Name: studying cavitation enhanced therapy
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00
Duration: 7 min 36 s
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Gli autori ringraziano il Consiglio di Ricerca di Ingegneria e Scienze Fisiche per aver sostenuto questo lavoro attraverso la sovvenzione EP/L024012/1. VB è inoltre supportato dal Consiglio di ricerca in ingegneria e scienze fisiche (EPSRC) e dal Medical Research Council (MRC) (sovvenzione EP/L016052/1). VB e AV ringraziano la Clarendon Foundation for Post Graduate Scholarships. AV ringrazia anche l'Exeter College per una borsa di studio Santander. Gli autori sono in debito con James Fisk e David Salisbury per la loro preziosa assistenza nella produzione dell'apparato. Riconoscono anche con gratitudine i contributi dei dottori Dario Carugo e Joshua Owen nello sviluppo di precedenti TEST prototipo.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I passaggi critici per qualsiasi misurazione acustica sono stati incapsulati da Apfel nel 198176 come "conosci il tuo liquido, conosci il tuo campo sonoro, sa quando succede qualcosa". Nel contesto di questo protocollo, questi comprendono la calibrazione e l'allineamento del trasduttore e le fasi di preparazione dell'acqua e di movimentazione delle bolle. In primo luogo, è essenziale che l'idrofono utilizzato per calibrare il trasduttore di guida e/o il PCD sia a sua volta calibrato con precisione attraverso una regolare manutenzione esterna o un confronto interno con uno standard di riferimento. Allo stesso modo, la risposta sia del trasduttore di guida che della PCD deve essere regolarmente caratterizzata per verificare eventuali cambiamenti nell'uscita e/ o perdita di sensibilità. Se le condizioni di guida e la sensibilità del sistema sono sconosciute, sarà impossibile dedurre alcuna relazione significativa tra condizioni di esposizione, bioeffetto ed emissioni acustiche. Direttamente correlato a questo, l'allineamento dei trasduttori tra loro e la camera campione devono essere attentamente controllati per garantire che le condizioni di esposizione all'interno della camera siano come previsto e che il volume di campionamento per la PCD corrisponda alla regione di interesse. Come indicato, la temperatura e il contenuto di gas del mezzo di sospensione possono influire in modo significativo sui risultati finali e la coerenza è estremamente importante aquesto proposito 77,78. Allo stesso modo, la preparazione, la caratterizzazione e la manipolazione della sospensione dell'agente di cavitazione richiedono molta attenzione per garantire che la distribuzione delle dimensioni e la concentrazione previste di particelle siano presenti all'interno del campione. Ad esempio, se la concentrazione di bolle è troppo alta, ci sarà una schermatura efficace del volume del campione dal campo statunitense incidente. Gli agenti MB sono particolarmente suscettibili alla distruzione e alla coalescenza e ulteriori indicazioni sulla loro manipolazione possono essere trovate a Mulvana et. (2012)79.
Un problema molto comune con il rilevamento dei segnali di cavitazione è il raggiungimento di un SNR adeguato. Ciò è dovuto in parte alla natura del segnale stesso, come descritto, ma può anche essere dovuto a fonti di rumore elettrico all'interno dell'impianto sperimentale. Il controllo delle connessioni tra i componenti del sistema, in particolare quelli che coinvolgono cavi coassiali, può contribuire ad eliminarli. Potrebbe essere necessaria la sostituzione o la riparazione di cavi coassiali. Anche identificare e rimuovere o disattivare altre apparecchiature in laboratorio, come le pompe che possono causare rumore elettrico, possono essere d'aiuto. Una scarsa corrispondenza dell'impedenza elettrica tra i componenti del sistema può essere un'ulteriore causa di scarso rapporto segnale/rumore e anche potenzialmente di danni alle apparecchiature e deve essere attentamente controllata. Le impostazioni di attivazione sul generatore di segnale e sull'oscilloscopio devono essere controllate in modo simile per confermare che sono configurate in modo appropriato per l'esperimento e non sono tornate alle impostazioni predefinite del produttore. Se c'è una distruzione significativa di bolle durante la manipolazione, nel caso del SAT2, può essere utile attaccare una seconda siringa alla porta di uscita e usarla per estrarre delicatamente il fluido dalla camera, disegnando così la sospensione. Questo può anche aiutare a eliminare le macrobolle o abilitare il flusso durante l'esposizione negli Stati Uniti, se lo si desidera.
Non è possibile eliminare completamente i riflessi acustici all'interno della camera campione e quindi il campo incidente non sarà completamente uniforme sull'intero volume del campione. Come indicato nei passaggi 1.3.2 e 1.3.3, la trasmissibilità delle finestre acustiche dipenderà dalla frequenza e quindi la larghezza di banda desiderata per le misurazioni delle emissioni acustiche dovrebbe essere attentamente considerata. In particolare, possono esserci riflessi multipli significativi di componenti a frequenza più elevata. Questo è un altro motivo per cui la calibrazione del campo all'interno del sistema completamente assemblato è così importante per ridurre al minimo l'incertezza nella pressione incidente. Si dovrebbe inoltre prendere in considerazione un'adeguata riduzione al minimo degli effetti di più riflessioni. L'uso di dispositivi commerciali per comodità e la necessità di trasparenza acustica significano che occorre sacrificare una certa trasparenza ottica. Ciò può influire sulla qualità dell'imaging successivo, ad esempio per valutare la vitalità cellulare o l'assorbimento di farmaci. Alcune delle membrane utilizzate nei dispositivi commerciali sono anche porose e, quindi, si verifica un isolamento imperfetto tra la camera campione e il bagno d'acqua circostante. Come sopra, il corrispondente rischio di contaminazione può essere mitigato utilizzando una sottocamera più piccola, il cui contenuto può essere regolarmente sostituito. I dispositivi di coltura cellulare indicati nella tabella dei materiali sono adatti principalmente per monostrati cellulari che potrebbero non essere rappresentativi dei tessuti in termini di tutti i bioeffati mediati dalla cavitazione/cavitazione. La vicinanza delle cellule a una superficie solida influenzerà anche la dinamica MB in un modo che potrebbe non riflettere le condizioni in vivo, ad esempio promuovendo il microstreaming e il microjetting come descritto nell'introduzione. Queste limitazioni possono essere affrontate, tuttavia, attraverso una semplice sostituzione di modelli tissutali alternativi.
L'obiettivo della proposta delle AST è quello di fornire uno strumento per migliorare la riproducibilità delle condizioni di esposizione acustica e delle emissioni acustiche tra gli studi sui bioeffati mediati negli Stati Uniti, facilitando così, si spera, una migliore comprensione dei meccanismi sottostanti e lo sviluppo di tecniche di monitoraggio del trattamento per migliorare la sicurezza e l'efficacia. I sistemi sono progettati per essere compatibili con i dispositivi di coltura cellulare disponibili in commercio, consentendo di eseguire un'ampia gamma di saggi biologici in base all'applicazione di interesse e consentendo le prestazioni di esperimenti ad alta produttività, eliminando la necessità di procedure di allineamento dispendiose in termini di tempo tra le corse. Standardizzando i protocolli per la caratterizzazione delle condizioni di esposizione e la cattura delle emissioni acustiche, si spera che la variabilità dipendente dal sistema possa essere ridotta. La gamma di parametri che dovrebbero essere esplorati per un particolare esperimento dipenderà dall'applicazione (bio-effetto desiderato, tipo di cellula, profondità del tessuto bersaglio se in vivo, ecc.) e dalla natura di qualsiasi agente di cavitazione utilizzato. Dato il gran numero di variabili (frequenza usa, ampiezza della pressione, lunghezza dell'impulso, frequenza di ripetizione dell'impulso, ecc.) è improbabile che esplorare completamente l'intero spazio dei parametri sia praticabile. Un vantaggio del protocollo proposto è che consente di stabilire rapidamente alcuni limiti su questo spazio dei parametri. Ad esempio, consente di determinare la pressione minima alla quale viene generato un segnale di cavitazione, la pressione massima o la lunghezza dell'impulso che può essere utilizzata prima che si verifichi il distacco/morte cellulare e la pressione alla quale vengono prodotte armoniche frazionarie o rumore a banda larga. Si raccomanda di effettuare una tale serie di misurazioni dell'ambito come primo passo in qualsiasi studio.
Come presentati, i TEST sono progettati per il monitoraggio in tempo reale delle emissioni acustiche, con test biologici eseguiti al di fuori dell'esperimento. Sarebbe relativamente semplice, tuttavia, modificare il SAT per consentire l'osservazione ottica diretta della camera campione attraverso un obiettivo al microscopio. Ciò potrebbe a sua volta essere abbinato a un sistema di fluorescenza e/o microscopia ad alta velocità per consentire, ad esempio, l'osservazione dell'assorbimento dei farmaci e della dinamica delle bolle. L'uscita PCD attualmente presentata in termini di tensione indica: i) i tipi di comportamento di cavitazione e le loro proporzioni relative; ii) per quanto tempo persistono questi comportamenti di cavitazione; iii) se le caratteristiche osservate di esposizione cumulativa nel tempo sono correlate a un particolare bioeffetto; e iv) se i livelli relativi e i comportamenti dipendenti dal tempo sono coerenti con gli esperimenti precedenti nel sistema di esposizione. Mentre la sensibilità di ricezione del PCD può essere quantificata, al fine di caratterizzare in modo affidabile le emissioni acustiche in termini di energia assoluta, sono necessarie ulteriori informazioni spaziali. Questo potrebbe essere ottenuto sostituendo il PCD con una sonda array per implementare la mappatura acustica passiva (PAM)80. Ciò aumenterebbe comunque la complessità dell'elaborazione del segnale e il tempo e la potenza computazionali richiesti.
Potrebbero essere incorporate anche altre strumentazioni per la misurazione della resistenza elettrica a membrana o l'applicazione di metodi di targeting fisico, ad esempio campi magnetici. Sarebbe anche possibile utilizzare strutture tissutali tridimensionali come sferoidi tumorali, organoidi o persino campioni di tessuto ex vivo su substrati di gel acusticamente "morbidi" al posto dei monostrati cellulari per studiare gli effetti mediati da US e cavitazione in ambienti tissutali più realistici.

Gli ultrasuoni (US) sono stati ampiamente utilizzati come tecnica di imaging diagnostico a causa della sua natura sicura e non invasiva, della sua facilità di implementazione al capezzale di un paziente e della sua economicità1. Accanto alle sue capacità diagnostiche e di monitoraggio, gli Stati Uniti hanno un notevole potenziale per le applicazioni terapeutiche. I primi lavori esplorarono il suo uso intrombolisi, La trasfezione del DNA e la somministrazione di farmaci2,3,4 e gli Stati Uniti terapeutici rappresentano ora un'area di ricerca molto attiva, con applicazioni tra cui il trattamento del tumore5,6,7, immunoterapia8,9,la barriera emato-encefalica (BBB) interruzione10,11,12,trombolisi13,14,15e trattamento delle infezioni batteriche16,17. Un fenomeno chiave alla base di queste applicazioni è la cavitazione: la nucleazione, la crescita e l'oscillazione delle cavità gassose a causa dei cambiamenti nella pressionedel fluido 18,19.
Esiste una serie di meccanismi attraverso i quali la cavitazione produce effetti biologici. Ad esempio, la natura altamente non lineare delle oscillazioni delle bolle sotto l'influenza di un campo statunitense applicato può generare microstreaming nel liquido circostante che può sia migliorare la convezionedel farmaco 20 che esercitare sollecitazioni di taglio sul tessuto in prossimità delle bolle. Ciò è particolarmente diffuso quando le bolle si trovano in prossimità di un confine, causando bolle che oscillano non sfericamente, e possono potenzialmente promuovere l'assorbimento di farmaci attraverso la permeabilizzazione indotta da taglio21,22,23,24. A pressioni più elevate, si osservano oscillazioni di ampiezza maggiori e rapido collasso della bolla, che impartiscono sollecitazionimeccaniche dirette 25 e generano frequentemente onde d'urto, e conseguenti grandi gradienti di pressione che possono interrompere e permeabilizzare itessuti 26,27. Il collasso delle bolle vicino a una superficie può anche portare alla formazione di microjet liquidi ad alta velocità28,29,30. Questi microjet possono penetrare nei tessuti, creando potenzialmente pori o inducendo onde di stresssecondarie 31,32. La permeabilizzazione delle membrane biologiche sia a livello tissutale che cellulare è variamente indicata come sonoforesi, utilizzata principalmente nel contesto del miglioramento indotto dagli Stati Uniti nella permeabilità cutanea33,34,e sonoporazione, utilizzata principalmente per descrivere la permeabilizzazione reversibile della membrana cellulare dovuta alla formazione di pori di membrana35,36.
L'assorbimento viscoso nel liquido immediatamente circostante la bolla oscillante può produrre un sostanziale effettoriscaldante 37. Inoltre, le oscillazioni altamente non lineari producono radiazioni acustiche a frequenze superiori al campo guida degli Stati Uniti. Ciò porta ad un maggiore assorbimento nel tessuto circostante e ad un ulterioreriscaldamento 38. Il collasso della bolla può anche essere accompagnato da effetti chimici dovuti alle alte temperature e pressioni transitori nel nucleo della bolla, come la generazione di specie altamente reattive e la radiazione elettromagnetica, nota come sonoluminescenza32. Questi effetti sono stati studiati per valutare potenziali danni e/o attivazione di percorsi cellulari rilevanti per il parto39 e sfruttati nell'attivazione locale di farmaci sensibili alla luce in un approccio noto come terapia sonodinamica40,41,42,43.
Molti bioeffati mediati negli Stati Uniti possono essere avviati esclusivamente attraverso il controllo dei parametri di campo degli Stati Uniti (ampiezza della pressione, frequenza, lunghezza dell'impulso e frequenza di ripetizione e durata dell'esposizione), ma generare in modo affidabile cavitazione nel tessuto biologico richiede spesso elevate energie di input e quindi comporta un elevato rischio di danni. L'introduzione di nuclei di cavitazione esogeni o artificiali può ridurre sostanzialmente l'energia di input necessaria per produrre l'ampia gamma di effetti sopra discussi e introduce ulteriori effetti che potrebbero non essere possibili solo con gli Stati Uniti. I nuclei di cavitazione includono bolle di gas26,44,goccioline liquide45,46,47 e particelle solide48,49,50, con nuclei di cavitazione su scala nanometrica che sono un'area emergente di indagine per i loro benefici in termini di tempo di circolazione prolungato, migliore estravasazione e attività di cavitazioneprolungata 49,51,52,53.
I nuclei più comunemente usati sono le microbolle a gas (MB), originariamente utilizzate come agenti di contrasto nell'imaging diagnostico. Sono tipicamente di 1-2 micrometri di diametro e contengono un nucleo di un gas ad alto peso molecolare con bassa solubilità acquosa nel mezzo circostante. Il nucleo è circondato da un guscio protettivo di lipidi, proteine o polimeri più comunemente costituito da fosfolipidi54. Quando esposti a un campo statunitense, la comprimibilità degli MB li fa subire oscillazioni volumetriche, producendo di conseguenza una forte dispersione acustica, che è responsabile del successo delle MB come agente di contrasto. Come accennato, queste oscillazioni portano anche ai suddetti effetti meccanici, termici e chimici che possono essere sfruttati in applicazioni terapeutiche. Il processo di rivestimento MB offre anche un meccanismo per incapsulare i farmaci all'interno della struttura MB e per attaccare farmaci e / o indirizzare le specie alla superficie MB. Questa tecnica facilita il rilascio innescato di farmaci per ridurre la tossicità sistemica55. Recentemente è stato anche dimostrato che il materiale proveniente dalla superficie MB può essere trasferito in strutture biologiche, migliorando la somministrazione di farmaci attraverso la cosiddetta "sonoprinting"56,57,58.
Il monitoraggio dell'attività di cavitazione mediata negli Stati Uniti può fornire approfondimenti sugli effetti biologici risultanti sia in vitro che in vivo e potenzialmente consente la messa a punto e l'ottimizzazione di questi effetti. I due metodi più applicati per il monitoraggio dell'attività di cavitazione sono i) ottici, che utilizzano la microscopia video ad altissima velocità e non sono generalmente realizzabili invivo; e ii) acustici, che registrano i campi sonori ri-irradiati prodotti da bolle oscillanti e/o collassi. Sia l'ampiezza che la frequenza del segnale acustico contengono informazioni sul comportamento della bolla. Basse concentrazioni di bolle a basse ampiezze degli Stati Uniti incidenti hanno dimostrato di produrre emissioni prevalentemente armoniche (multipli interi della frequenza di guida)59. Con l'aumentare delle pressioni di guida, lo spettro di emissione delle bolle può anche contenere componenti frazionari noti come sottoarmonici e ultraarmonici60 che indicano un comportamento non lineare più forte, così come il rumore a banda larga, che è indicativo della cavitazione inerziale. Le armoniche intere sono un indicatore primario dell'oscillazione della bolla, ma possono anche essere causate da non linearità in qualsiasi punto di un sistema sperimentale, ad esempio, a causa della propagazione non lineare. Al contrario, le armoniche frazionarie e il rumore a banda larga sono fortemente correlati con la dinamica delle bolle.
La relazione tra il comportamento della bolla e le emissioni acustiche rilevate può essere complicata da fattori tra cui il campo statunitense incidente, l'ambiente di nucleazione e le caratteristiche dellavia di rilevamento 60. Tuttavia, importanti informazioni sul comportamento delle bolle e sulle loro interazioni con le cellule possono essere ottenute discernendo le tendenze di frequenza ed energia nello spettro acustico. Questi dati possono anche fornire informazioni preziose che possono essere utilizzate per costituire la base per le tecniche di monitoraggio del trattamento clinico. Per sfruttare appieno queste informazioni, è necessario lo sviluppo di metodi sperimentali robusti, traducibili e riproducibili.
Attualmente vi sono sostanziali variazioni nei protocolli segnalati per la progettazione di sistemi e lo svolgimento di studi a supporto dello sviluppo di terapie assistite da cavitazione. Per quanto riguarda l'apparato, è stata intrapresa una serie di approcci progettuale. Diversi gruppi hanno fatto uso di camere a piastre parallele56,61,62,63,costruite su misura o disponibili in commercio (ad esempio, OptiCell, ThermoFisher Scientific). (2013) ha sviluppato una camera cellulare accoppiata con un modulo di sonicazione statunitense e imaging confocale intempo reale 64, Carugo et al. (2015) ha utilizzato un sistema che comprende un piatto di coltura cellulare disponibile in commercio con un coperchio PDMS su misura per consentire l'immersione in un bagnod'acqua durante l'esposizione statunitense65e Pereno et al. L'uso di design personalizzati e specifici dell'applicazione complica la caratterizzazione del campo statunitense e di altre condizioni di esposizione ambientale, rendendo impegnativi i confronti tra studi. Ad esempio, vi è una notevole variazione nei parametri usa identificati per ottenere una sonoporazione riuscita, che includono frequenze al centro che vanno da 0,02 a 15 MHz, cicli di servizio che variano dall'1% all'onda continua e pressioni rarefazionali che vanno da 0,1 a 20 MPa23,64,67,68,69,70 (Tabella 1). Allo stesso modo vi è una notevole variazione nelle componenti spettrali (armoniche, sottooniche, ecc.) che sono state identificate come associate a particolari bioeffati.
Lo scopo di questo lavoro è quindi quello di fornire un quadro di progettazione e implementazione del sistema facilmente riproducibile per lo studio in vitro dei bioeffati cellulari indotti dalla cavitazione con l'inclusione specifica di una capacità di monitoraggio della cavitazione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorber</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>APTFlex F28 panel</td>
			<td>1.0 cm standard thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (power)</td>
			<td>E&#38;I Ltd.</td>
			<td>1040L</td>
			<td>400W power amplifier to drive ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (pre)</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR445A</td>
			<td>Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium heater</td>
			<td>Aquael</td>
			<td>Ultra 50W</td>
			<td>Different models for different tank sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>TiePie Engineering</td>
			<td>HS5-110-XM</td>
			<td>Extended memory option: 32M points per channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>FOH</td>
			<td>0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>SonoVue</td>
			<td>FDA approved microbubbles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD mirror (SAT3)</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>F-102</td>
			<td>90 degree beam reflection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD transducer</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>V320-SU</td>
			<td>Immersion transducer, 7.5MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD waterproof cable</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>BCU-58-1 W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (SAT2 compartment lid)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer rod (SAT2 seal)</td>
			<td>Zeus</td>
			<td>PTFE monofilament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber plug (SAT3 lid/seal)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-2101</td>
			<td>6mm bottom dia., 8mm top dia., red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>33250</td>
			<td>Waveform generator for ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>&#181;-Dish 35mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT3</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Transwell 6.5mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound source (SAT3)</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>H107 with central hole</td>
			<td>Use of a HIFU-capable source allows pressures &#62;1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying cavitation enhanced therapy

L'interesse per le applicazioni terapeutiche degli ultrasuoni è significativo e in crescita, con potenziali obiettivi clinici che vanno dal cancro al morbo di Alzheimer. La cavitazione - la formazione e il successivo movimento delle bolle all'interno di un campo ad ultrasuoni - rappresenta un fenomeno chiave alla base di molti di questi trattamenti. Permangono, tuttavia, notevoli incertezze riguardo ai meccanismi dettagliati di azione attraverso i quali la cavitazione promuove gli effetti terapeutici ed è necessario sviluppare tecniche di monitoraggio affidabili che possano essere implementate clinicamente. In particolare, vi è una variazione significativa tra gli studi sui parametri di esposizione segnalati come efficaci per fornire effetti terapeutici e le corrispondenti emissioni acustiche. Lo scopo di questo documento è fornire linee guida di progettazione e un protocollo sperimentale utilizzando componenti ampiamente disponibili per l'esecuzione di studi sui bioeffati mediati dalla cavitazione e includere il monitoraggio acustico in tempo reale. Si spera che il protocollo consentirà un'incorporazione più diffusa del monitoraggio acustico negli esperimenti terapeutici ad ultrasuoni e faciliterà il confronto tra gli studi sulle condizioni di esposizione e la loro correlazione con i bioealiali pertinenti.

La figura 4 mostra esempi di risposte PCD del dominio del tempo e della frequenza, illustrando tre distinti comportamenti di cavitazione. Tutti i dati sono stati raccolti su SAT3 utilizzando MB SonoVue diluiti 5x in PBS, con una concentrazione finale di ~ 2 * 107 MB / ml. La temperatura per tutti gli esempi in questa sezione era di 19 ± 1 °C. La sorgente statunitense è stata guidata con un impulso di 2,0 ms a 0,5 MHz per ottenere pressioni negative di picco incidente di 0,20(Figure 4A e 4B),0,30(Figura 4C e 4D)e 0,70 MPa(figure 4E e 4F). Le registrazioni del segnale iniziarono 1,4 ms prima dell'inizio t = 0 dell'impulso statunitense. Le tracce di ingresso mostrano il segnale registrato (rosso) e con un filtro passa alto a 2 MHz (blu) per una finestra di tempo centrata al momento del volo dalla sorgente al compartimento di esposizione cellulare al PCD. La risposta di basso livello prima di questo tempo è dovuta alla radiazione ricevuta direttamente dalla sorgente, che è comune nelle configurazioni in cui il PCD è dietro la sorgente statunitense.
Alla pressione incidente più bassa, la risposta PCD consiste interamente di armoniche intere della frequenza fondamentale degli Stati Uniti di 0,5 MHz. Aumentando da 0,20 a 0,30 MPa si ottiene un'ultraarmonica pronunciata nello spettro oltre ad armoniche intere ulteriormente elevate. Le forme d'onda del dominio del tempo a queste due pressioni sembrano simili, anche se i risultati di 0,30 MPa mostrano una maggiore variabilità durante la durata dell'impulso. Alla pressione più alta, l'ampiezza della forma d'onda del dominio del tempo è cresciuta in modo non lineare rispetto alle pressioni più basse a causa del rumore a banda larga chiaramente elevato visibile nello spettro. Questo rumore è comunemente considerato come il risultato della cavitazione inerziale e in questo esempio corrisponde alla distruzione di MB.
Per vedere questo più chiaramente, le risposte PCD in funzione del tempo sono mostrate nella figura 5. Nel pannello sinistro (Figura 5A), gli spettri completi vengono visualizzati su un tempo di esposizione di 50 secondi, durante il quale la sorgente emette impulsi da 2,0 ms ogni 0,20 secondi. Le corrispondenti potenze totali, armoniche e a banda larga sono mostrate nel pannello di destra (Figura 5B). Gli Stati Uniti sono stati attivati a t =3,0 s, quando sono state viste risposte a banda larga di grande ampiezza. Si pensa che il picco iniziale corrisponda alla distruzione delle bolle più grandi della sospensione (SonoVue è polidisperso) ed è un'osservazione comune negli esperimenti di cavitazione con bolle sgusciate e persino con mezzi non degassati (ad esempio, PBS).
Dopo pochi secondi, la risposta a banda larga si sminuì rapidamente, apparentemente a causa della distruzione della bolla, e il segnale è composto prevalentemente da armoniche. Ciò suggerisce che il gas liberato e le MB rimanenti vibrano stabilmente e non inerzialmente. A t~50, il componente a banda larga è sceso al livello del rumore di fondo originale. Test di esposizione come questo sono quindi importanti quando si cerca di capire i tempi durante i quali diversi effetti bolla possono agire sulle cellule della camera.
È probabile che le bolle si traducano in risposta alle forze di radiazione generate durante l'esposizione statunitense e il movimento degli MB all'interno e all'esterno del campo visivo pcd può portare a una maggiore variabilità nel segnale di cavitazione monitorato, specialmente quando si tratta di sospensioni diluite. La regione sensibile della PCD dovrebbe quindi estendersi il più possibile sulla superficie di esposizione cellulare. Un confronto delle risposte focalizzate e non focalizzate pcd con frequenze centrato identiche (vedere la figura 2) è mostrato nella figura 6, utilizzando una diluizione 20:1 di MB nel NORMALE PBS è SAT2. Gli spettri medi del tempo e del campione nel pannello Figura 6A mostrano che il PCD non focalizzato contiene una risposta a banda larga più forte, accompagnata da una ridotta variabilità da campione a campione sia in potenze armoniche(figura 6B) che ultraarmoniche (Figura 6C).
È importante riconoscere che i supporti utilizzati per il lavoro cellulare in vitro non sono degassati e possono presentare un livello di fondo migliorato di attività della bolla. La figura 7 mostra la risposta in SAT2 di PBS utilizzato nella sua forma fornita dal fornitore e dopo due ore di degassamento sotto vuoto, dopo di che la saturazione dell'aria è stata ridotta dal 92% al 46% come determinato con un sensore ottico (PreSens, Germania). Gli spettri della figura 7A sono stati mediati nel tempo di esposizione e ripetuti con cinque campioni indipendenti, e mostrano chiaramente ultraarmonici chiaramente elevati nel normale PBS. Le potenze sommate su tre armoniche(Figura 7B)sono ben all'interno della deviazione standard di ogni uscita sperimentale. Al contrario, le somme ultraarmoniche della figura 7C mostrano che il PBS normale ha quasi un ordine di grandezza di livello superiore e una variabilità sostanzialmente più elevata tra i campioni. Questi esempi indicano che un comune supporto compatibile con le celle può presentare comportamenti che potrebbero essere (erroneamente) attribuiti alla presenza di MB. Poiché di solito è poco pratico degasare il mezzo di coltura a causa dell'impatto negativo sulle cellule e / o sulla stabilità dell'agente di cavitazione, è fondamentale eseguire controlli adatti in qualsiasi studio correlato alla cavitazione.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg"> Figura 1: Illustrazioni di due progetti di sistemi di esposizione statunitense che incorporano il monitoraggio della cavitazione: SAT3 (D-F). (A) Gruppo annotato SAT2 con parete laterale rimossa per chiarezza. (B) SAT2 con parete laterale intatta. (C) Compartimento di esposizione cellulare SAT2, smontato. (D) Assemblaggio annotato SAT3. (E) SAT3 in configurazioni normali (sinistra) e con lenti (destra) per la corrispondenza della larghezza del fascio a frequenze diverse. (F) Compartimento di esposizione alle celle SAT3, smontato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg"> Figura 2: Calcoli dei contorni del campo di pressione a mezza ampiezza per trasduttori non focalizzati (a sinistra) e sfericamente focalizzati (a destra). Le frequenze di 2, 4 e 8 MHz sono mostrate rispettivamente come contorni rossi, blu e verdi per un elemento PCD all'origine delle coordinate (0,0). I contorni più esterni del dispositivo non focalizzato sono relativamente insensibili alla frequenza, ma la struttura interna dipende dalla frequenza. Il campo sfericamente focalizzato si contrae all'aumentare della frequenza, ma all'interno dei contorni, i campi variano senza intoppi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg"> Figura 3: Strumentazione per il condizionamento e la registrazione del segnale di cavitazione (frecce blu), eccitazione della sorgente statunitense (linee rosse) e attivazione dell'acquisizione dei dati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg"> Figura 4: Risposte PCD di dominio di dominio tempo (sinistra) e frequenza (destra) registrate con MB diluiti 5x in PBS. Le pressioni negative di picco incidente sono state (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, il tutto a 0,5 MHz. Le registrazioni del segnale iniziano 1,4 ms prima dell'inizio t =0 dell'impulso ecografico di durata 2,0 ms. (A, C, E) I segnali del dominio del tempo (rosso) sono mostrati su una scala verticale fissa, indicando come cambia il livello di risposta con la pressione incidente. Le tracce di ingresso mostrano il segnale registrato (rosso) e con un filtro passa alto a 2 MHz (blu) per una finestra di tempo centrata al momento del volo dalla sorgente al compartimento di esposizione cellulare al PCD. (B, D, F) Le densità spettrali di rumore e potenza del segnale sono calcolate rispettivamente per t<0 e t>0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg"> Figura 5: Cronologie dello spettro su un'esposizione di 50 secondi di una sospensione di MB diluita 5 volte in PBS. (A) Spettri completi e (B) potenze totali, armoniche e a banda larga, il tutto in funzione del tempo. Le condizioni di azionamento erano 0,5 MHz, pressione negativa di picco di 0,7 MPa, durata dell'impulso di 2,0 ms, periodo di ripetizione dell'impulso di 200 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg"> Figura 6: Effetto della geometria di messa a fuoco PCD registrata con una diluizione 20:1 di microbolle nel normale PBS. Le condizioni di azionamento erano: 1,0 MHz, 0,50 MPa di pressione negativa di picco, durata dell'impulso di 3,0 ms, periodo di ripetizione dell'impulso di 10 ms. (A) Spettri completi medi sul tempo di esposizione e tre ripetizioni indipendenti del campione. (B) Potenza nelle armoniche a 3, 4 e 5 MHz e (C) di potenza in ultraarmonica a 2,5, 3,5 e 4,5 MHz. Le linee spesse sono mezzi campione, le aree ombreggiate indicano +/- 1 deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg"> Figura 7: Effetto dei supporti degassati registrati con PBS. (A) Spettri completi medi sul tempo di esposizione e cinque ripetizioni indipendenti del campione. (B) Potenza nelle armoniche a 3, 4 e 5 MHz e (C) di potenza in ultraarmonica a 2,5, 3,5 e 4,5 MHz. Le linee spesse sono mezzi campione, le aree ombreggiate indicano +/- 1 deviazione standard. Le condizioni di azionamento erano 1,0 MHz, 0,50 MPa di pressione negativa di picco, durata dell'impulso di 1,0 ms, periodo di ripetizione dell'impulso di 200 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>parametro</td>
			<td>unità</td>
			<td>minimo</td>
			<td>massimo</td>
		</tr>
<tr>
<td>frequenza</td>
			<td>megahertz</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>pressione (picco negativo)</td>
			<td>Mpa</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>lunghezza dell'impulso</td>
			<td>Cicli</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ciclo</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>tempo di esposizione</td>
			<td>di</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Sintesi della gamma di parametri segnalati che facilitano la sonoporazione in vitro.

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Studying Cavitation Enhanced Therapy

Il protocollo sperimentale presentato può essere utilizzato per eseguire misurazioni in tempo reale dell'attività di cavitazione in un dispositivo di coltura cellulare allo scopo di consentire lo studio delle condizioni richieste per il successo della somministrazione di farmaci e/o di altri bioeffati.

Studiare la terapia potenziata della cavitazione

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Questi principi di progettazione, raccolta e analisi dei sistemi da banco possono essere utilizzati come base razionale per lo studio in vitro delle terapie potenziate della cavitazione. Le nostre tecniche consentono test ad alta produttività preservando al contempo gli attributi sperimentali critici del monitoraggio della cavitazione a intervalli, dell'allineamento ripetibile del campione e della compatibilità con i comuni metodi di analisi cellulare. La terapia potenziata della cavitazione ha molteplici applicazioni potenziali, tra cui il trattamento di malattie come il cancro e l'ictus.Comprendendo meglio i meccanismi di base, possiamo sviluppare terapie migliori. Questo lavoro fornisce un framework di progettazione e implementazione del sistema facilmente riproducibile per consentire la ricerca di un'ampia varietà di effetti bio cellulari indotti dalla cavitazione. Compresa la somministrazione di farmaci, la sonoporazione e la sonostampa.Ottenere risultati significativi richiede la garanzia della riproducibilità e il controllo di tutte le variabili nell'esperimento. È imperativo eseguire tutti i controlli pertinenti e misurare il rumore elettrico. Per la preparazione dei sistemi per la trasfezione acustica, degasare il liquido di riempimento sotto una pressione di 100kPa per almeno due ore per ridurre al minimo la probabilità di cavitazione nel percorso di propagazione.Si raccomanda la conferma con una sonda di ossigeno disciolto che la pressione parziale dell'ossigeno è inferiore a 10kPa. Riempire lentamente la camera di prova per ridurre al minimo la re-introduzione dell'aria nel liquido degassato e cancellare immediatamente eventuali bolle residue dal trasduttore e dalle superfici medie del contenitore. Consentire all'amplificatore di potenza sorgente ad ultrasuoni di riscaldarsi secondo la raccomandazione del produttore in modo che il guadagno e l'uscita siano stabili rispetto al tempo.E diluire l'agente di cavitazione mescolando delicatamente e continuamente per fare una sospensione uniforme senza intrappolare bolle macro o distruggere l'agente. Quando si lavora con micro bolle, assicurarsi di gestirle con attenzione. Per la preparazione SAT2, prima di iniziare l'esperimento, utilizzare l'etanolo per sterilizzare il coperchio dei PDM.Premere il coperchio sterilizzato sul piatto di coltura per formare il vano cellulare e caricare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago smussato calibro 18 con 10 millilitri del liquido di riempimento. Inserire l'ago attraverso uno dei PDM riempire i fori e riempire lentamente la camera inclinando in modo che le bolle macro possano fuoriuscire attraverso il foro di riempimento aperto. Una volta riempita la camera, inserire un'asta polimerica da quattro a cinque millimetri nel foro aperto e posizionare l'assieme in modo che i fori siano orizzontali.Rimuovere l'ago durante l'iniezione di liquido extra in modo che l'aria non sia attratta nella camera e chiudere il foro di riempimento con un'altra asta polimerica. Controllare visivamente il compartimento per verificare la presenza di bolle macro intrappolate e premere inserire il compartimento di esposizione delle celle nel supporto del compartimento. Considera la galleggiabilità delle particelle in sospensione e come la loro galleggiabilità influenzerà il loro contatto con le cellule quando decidono l'orientamento del compartimento di esposizione cellulare.Quindi abbassando il coperchio della camera ad angolo orizzontale per scoraggiare le bolle macro dal poggiare sulle parti sommerse del dispositivo, installare il coperchio sulla parte superiore della camera. Prima di eseguire le misurazioni sperimentali, consentire alla sospensione di equilibrare termicamente con la temperatura della camera. Utilizzo di una termocopia ad ago fine per confermare che la temperatura nella camera si è stabilizzata.Per monitorare gli esperimenti in tempo reale, sia nei domini del tempo che in quello delle frequenze, avviare il processo di raccolta dei dati e attivare il segnale dell'unità sorgente ad ultrasuoni. Utilizzare una sonda ad alta tensione per monitorare il segnale di uscita dell'amplificatore che aziona la sorgente ultrasonica durante l'esperimento per garantire che l'esposizione proceda come previsto. E assicurarsi che l'oscilloscopio sia impostato per compensare l'attenuazione della sonda.Il monitoraggio del dominio del tempo del rilevatore di cavitazione passiva rivela se i segnali sono dimensionati in modo appropriato per le impostazioni della strumentazione corrente e se i segnali di cavitazione vengono visti prima del previsto. Il monitoraggio del dominio di frequenza consente l'analisi del tipo di comportamento della bolla e può essere utilizzato per regolare i livelli di azionamento in base alle esigenze per ottenere lo stimolo cellulare desiderato. In questa analisi, alla pressione incidente più bassa, la risposta passiva del rivelatore di cavitazione, consisteva interamente di armoniche intere della frequenza ultrasonica fondamentale di 0,5 MHz.L'aumento da 0,2 a 0,3 MPa ha portato a più armoniche pronunciate nello spettro oltre ad un'ulteriore armonica intera elevata. Le forme d'onda del dominio del tempo a queste due pressioni sembravano simili, anche se i risultati di 0,3 MPa dimostravano una maggiore variabilità per tutta la durata dell'impulso. Alla pressione più alta, l'ampiezza della forma d'onda del dominio del tempo crebbe non linearmente rispetto alle pressioni più basse a causa del rumore a banda larga chiaramente elevato, probabilmente a causa della cavitazione inerziale causata dalla distruzione di micro bolle.Qui, gli spettri completi vengono mostrati su un tempo di esposizione di 50 secondi durante il quale la sorgente emetteva impulsi di due millisecondi ogni 0,2 secondi. Come osservato in questo grafico, illustrando le corrispondenti potenze armoniche e a banda larga totali, sono state generate risposte a banda larga di grande ampiezza con il picco iniziale considerato correlato alla distruzione delle bolle più grandi. Dopo alcuni secondi, la risposta alla banda larga diminuisce rapidamente, apparentemente a causa della distruzione delle bolle.In questa analisi utilizzando una diluizione da 20 a 1 di micro bolle e PBS normale, il tempo e gli spettri medi del campione hanno mostrato che il rivelatore di cavitazione passiva non focalizzato conteneva una risposta a banda larga più forte rispetto al rilevatore di messa a fuoco. Accompagnato da un campione ridotto alla variabilità del campione sia nella potenze armonica che in quello ultra armonica. Gli effetti bio indotti dalla cavitazione possono essere valutati utilizzando tecniche come la microscopia a fluorescenza, la citometria a flusso o i test biologici.Ciò consente di instaurazione di una solida relazione tra l'attività di cavitazione e gli effetti biologici. Questa tecnica ci ha permesso di identificare meglio le relazioni tra il comportamento delle bolle e gli effetti biologici che hanno rivelato alcuni potenziali nuovi meccanismi alla base della cavitazione mediata dal consumo di farmaci.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Studiare Traiettorie cellulare Rolling Patterns Receptor asimmetrica

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Ricerca

Bioingegneria

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

L&#39;utilizzo di nanostrutture di cristallo plasmoniche e fotonici per Enhanced manipolazione micro e nanoparticelle

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Miscelatori per lo studio microfluidici Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Un dispositivo a microfluidi per lo studio più ceppi distinti

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Diagnosis of Neoplasia in Barrett&#8217;s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

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La diagnosi di neoplasia in esofago di Barrett con Vital-dye avanzata di imaging di fluorescenza

The ability to differentiate benign metaplasia in Barrett&#8217;s Esophagus (BE) from neoplasia in vivo remains difficult as both tissue types can be flat ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Sintesi di nanoparticelle d&#39;oro liposomi Integrated Photo-reattiva e la misurazione del loro microbolle cavitazione su impulso laser di eccitazione

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Sistema di terapia robotica Specchio per il recupero funzionale di emiplegici Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

Un sistema Microfluidic con Patterning superficie per indagare cavitazione Bubble (s) Interazione -cell e gli effetti biologici risultante nel livello di singola cellula

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...