique. Pour exploiter pleinement ces informations, le développement de méthodes expérimentales robustes, traduisibles et reproductibles est nécessaire.
À l’heure actuelle, il existe des variations substantielles dans les protocoles signalés pour la conception de systèmes et la réalisation d’études pour soutenir le développement de thérapies assistées par cavitation. En ce qui concerne l’appareil, une gamme d’approches de conception a été entreprise. Plusieurs groupes ont utilisé des chambres à plaques parallèles56,61,62,63,construites sur mesure ou disponibles dans le commerce (par exemple, OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et coll. (2013) ont développé une chambre cellulaire couplée à un module de sonication américain et à une imagerie confocale en temps réel64,Carugo et coll. (2015) ont utilisé un système comprenant une boîte de culture cellulaire disponible dans le commerce avec un couvercle PDMS sur mesure pour permettre la submersion dans un bain-marie pendant l’exposition américaine65, et Pereno et coll. (2018) ont utilisé un dispositif composé de résonateurs acoustofluidiques en couches qui permettent une caractérisation optique et acoustique simultanée de la dynamique des bulles et des interactions bulle-cellule66. L’utilisation de conceptions fabriquées sur mesure et spécifiques à l’application complique la caractérisation du champ américain et d’autres conditions d’exposition environnementale, ce qui rend les comparaisons d’études croisées difficiles. Par exemple, il existe une variation considérable dans les paramètres américains identifiés pour obtenir une sonoporation réussie, qui comprennent des fréquences centrales allant de 0,02 à 15 MHz, des cycles de service variant de 1% à une onde continue et des pressions de fabrication rares allant de 0,1 à 20 MPa23,64,67,68,69,70 (tableau 1). Il existe également une variation considérable dans les composantes spectrales (harmoniques, sous-harmoniques, etc.) qui ont été identifiées comme étant associées à des bioeffets particuliers.
L’objectif de ce travail est donc de fournir un cadre de conception et de mise en œuvre de systèmes facilement reproductibles pour l’étude in vitro des bioeffets cellulaires induits par la cavitation avec l’inclusion spécifique d’une capacité de surveillance de la cavitation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorber</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>APTFlex F28 panel</td>
			<td>1.0 cm standard thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (power)</td>
			<td>E&#38;I Ltd.</td>
			<td>1040L</td>
			<td>400W power amplifier to drive ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (pre)</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR445A</td>
			<td>Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium heater</td>
			<td>Aquael</td>
			<td>Ultra 50W</td>
			<td>Different models for different tank sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>TiePie Engineering</td>
			<td>HS5-110-XM</td>
			<td>Extended memory option: 32M points per channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>FOH</td>
			<td>0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>SonoVue</td>
			<td>FDA approved microbubbles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD mirror (SAT3)</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>F-102</td>
			<td>90 degree beam reflection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD transducer</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>V320-SU</td>
			<td>Immersion transducer, 7.5MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD waterproof cable</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>BCU-58-1 W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (SAT2 compartment lid)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer rod (SAT2 seal)</td>
			<td>Zeus</td>
			<td>PTFE monofilament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber plug (SAT3 lid/seal)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-2101</td>
			<td>6mm bottom dia., 8mm top dia., red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>33250</td>
			<td>Waveform generator for ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>&#181;-Dish 35mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT3</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Transwell 6.5mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound source (SAT3)</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>H107 with central hole</td>
			<td>Use of a HIFU-capable source allows pressures &#62;1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying cavitation enhanced therapy

L’intérêt pour les applications thérapeutiques de l’échographie est important et croissant, avec des cibles cliniques potentielles allant du cancer à la maladie d’Alzheimer. La cavitation - la formation et le mouvement ultérieur de bulles dans un champ d’ultrasons - représente un phénomène clé qui sous-tend bon nombre de ces traitements. Il reste cependant une incertitude considérable concernant les mécanismes d’action détaillés par lesquels la cavitation favorise les effets thérapeutiques et il est nécessaire de développer des techniques de surveillance fiables qui peuvent être mises en œuvre cliniquement. En particulier, il existe une variation importante entre les études sur les paramètres d’exposition déclarés comme produisant avec succès des effets thérapeutiques et les émissions acoustiques correspondantes. L’objectif de cet article est de fournir des lignes directrices de conception et un protocole expérimental utilisant des composants largement disponibles pour effectuer des études sur les bioeffets médiés par la cavitation, et d’inclure une surveillance acoustique en temps réel. On espère que le protocole permettra une intégration plus généralisée de la surveillance acoustique dans les expériences échographiques thérapeutiques et facilitera la comparaison entre les études des conditions d’exposition et de leur corrélation avec les effets biologiques pertinents.

La figure 4 montre des exemples de réponses PCD dans le domaine temporel et fréquentiel, illustrant trois comportements de cavitation distincts. Toutes les données ont été recueillies sur SAT3 à l’aide de SonoVue MBs dilués 5x dans du PBS, avec une concentration finale d’environ 2*107 MBs/ml. La température pour tous les exemples de cette section était de 19 ± 1 °C. La source américaine a été entraînée avec une impulsion de 2,0 ms à 0,5 MHz pour atteindre des pressions négatives de pointe incidentes de 0,20(figures 4A et 4B),0,30(figure 4C et 4D)et 0,70 MPa(figures 4E et 4F). Les enregistrements de signaux ont commencé 1,4 ms avant le début t = 0 de l’impulsion américaine. Les traces en médaillon montrent le signal tel qu’enregistré (rouge) et avec un filtre passe-haut de 2 MHz (bleu) pour une fenêtre de temps centrée au moment du vol de la source au compartiment d’exposition de la cellule à PCD. La réponse de bas niveau avant cette heure est due au rayonnement directement reçu de la source, ce qui est courant dans les configurations où le PCD est derrière la source américaine.
À la pression incidente la plus basse, la réponse PCD se compose entièrement d’harmoniques entières de la fréquence fondamentale américaine de 0,5 MHz. L’augmentation de 0,20 à 0,30 MPa entraîne des ultraharmonies prononcées dans le spectre en plus d’harmoniques entières encore plus élevées. Les formes d’onde du domaine temporel à ces deux pressions semblent similaires, bien que les résultats de 0,30 MPa montrent une plus grande variabilité sur la durée de l’impulsion. À la pression la plus élevée, l’amplitude de la forme d’onde du domaine temporel a augmenté de manière non linéaire par rapport aux pressions plus faibles en raison du bruit à large bande clairement élevé visible dans le spectre. Ce bruit est communément considéré comme le résultat d’une cavitation inertielle et dans cet exemple, correspond à la destruction des MBs.
Pour y voir plus clair, les réponses PCD en fonction du temps sont illustrées à la figure 5. Dans le panneau de gauche(Figure 5A),des spectres complets sont affichés sur un temps d’exposition de 50 secondes, au cours duquel la source émet 2,0 ms d’impulsions toutes les 0,20 secondes. Les puissances totales, harmoniques et large bande correspondantes sont indiquées dans le panneau de droite(Figure 5B). Les États-Unis ont été activés à t = 3 ,0 s, moment auquel des réponses à large bande de grande amplitude ont été observées. On pense que le pic initial correspond à la destruction des plus grandes bulles de la suspension (SonoVue est polydisperse) et est une observation courante dans les expériences de cavitation avec des bulles décortiquées et même avec des milieux non dégazés (par exemple, PBS).
Après quelques secondes, la réponse à large bande a rapidement diminué, apparemment en raison de la destruction des bulles, et le signal est principalement composé d’harmoniques. Cela suggère que le gaz libéré et les MBs restants vibrent de manière stable et non inertielle. À t ~ 50s, la composante large bande est tombée au niveau du bruit de fond d’origine. Des tests d’exposition comme celui-ci sont donc importants pour essayer de comprendre les échelles de temps pendant lesquelles différents effets de bulle peuvent agir sur les cellules de la chambre.
Les bulles sont susceptibles de se traduire en réponse aux forces de rayonnement générées pendant l’exposition aux États-Unis et le mouvement des BM à l’extérieur et à l’extérieur du champ de vision pcd peut conduire à une variabilité accrue du signal de cavitation surveillé, en particulier lorsqu’il s’agit de suspensions diluées. La région sensible de la PCD devrait donc couvrir autant que possible la surface d’exposition cellulaire. Une comparaison des réponses focalisés et non focalisés PCD avec des fréquences centrales identiques (voir figure 2)est illustrée à la figure 6,en utilisant une dilution 20:1 des MBs dans le PBS normal est SAT2. Les spectres moyennés par le temps et l’échantillon dans le panneau Figure 6A montrent que le PCD non focalisé contient une réponse large bande plus forte, accompagnée d’une variabilité réduite d’échantillon à échantillon dans les puissances harmoniques(Figure 6B)et ultraharmoniques(Figure 6C).
Il est important de reconnaître que les milieux utilisés pour le travail cellulaire in vitro ne sont pas dégazés et peuvent présenter un niveau de fond accru d’activité des bulles. La figure 7 montre la réponse en SAT2 du PBS utilisé sous sa forme fournie par le fournisseur et après deux heures de dégazage sous vide, après quoi la saturation en air a été réduite de 92% à 46% comme déterminé avec un capteur optique (PreSens, Allemagne). Les spectres de la figure 7A ont fait l’état d’une moyenne sur le temps d’exposition et les répétitions avec cinq échantillons indépendants, et montrent clairement des ultraharmoniques clairement élevées dans le PBS normal. Les puissances additionnées sur trois harmoniques(Figure 7B)sont bien dans l’écart type de chaque sortie expérimentale. En revanche, les sommes ultraharmoniques de la figure 7C montrent que le PBS normal a un niveau presque d’un ordre de grandeur plus élevé et une variabilité sensiblement plus élevée entre les échantillons. Ces exemples indiquent qu’un milieu commun compatible avec les cellules peut présenter des comportements qui pourraient être (incorrectement) attribués à la présence de MBs. Puisqu’il est habituellement peu pratique de dégazer le milieu de culture en raison de l’impact négatif sur les cellules et/ou la stabilité d’agent de cavitation, il est essentiel d’exécuter des contrôles appropriés dans n’importe quelle étude cavitation-connexe.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg"> Figure 1 : Illustrations de deux conceptions de systèmes d’exposition américains intégrant la surveillance de la cavitation : SAT3 (D-F). (A) Ensemble annoté SAT2 avec paroi latérale enlevée pour plus de clarté. (B) SAT2 avec paroi latérale intacte. (C) Compartiment d’exposition des cellules SAT2, démonté. (D) Assemblage annoté SAT3. (E) SAT3 dans des configurations normales (gauche) et à lentilles (droite) pour l’appariement de largeur de faisceau à différentes fréquences. (F) Compartiment d’exposition de cellules SAT3, démonté. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg"> Figure 2 : Calculs des contours de champ de pression de demi-amplitude pour les transducteurs flous (gauche) et focalisés sphériquement (à droite) de diamètre. Les fréquences de 2, 4 et 8 MHz sont représentées par des contours rouge, bleu et vert, respectivement, pour un élément PCD à l’origine de la coordonnée (0,0). Les contours les plus à l’extérieur du dispositif flou sont relativement insensibles à la fréquence, mais la structure intérieure dépend de la fréquence. Le champ focalisé sphériquement se contracte à mesure que la fréquence augmente, mais à l’intérieur des contours, les champs varient en douceur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg"> Figure 3 : Instrumentation pour le conditionnement et l’enregistrement du signal de cavitation (flèches bleues), l’excitation de la source américaine (lignes rouges) et le déclenchement de l’acquisition de données. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg"> Figure 4 : Réponses PCD temporelles (à gauche) et fréquentiels (à droite) enregistrées avec des BM diluées 5x dans du PBS. Les pressions négatives maximales de l’incident étaient (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, le tout à 0,5 MHz. Les enregistrements de signaux commencent 1,4 ms avant le début t = 0 de l’impulsion ultrasonore de durée de 2,0 ms. (A, C, E) Les signaux du domaine temporel (rouge) sont affichés sur une échelle verticale fixe, indiquant comment le niveau de réponse change avec la pression incidente. Les traces en médaillon montrent le signal tel qu’enregistré (rouge) et avec un filtre passe-haut de 2 MHz (bleu) pour une fenêtre de temps centrée au moment du vol de la source au compartiment d’exposition de la cellule à PCD. (B, D, F) Les densités spectrales de bruit et de puissance du signal sont calculées pour t<0 et t>0, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg"> Figure 5 : Historique du spectre sur une exposition de 50 secondes d’une suspension de MBs diluée 5x dans du PBS. (A) Spectres complets et (B) puissances totales, harmoniques et de signaux à large bande, le tout en fonction du temps. Les conditions d’entraînement étaient de 0,5 MHz, de pression négative maximale de 0,7 MPa, de durée d’impulsion de 2,0 ms, de période de répétition d’impulsion de 200 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg"> Figure 6: Effet de la géométrie de mise au point de la PCD enregistré avec une dilution 20:1 des microbulles dans le PBS normal. Les conditions d’entraînement étaient les suivantes : 1,0 MHz, 0,50 MPa de pression négative maximale, durée d’impulsion de 3,0 ms, période de répétition d’impulsion de 10 ms. (A) Spectres complets moyennés sur le temps d’exposition et trois répétitions indépendantes de l’échantillon. (B) Puissance en harmoniques de 3, 4 et 5 MHz, et puissance(C)en ultraharmoniques de 2,5, 3,5 et 4,5 MHz. Les lignes épaisses sont des moyennes d’échantillonnage, les zones ombragées indiquent +/- 1 écart type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg"> Figure 7: Effet des milieux dégazés enregistrés avec du PBS. (A) La moyenne des spectres complets sur le temps d’exposition et cinq répétitions indépendantes de l’échantillon. (B) Puissance en harmoniques de 3, 4 et 5 MHz, et puissance(C)en ultraharmoniques de 2,5, 3,5 et 4,5 MHz. Les lignes épaisses sont des moyennes d’échantillonnage, les zones ombragées indiquent +/- 1 écart type. Les conditions d’entraînement étaient de 1,0 MHz, de pression négative maximale de 0,50 MPa, de durée d’impulsion de 1,0 ms, de période de répétition d’impulsion de 200 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>paramètre</td>
			<td>unité</td>
			<td>minimum</td>
			<td>maximum</td>
		</tr>
<tr>
<td>fréquence</td>
			<td>Mhz</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>pression (pic négatif)</td>
			<td>Mpa</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>longueur de l’impulsion</td>
			<td>Cycles</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>cycle d’affectation</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>temps d’exposition</td>
			<td>s</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Résumé de la gamme de paramètres rapportés facilitant la sonoporation in vitro.

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Studying Cavitation Enhanced Therapy

Le protocole expérimental présenté peut être utilisé pour effectuer des mesures en temps réel de l’activité de cavitation dans un dispositif de culture cellulaire dans le but de permettre l’étude des conditions requises pour une administration réussie de médicaments et / ou d’autres bioeffets.

Étude de la thérapie améliorée par cavitation

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Ces principes de conception, de collecte de données et d’analyse de systèmes de paillages peuvent être utilisés comme base rationnelle pour l’étude in vitro des thérapies améliorées par cavitation. Nos techniques permettent des tests à haut débit tout en préservant les attributs expérimentaux critiques de la surveillance de la cavitation par intervalles, de l’alignement reproductible des échantillons et de la compatibilité avec les méthodes d’analyse cellulaire courantes. La thérapie améliorée par cavitation a de multiples applications potentielles, y compris le traitement de maladies telles que le cancer et les accidents vasculaires cérébraux.En comprenant mieux les mécanismes sous-jacents, nous pouvons développer de meilleures thérapies. Ce travail fournit un cadre de conception et de mise en œuvre de systèmes facilement reproductible pour permettre la recherche sur une grande variété d’effets biologiques cellulaires induits par la cavitation. Y compris l’administration de médicaments, la sonoporation et la sonoimpression.Pour obtenir des résultats significatifs, il faut assurer la reproductibilité et le contrôle de toutes les variables de l’expérience. Il est impératif d’effectuer toutes les commandes pertinentes et de mesurer le bruit électrique. Pour la préparation des systèmes de transfection acoustique, dégaz le liquide de remplissage sous une pression de 100kPa pendant au moins deux heures afin de minimiser la probabilité de cavitation dans le chemin de propagation.La confirmation avec une sonde d’oxygène dissous que la pression partielle de l’oxygène est inférieure à 10kPa est recommandée. Remplissez lentement la chambre d’essai pour minimiser la réintroduction d’air dans le liquide dégazé et dégagez immédiatement les bulles résiduelles du transducteur et des surfaces moyennes du récipient. Laissez l’amplificateur de puissance de la source à ultrasons se réchauffer selon la recommandation du fabricant afin que le gain et la sortie soient stables par rapport au temps.Et diluer l’agent de cavitation tout en remuant doucement et continuellement pour faire une suspension uniforme sans piétiner les bulles macro ou détruire l’agent. Lorsque vous travaillez avec des micro-bulles, assurez-vous de les manipuler avec soin. Pour la préparation SAT2, avant de commencer l’expérience, utilisez de l’éthanol pour stériliser le couvercle des PDP.Appuyez sur ajuster le couvercle stérilisé à la boîte de culture pour former le compartiment cellulaire et chargez une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille émoussée de calibre 18 avec 10 millilitres du liquide de remplissage. Insérez l’aiguille à travers l’un des PDP remplissez les trous et remplissez lentement la chambre en inclinant afin que les bulles macro puissent s’échapper à travers le trou de remplissage ouvert. Lorsque la chambre a été remplie, insérez une tige de polymère de quatre à cinq millimètres dans le trou ouvert et positionnez l’ensemble de manière à ce que les trous soient horizontaux.Retirez l’aiguille tout en injectant du liquide supplémentaire afin que l’air ne soit pas aspiré dans la chambre et fermez le trou de remplissage avec une autre tige en polymère. Vérifiez visuellement le compartiment pour déceler des signes de macrobulles piégées et appuyez sur l’ajustement du compartiment d’exposition de la cellule dans le support du compartiment. Tenez compte de la flottabilité des particules en suspension et de la façon dont leur flottabilité affectera leur contact avec les cellules au moment de décider de l’orientation du compartiment d’exposition cellulaire.Ensuite, en abaissant le couvercle de la chambre à un angle horizontal pour décourager les bulles macro de se reposer sur les parties immergées de l’appareil, installez le couvercle sur le dessus de la chambre. Avant d’effectuer les mesures expérimentales, laissez la suspension s’équilibrer thermiquement avec la température de la chambre. Utilisation d’un thermocouple à aiguille fine pour confirmer que la température dans la chambre s’est stabilisée.Pour surveiller les expériences en temps réel, dans les domaines temporel et fréquent, démarrez le processus de collecte de données et activez le signal du lecteur de source à ultrasons. Utilisez une sonde haute tension pour surveiller le signal de sortie de l’amplificateur qui entraîne la source d’ultrasons tout au long de l’expérience afin de vous assurer que l’exposition se déroule comme prévu. Et assurez-vous que l’oscilloscope est réglé pour compenser l’atténuation de la sonde.La surveillance du domaine temporel du détecteur de cavitation passive révèle si les signaux sont dimensionnés de manière appropriée pour les paramètres d’instrumentation actuels et si les signaux de cavitation sont vus plus tôt que prévu. La surveillance du domaine fréquentiel permet d’analyser le type de comportement des bulles et peut être utilisée pour ajuster les niveaux d’entraînement si nécessaire pour obtenir le stimulus cellulaire souhaité. Dans cette analyse, à la pression incidente la plus basse, la réponse passive du détecteur de cavitation consistait entièrement en harmoniques entières de la fréquence ultrasonore fondamentale de 0,5 MHz.L’augmentation de 0,2 à 0,3 MPa a entraîné des harmoniques ultra prononcées dans le spectre en plus d’une autre harmonique entière élevée. Les formes d’onde du domaine temporel à ces deux pressions semblaient similaires, bien que les résultats de 0,3 MPa démontraient une plus grande variabilité sur la durée de l’impulsion. À la pression la plus élevée, l’amplitude de la forme d’onde du domaine temporel a augmenté de manière non linéaire par rapport aux pressions plus faibles en raison du bruit à large bande clairement élevé, probablement en raison de la cavitation inertielle causée par la destruction de microbulles.Ici, les spectres complets sont affichés sur un temps d’exposition de 50 secondes pendant lequel la source a émis deux impulsions millisecondes toutes les 0,2 secondes. Comme on l’a observé dans ce graphique, illustrant les puissances harmoniques et à large bande totales correspondantes, des réponses à large bande de grande amplitude ont été générées, le pic initial étant considéré comme corrélé avec la destruction des plus grandes bulles. Après quelques secondes, la réponse à large bande diminue rapidement, apparemment en raison de la destruction des bulles.Dans cette analyse utilisant une dilution de 20 à 1 des micro-bulles et du PBS normal, les spectres moyens de temps et d’échantillon ont montré que le détecteur de cavitation passive non focalisé contenait une réponse à large bande plus forte que le détecteur de mise au point. Accompagné d’un échantillon réduit à la variabilité de l’échantillon dans les puissances harmoniques et ultra harmoniques. Les effets biologiques induits par la cavitation peuvent être évalués à l’aide de techniques telles que la microscopie à fluorescence, la cytométrie en flux ou des tests biologiques.Cela permet d’établir une relation solide entre l’activité de cavitation et les effets biologiques. Cette technique nous a permis de mieux identifier les relations entre le comportement des bulles et les effets biologiques qui ont révélé de nouveaux mécanismes potentiels sous-tendant l’administration de médicaments médiée par cavitation.

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Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

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A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

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