Name: studying cavitation enhanced therapy
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Cavitation Enhanced Therapy at JoVE.com

Forfatterne takker Ingeniør- og fysikkforskningsrådet for å støtte dette arbeidet gjennom tilskudd EP/L024012/1. VB støttes også av Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) og Medical Research Council (MRC) (grant EP/L016052/1). VB og AV takker Clarendon Foundation for Post Graduate Scholarships. AV takker også Exeter College for et Santander-stipend. Forfatterne står i gjeld til James Fisk og David Salisbury for deres uvurderlige hjelp i produksjonen av apparatet. De anerkjenner også takknemlig bidragene fra Dr. Dario Carugo og Joshua Owen i utviklingen av tidligere prototype SATs.

Forfatterne har ingenting å avsløre.

De kritiske trinnene for akustisk måling ble innkapslet av Apfel i 198176 som "kjenn din væske, kjenn ditt lydfelt, vet når noe skjer." I forbindelse med denne protokollen omfatter disse svingerkalibrering og justering og vannforberedelses- og boblehåndteringstrinnene. For det første er det viktig at hydrofonen som brukes til å kalibrere kjøretransduseren og/eller PCD-en selv er nøyaktig kalibrert gjennom regelmessig ekstern service eller intern sammenligning med en referansestandard. På samme måte må responsen til både kjøretransduseren og PCD regelmessig karakteriseres for å se etter endringer i utgang og / eller tap av følsomhet. Hvis kjøreforholdene og mottaksfølsomheten til systemet er ukjente, vil det være umulig å utlede noen meningsfull sammenheng mellom eksponeringsforhold, bioeffekter og akustiske utslipp. Direkte relatert til dette må justeringen av transduserne til hverandre og prøvekammeret kontrolleres nøye for å sikre at eksponeringsforholdene i kammeret er som forventet og prøvetakingsvolumet for PCD tilsvarer interesseområdet. Som angitt kan temperatur- og gassinnholdet i suspendert medium påvirke de endelige resultatene betydelig, og konsistens er ekstremt viktig i denne forbindelse77,78. På samme måte krever preparatet, karakteriseringen og håndteringen av kavitasjonsmiddelfjæringen svært nøye for å sikre at forventet størrelsesfordeling og konsentrasjon av partikler er tilstede i prøven. For eksempel, hvis konsentrasjonen av bobler er for høy, vil det være effektiv skjerming av prøvevolumet fra det amerikanske hendelsesfeltet. MB-agenter er spesielt utsatt for ødeleggelse og koalescens, og ytterligere veiledning om deres håndtering finnes i Mulvana et. al. (2012)79.
Et svært vanlig problem med påvisning av kavitasjonssignaler er å oppnå en tilstrekkelig SNR. Dette skyldes delvis selve signalets natur, som beskrevet, men kan også skyldes kilder til elektrisk støy i det eksperimentelle oppsettet. Kontroll av forbindelsene mellom systemkomponenter, spesielt de som involverer koaksialkabler, kan bidra til å eliminere noen av disse. Det kan være nødvendig å bytte ut eller reparere koaksialkabler. Det kan også hjelpe å identifisere og fjerne eller deaktivere annet utstyr i laboratoriet, for eksempel pumper som kan forårsake elektrisk støy. Dårlig elektrisk impedanssamsvar mellom systemkomponenter kan være en ytterligere årsak til dårlig signal-til-støy-forhold og også potensielt skade på utstyr og bør kontrolleres nøye. Utløserinnstillingene på signalgeneratoren og oscilloskopet bør på samme måte kontrolleres for å bekrefte at de er konfigurert riktig for eksperimentet og ikke har gått tilbake til produsentens standardinnstillinger. Hvis det er betydelig ødeleggelse av bobler under håndtering, i tilfelle SAT2, kan det være nyttig å feste en ny sprøyte til utløpsporten og bruke denne til forsiktig å trekke ut væske fra kammeret, og dermed trekke inn suspensjonen. Dette kan også bidra til å eliminere makrobobler eller aktivere flyt under amerikansk eksponering, hvis ønskelig.
Det er ikke mulig å fullstendig eliminere akustiske refleksjoner i prøvekammeret, og dermed vil hendelsesfeltet ikke være helt ensartet over hele prøvevolumet. Som nevnt i trinn 1.3.2 og 1.3.3, vil overførbarheten av akustiske vinduer være frekvensavhengig, og dermed bør ønsket båndbredde for akustiske utslippsmålinger vurderes nøye. Spesielt kan det være betydelige refleksjoner av komponenter med høyere frekvens. Dette er en annen grunn til at kalibrering av feltet i det fullt monterte systemet er så viktig for å minimere usikkerheten i hendelsespresset. Passende gating av de registrerte signalene bør også vurderes for å minimere effekten av flere refleksjoner. Bruk av kommersielle enheter for enkelhets skyld og behovet for akustisk transparens betyr at noe optisk gjennomsiktighet må ofres. Dette kan påvirke kvaliteten på etterfølgende avbildning, for eksempel for å vurdere celle levedyktighet eller legemiddelopptak. Noen av membranene som brukes i kommersielle enheter er også porøse, og dermed oppstår ufullkommen isolasjon mellom prøvekammeret og det omkringliggende vannbadet. Som ovenfor kan den tilsvarende risikoen for forurensning reduseres ved å bruke et mindre underkammer, hvis innhold regelmessig kan erstattes. Cellekulturenhetene som er angitt i materialtabellen, er først og fremst egnet for cellemonolayere som kanskje ikke er representative for vev når det gjelder alle amerikanske / kavitasjonsmediert bioeffekter. Nærheten til cellene til en solid overflate vil også påvirke MB-dynamikken på en måte som kanskje ikke reflekterer forholdene i vivo, for eksempel å fremme mikrostreaming og mikrojetting som beskrevet i introduksjonen. Disse begrensningene kan imidlertid løses gjennom en enkel erstatning av alternative vevsmodeller.
Målet med å foreslå SAT-ene er å gi et middel til å forbedre reproduserbarheten av akustiske eksponeringsforhold og akustiske utslipp mellom studier av usa-medierte bioeffekter, og dermed forhåpentligvis legge til rette for bedre forståelse av de underliggende mekanismene og utviklingen av behandlingsovervåkingsteknikker for å forbedre sikkerhet og effekt. Systemene er designet for å være kompatible med kommersielt tilgjengelige cellekulturenheter, slik at et bredt spekter av biologiske analyser kan utføres i henhold til anvendelsen av interesse og muliggjøre ytelsen til eksperimenter med høy gjennomstrømning, og fjerner behovet for tidkrevende justeringsprosedyrer mellom kjøringer. Ved å standardisere protokoller for karakterisering av eksponeringsforhold og fangst av akustiske utslipp, kan systemavhengig variasjon forhåpentligvis reduseres. Utvalget av parametere som bør utforskes for et bestemt eksperiment, vil avhenge av applikasjonen (ønsket bioeffekt, celletype, dybde av målvev hvis in vivo etc.) og arten av et kavitasjonsmiddel som brukes. Gitt det store antallet variabler (amerikansk frekvens, trykkamplitude, pulslengde, pulsrepetisjonsfrekvens etc.) er det lite sannsynlig at det er praktisk å utforske hele parameterområdet. En fordel med den foreslåtte protokollen er at den gjør det mulig å opprette noen grenser på dette parameterområdet raskt. For eksempel muliggjør det bestemmelse av minimumstrykket der et kavitasjonssignal genereres, maksimalt trykk eller pulslengde som kan brukes før celleavløsning / død oppstår, og trykket der fraksjonell harmonikk eller bredbåndsstøy produseres. Det anbefales at et slikt sett med scoping-målinger utføres som et første trinn i en studie.
Som presentert er SAT-ene designet for sanntidsovervåking av akustiske utslipp, med biologiske analyser utført utenfor eksperimentet. Det ville imidlertid være relativt enkelt å modifisere SAT for å muliggjøre direkte optisk observasjon av prøvekammeret via et mikroskopmål. Dette kan igjen kobles til et fluorescens- og/eller høyhastighetsmikroskopisystem for å muliggjøre observasjon av for eksempel legemiddelopptak og bobledynamikk. PCD-utgangen som for tiden presenteres når det gjelder spenning indikerer: i) typer kavitasjonsadferd og deres relative proporsjoner; ii) hvor lenge disse kavitasjonsatferdene vedvarer; iii) om de observerte tids kumulative eksponeringsegenskapene er korrelert med en bestemt bioeffekt; og iv) om de relative nivåene og tidsavhengig atferd er i samsvar med tidligere eksperimenter i eksponeringssystemet. Selv om PCDs mottaksfølsomhet kan kvantifiseres, er det nødvendig med ytterligere romlig informasjon for å på en pålitelig måte karakterisere de akustiske utslippene når det gjelder absolutt energi. Dette kan oppnås ved å erstatte PCD med en array-sonde for å implementere passiv akustisk kartlegging (PAM)80. Dette vil imidlertid øke kompleksiteten i signalbehandling og beregningstiden og kraften som kreves.
Annen instrumentering for måling av membran elektrisk motstand eller anvendelse av fysiske målrettingsmetoder, for eksempel magnetiske felt, kan også innlemmes. Det ville også være mulig å bruke tredimensjonale vevsstrukturer som tumorsfæroider, organoider eller til og med ex vivo vevsprøver på akustisk "myke" gelunderlag i stedet for cellemonolayers for å studere amerikanske og kavitasjonsmedierte effekter i mer realistiske vevsmiljøer.

Ultralyd (USA) har blitt brukt mye som en diagnostisk bildeteknikk på grunn av sin trygge og ikke-invasive natur, dens enkle implementering ved pasientens seng, og dens kostnadseffektivitet1. Ved siden av sine diagnostiske og overvåkingsevner har USA et betydelig potensial for terapeutiske anvendelser. Tidlig arbeid utforsket bruken i trombolyse, DNA-transfeksjon, og legemiddellevering2,3,4 og terapeutiske USA representerer nå et svært aktivt forskningsområde, med anvendelser som tumorbehandling5,6,7, immunterapi8,9, blod-hjernebarriere (BBB)forstyrrelse 10,11,12, trombolyse13,14,15og bakteriell infeksjonsbehandling16,17. Et viktig fenomen som underbygger disse applikasjonene er kavitasjon: kjernedannelse, vekst og oscillasjon av gassformige hulrom på grunn av endringer i væsketrykk18,19.
Det er en rekke mekanismer der kavitasjon gir biologiske effekter. For eksempel kan den svært ikke-lineære naturen av bobleoscillasjoner under påvirkning av et anvendt amerikansk felt generere mikrostreaming i den omkringliggende væsken som både kan forbedre legemiddelkonveksjon20 og utøve skjærspenninger på vevet i nærheten av boblene. Dette er spesielt utbredt når bobler er i nærheten av en grense, noe som får bobler til å svinge ikke-sfærisk, og kan potensielt fremme narkotikaopptak gjennom skjærindusert permeabilisering21,22,23,24. Ved høyere trykk observeres større amplitudeoscillasjoner og rask boblekollaps, gir direkte mekanisk stress25 og genererer ofte sjokkbølger, og følgelig store trykkgradienter som kan forstyrre og permeabilisere vev26,27. Sammenbruddet av bobler nær en overflate kan også resultere i dannelse av flytende mikrojets med høy hastighet28,29,30. Disse mikrojetene kan trenge inn i vev, potensielt skape porer eller indusere sekundære stressbølger31,32. Permeabiliseringen av biologiske membraner på både vevs- og cellulære nivåer er forskjellig referert til som sonophoresis, som hovedsakelig brukes i sammenheng med USA-indusert forbedring i hudens permeabilitet33,34og sonoporasjon, som hovedsakelig brukes til å beskrive reversibel permeabilisering av cellulær membran på grunn av dannelse av membranporer35,36.
Viskøs absorpsjon i væsken som umiddelbart omgir den oscillerende boblen, kan gi en betydelig oppvarmingseffekt37. Videre produserer de svært ikke-lineære svingningene akustisk stråling ved frekvenser høyere enn det drivende amerikanske feltet. Dette fører til økt absorpsjon i det omkringliggende vevet og videre oppvarming38. Boblekollaps kan også ledsages av kjemiske effekter på grunn av de forbigående høye temperaturene og trykket i boblekjernen, for eksempel generering av svært reaktive arter og elektromagnetisk stråling, kjent som sonoluminescens32. Disse effektene har blitt undersøkt for å vurdere potensiell skade og/ eller aktivering av relevante cellulære veier for levering39 og utnyttet i lokal aktivering av lysfølsomme legemidler i en tilnærming kjent som sonodynamisk terapi40,41,42,43.
Mange usa-medierte bioeffekter kan initieres utelukkende gjennom kontroll av amerikanske feltparametere (trykkamplitude, frekvens, pulslengde og repetisjonsfrekvens og varighet av eksponering), men pålitelig generering av kavitasjon i biologisk vev krever ofte høy inngangsenergi og har dermed en forhøyet risiko for skade. Innføring av eksogene eller kunstige kavitasjonskjerner kan redusere inngangsenergien som kreves for å produsere det brede spekteret av effekter som er diskutert ovenfor, og introduserer ytterligere effekter som kanskje ikke er mulig med USA alene. Kavitasjonskjerner inkluderer gassbobler26,44, flytende dråper45,46,47 og faste partikler48,49,50, med nanoskala kavitasjonskjerner som et fremvoksende undersøkelsesområde for deres fordeler når det gjelder langvarig sirkulasjonstid, forbedret ekstravasasjon og langvarig kavitasjonsaktivitet49,51,52,53.
De mest brukte kjernene er gassmikrobobler (MB), opprinnelig brukt som kontrastmidler i diagnostisk avbildning. De er vanligvis 1-2 mikrometer i diameter og inneholder en kjerne av en høymolekylær gass med lav vandig løselighet i det omkringliggende mediet. Kjernen er omgitt av en beskyttende lipid, protein eller polymerskall som oftest består av fosfolipider54. Når de blir eksponert for et amerikansk felt, fører komprimerbarheten til MB-ene dem til å gjennomgå volumetriske svingninger, og produserer derfor sterk akustisk spredning, som er ansvarlig for suksessen til MB som kontrastmiddel. Som nevnt fører disse svingningene også til de nevnte mekaniske, termiske og kjemiske effektene som kan utnyttes i terapeutiske applikasjoner. MB-beleggprosessen tilbyr også en mekanisme for å innkapsle legemidler i MB-strukturen og for å feste narkotika og / eller målrette arter til MB-overflaten. Denne teknikken letter utløst frigjøring av legemidler for å redusere systemisk toksisitet55. Det har også nylig blitt vist at materiale fra MB-overflaten kan overføres til biologiske strukturer, noe som forbedrer legemiddelleveransen gjennom såkalt "sonoprinting"56,57,58.
Overvåking av USA-mediert kavitasjonsaktivitet kan gi innsikt i de resulterende biologiske effektene både in vitro og in vivo og potensielt muliggjør tuning og optimalisering av disse effektene. De to mest brukte metodene for overvåking av kavitasjonsaktivitet er i) optiske, som bruker ultra-høyhastighets videomikroskopi og generelt ikke er gjennomførbare in vivo; og ii) akustiske, som registrerer de restrålede lydfeltene produsert av oscillerende og / eller kollapsende bobler. Både amplitud- og frekvenskomponentene i det akustiske signalet inneholder informasjon om bobleadferd. Lave konsentrasjoner av bobler ved lav hendelse amerikanske amplituder har vist seg å produsere overveiende harmoniske utslipp (heltall multipler av kjørefrekvensen)59. Etter hvert som drivtrykket øker, kan bobleutslippsspekteret også inneholde brøkdelskomponenter kjent som subharmonikk og ultraharmonikk60 som indikerer sterkere ikke-lineær oppførsel, samt bredbåndsstøy, noe som indikerer inertial kavitasjon. Heltallsharmonier er en primærindikator for bobleoscillasjon, men kan også skyldes ikke-lineariteter hvor som helst i et eksperimentelt system, for eksempel på grunn av ikke-lineær forplantning. Til sammenligning er brøkdelsharmonier og bredbåndsstøy svært sterkt korrelert med bobledynamikk.
Forholdet mellom bobleadferd og de oppdagede akustiske utslippene kan være komplisert av faktorer som hendelsen amerikansk felt, nukleasjonsmiljøet og egenskapene til deteksjonsveien60. Likevel kan viktig informasjon om bobleatferd og deres interaksjoner med celler oppnås ved å skjelne trender i frekvens og energi i det akustiske spekteret. Disse dataene kan også gi verdifull informasjon som kan brukes til å danne grunnlaget for overvåkingsteknikker for klinisk behandling. For å utnytte denne informasjonen fullt ut, er det nødvendig med utvikling av robuste, overførbare og reproduserbare eksperimentelle metoder.
For tiden er det stor variasjon i rapporterte protokoller for design av systemer og gjennomføring av studier for å støtte utvikling av kavitasjonsassisterte terapier. Når det gjelder apparatet, har det blitt gjennomført en rekke designtilnærminger. Flere grupper har benyttet seg av parallellplatekamre56,61,62,63, enten spesialbygd eller kommersielt tilgjengelig (f.eks. Hu et al. (2013) utviklet et cellekammer kombinert med en amerikansk sonikeringsmodul og sanntids konfokal bildebehandling64, Carugo et al. (2015) brukte et system som består av en kommersielt tilgjengelig cellekulturrett med et skreddersydd PDMS-lokk for å tillate nedsenking i et vannbad under amerikansk eksponering65, og Pereno et al. (2018) brukte en enhet som består av lagdelte acoustofluidic resonatorer som tillater samtidig optisk og akustisk karakterisering av bobledynamikk og boblecelleinteraksjoner66. Bruken av spesialfabrikerte og applikasjonsspesifikke design kompliserer karakterisering av det amerikanske feltet og andre miljøeksponeringsforhold, noe som gjør sammenligninger på tvers av studier utfordrende. For eksempel er det betydelig variasjon i de amerikanske parametrene identifisert for å oppnå vellykket sonoporasjon, som inkluderer senterfrekvenser fra 0,02 til 15 MHz, driftssykluser som varierer fra 1% til kontinuerlig bølge, og sjeldnefactionaltrykk fra 0,1 til 20 MPa23,64,67,68,69,70 ( Tabell1). Det er tilsvarende stor variasjon i spektralkomponentene (harmonikk, sub-harmonikk etc.) som er identifisert som forbundet med bestemte bioeffekter.
Målet med dette arbeidet er derfor å gi et lett reproduserbart systemdesign og implementeringsrammeverk for in vitro-studie av kavitasjonsinduserte cellulære bioeffekter med spesifikk inkludering av en kavitasjonsovervåkingsevne.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorber</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>APTFlex F28 panel</td>
			<td>1.0 cm standard thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (power)</td>
			<td>E&#38;I Ltd.</td>
			<td>1040L</td>
			<td>400W power amplifier to drive ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (pre)</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR445A</td>
			<td>Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium heater</td>
			<td>Aquael</td>
			<td>Ultra 50W</td>
			<td>Different models for different tank sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>TiePie Engineering</td>
			<td>HS5-110-XM</td>
			<td>Extended memory option: 32M points per channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>FOH</td>
			<td>0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>SonoVue</td>
			<td>FDA approved microbubbles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD mirror (SAT3)</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>F-102</td>
			<td>90 degree beam reflection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD transducer</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>V320-SU</td>
			<td>Immersion transducer, 7.5MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD waterproof cable</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>BCU-58-1 W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (SAT2 compartment lid)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer rod (SAT2 seal)</td>
			<td>Zeus</td>
			<td>PTFE monofilament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber plug (SAT3 lid/seal)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-2101</td>
			<td>6mm bottom dia., 8mm top dia., red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>33250</td>
			<td>Waveform generator for ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>&#181;-Dish 35mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT3</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Transwell 6.5mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound source (SAT3)</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>H107 with central hole</td>
			<td>Use of a HIFU-capable source allows pressures &#62;1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying cavitation enhanced therapy

Interessen for terapeutiske anvendelser av ultralyd er betydelig og økende, med potensielle kliniske mål som spenner fra kreft til Alzheimers sykdom. Kavitasjon - dannelsen og påfølgende bevegelse av bobler innenfor et ultralydfelt - representerer et nøkkelfenomen som underbygger mange av disse behandlingene. Det er imidlertid fortsatt stor usikkerhet om de detaljerte virkningsmekanismene som kavitasjon fremmer terapeutiske effekter ved, og det er behov for å utvikle pålitelige overvåkingsteknikker som kan implementeres klinisk. Spesielt er det signifikant variasjon mellom studier i eksponeringsparametrene som rapporteres å gi terapeutiske effekter og tilsvarende akustiske utslipp. Målet med dette dokumentet er å gi designretningslinjer og en eksperimentell protokoll ved hjelp av allment tilgjengelige komponenter for å utføre studier av kavitasjonsmediert bioeffekter, og inkluderer akustisk overvåking i sanntid. Det er håpet at protokollen vil muliggjøre mer utbredt inkorporering av akustisk overvåking i terapeutiske ultralydforsøk og legge til rette for enklere sammenligning på tvers av studier av eksponeringsforhold og deres sammenheng med relevante bioeffekter.

Figur 4 viser eksempler på PCD-svar for tids- og frekvensdomene, som illustrerer tre distinkte kavitasjonsatferd. Alle data ble samlet inn på SAT3 ved hjelp av SonoVue MB fortynnet 5x i PBS, med en endelig konsentrasjon på ~ 2 * 107 MB / ml. Temperaturen for alle eksemplene i denne delen var 19 ± 1 °C. Den amerikanske kilden ble drevet med en puls på 2,0 ms ved 0,5 MHz for å oppnå en topp negativt trykk på 0,20 (figur 4A og 4B), 0,30 (figur 4C og 4D) og 0,70 MPa (figur 4E og 4F). Signalopptakene begynte 1,4 ms før t = 0 starten av den amerikanske pulsen. Innsett-sporene viser signalet som registrert (rødt) og med et 2 MHz høypassfilter (blått) for et tidsvindu sentrert på tidspunktet for flyturen fra kilde til celleeksponeringsrom til PCD. Lavnivåresponsen før denne tiden skyldes direkte mottatt stråling fra kilden, noe som er vanlig i konfigurasjoner der PCD er bak den amerikanske kilden.
Ved det laveste hendelsestrykket består PCD-responsen utelukkende av heltallsharmonier av den grunnleggende amerikanske frekvensen på 0,5 MHz. Økning fra 0,20 til 0,30 MPa resulterer i uttalt ultraharmonikk i spekteret i tillegg til ytterligere forhøyet heltallsharmoni. Tidsdomenebølgeformene ved disse to trykkene ser like ut, selv om 0,30 MPa-resultatene viser mer variasjon i løpet av pulsvarigheten. Ved høyeste trykk har tidsdomenbølgeformamplituden vokst ikke-lineært i forhold til lavere trykk som følge av tydelig forhøyet bredbåndsstøy som er synlig i spekteret. Denne støyen anses ofte å være et resultat av inertiell kavitasjon, og i dette eksemplet tilsvarer ødeleggelse av MBs.
Hvis du vil se dette tydeligere, vises PCD-svar som en tidsfunksjon i figur 5. I venstre panel (figur 5A) vises hele spektra over en 50 sekunders eksponeringstid, der kilden sendte ut 2,0 ms pulser hvert 0,20 sekund. Tilsvarende total-, harmoniske og bredbåndskrefter vises i panelet til høyre (Figur 5B). USA ble slått på på t = 3 .0 s, da ble det sett store amplitude bredbåndsresponser. Den første piggen antas å tilsvare ødeleggelsen av de største boblene i suspensjonen (SonoVue er polydisperse) og er en vanlig observasjon i kavitasjonsforsøk med skallede bobler og til og med med ikke-avgassede medier (f.eks. PBS).
Etter noen sekunder ble bredbåndsresponsen raskt redusert, tilsynelatende på grunn av bobleødeleggelse, og signalet består hovedsakelig av harmonikk. Dette antyder at frigjort gass og gjenværende MB vibrerer stabilt og ikke-inertialt. På t ~ 50s har bredbåndskomponenten falt til nivået av den opprinnelige bakgrunnsstøyen. Eksponeringstester som dette er derfor viktige når du prøver å forstå tidsskalaene der forskjellige bobleeffekter kan virke på cellene i kammeret.
Bobler vil sannsynligvis oversette som svar på strålingskrefter generert under amerikansk eksponering og bevegelse av MB inn og ut av PCD-synsfeltet kan føre til økt variasjon i det overvåkede kavitasjonssignalet, spesielt når det gjelder fortynnede suspensjoner. Den følsomme regionen til PCD bør derfor strekke seg over så mye av celleeksponeringsoverflaten som mulig. En sammenligning av svarene fokuserte og ufokuserte PCD-er med identiske senterfrekvenser (se figur 2) vises i figur 6, ved hjelp av en 20:1-fortynning av MB i normal PBS er SAT2. Tids- og prøvegjennomsnittet i panel figur 6A viser at den ufokuserte PCD-en inneholder en sterkere bredbåndsrespons, ledsaget av redusert variasjon fra prøve til prøve i både harmoniske (figur 6B) og ultraharmoniske krefter (figur 6C).
Det er viktig å erkjenne at medier som brukes til in vitro-cellearbeid ikke blir avgasset og kan presentere et forbedret bakgrunnsnivå for bobleaktivitet. Figur 7 viser responsen i SAT2 av PBS som brukes i leverandørformen og etter to timer med avgassing under vakuum, hvoretter luftmetningen ble redusert fra 92% til 46% som bestemt med en optisk sensor (PreSens, Tyskland). Spektra i figur 7A ble gjennomsnittet over eksponeringstid og repetisjoner med fem uavhengige prøver, og viser tydelig tydelig forhøyet ultraharmoni i normal PBS. Krefter oppsummert over tre harmonikk (Figur 7B) er godt innenfor standardavviket for hver eksperimentelle utgang. Til sammenligning viser de ultraharmoniske summene i figur 7C at normal PBS har nesten en størrelsesorden høyere nivå og vesentlig høyere variasjon mellom prøver. Disse eksemplene indikerer at et vanlig cellekompatibelt medium kan oppføre seg som kan være (feil) tilskrevet tilstedeværelsen av MB. Siden det vanligvis er upraktisk å degas kulturmedium på grunn av den negative effekten på celler og / eller kavitasjonsmiddelstabilitet, er det viktig å utføre egnede kontroller i enhver kavitasjonsrelatert studie.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg"> Figur 1: Illustrasjoner av to design av det amerikanske eksponeringssystemet som omfatter kavitasjonsovervåking: SAT3 (D-F). (A) SAT2-kommentert montering med sidevegg fjernet for klarhet. (B) SAT2 med sideveggen intakt. (C) SAT2 celleeksponeringsrom, demontert. (D) SAT3-merknadsenhet. (E) SAT3 i normale (venstre) og objektiverte (høyre) konfigurasjoner for strålebredde som samsvarer med forskjellige frekvenser. (F) SAT3 celleeksponeringsrom, demontert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg"> Figur 2: Beregninger av halvamplitudetrykkfeltkonturer for 12,7 mm diameter ufokusert (venstre) og sfærisk fokuserte (høyre) transdusere. Frekvenser på henholdsvis 2, 4 og 8 MHz vises som røde, blå og grønne konturer for et PCD-element ved koordinatopprinnelsen (0,0). De ytterste konturene av den ufokuserte enheten er relativt ufølsomme for frekvens, men den indre strukturen er frekvensavhengig. Det sfærisk fokuserte feltet trekker seg sammen etter hvert som frekvensen øker, men inne i konturene varierer feltene jevnt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg"> Figur 3: Instrumentering for kavitasjonssignalkondisjonering og opptak (blå piler), amerikansk kildeeksitasjon (røde linjer) og datainnhenting som utløses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg"> Figur 4: Tids- (venstre) og frekvens (høyre) domene-PCD-svar registrert med MBs fortynnet 5x i PBS. Hendelsen topp negativt trykk var (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, alle på 0,5 MHz. Signalopptak begynner 1,4 ms før t = 0 starten av 2,0 ms varighet ultralydpuls. (A, C, E) Tidsdomenesignaler (røde) vises på en fast vertikal skala, noe som indikerer hvordan responsnivået endres med hendelsestrykk. Innsett-sporene viser signalet som registrert (rødt) og med et 2 MHz høypassfilter (blått) for et tidsvindu sentrert på tidspunktet for flyturen fra kilde til celleeksponeringsrom til PCD. (B, D, F) Støy- og signalkrafttetthet beregnes for henholdsvis t<0 og t>0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg"> Figur 5: Spektrumhistorier over en 50 sekunders eksponering av en suspensjon av MB fortynnet 5x i PBS. (A) Full spektra og (B) totale, harmoniske og bredbåndssignaler, alt som en funksjon av tid. Kjøreforholdene var 0,5 MHz, 0,7 MPa topp negativt trykk, 2,0 ms pulsvarighet, 200 ms puls repetisjonsperiode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg"> Figur 6: Effekt av PCD-fokuseringsgeometri registrert med en 20:1-fortynning av mikrobobler i normal PBS. Kjøreforholdene var: 1,0 MHz, 0,50 MPa topp negativt trykk, 3,0 ms pulsvarighet, 10 ms puls repetisjonsperiode. (A) Full spektra gjennomsnittet over eksponeringstid og tre uavhengige prøve repetisjoner. (B) Strøm i 3, 4 og 5 MHz harmonikk, og (C) strøm i 2,5, 3,5 og 4,5 MHz ultraharmonikk. Tykke linjer er utvalgsgjennomsnitt, skyggelagte områder angir +/- 1 standardavvik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg"> Figur 7: Effekt av avgassede medier registrert med PBS. (A) Full spektra gjennomsnittet over eksponeringstid og fem uavhengige prøve repetisjoner. (B) Strøm i 3, 4 og 5 MHz harmonikk, og (C) strøm i 2,5, 3,5 og 4,5 MHz ultraharmonikk. Tykke linjer er utvalgsgjennomsnitt, skyggelagte områder angir +/- 1 standardavvik. Stasjonsforholdene var 1,0 MHz, 0,50 MPa topp negativt trykk, 1,0 ms pulsvarighet, 200 ms puls repetisjonsperiode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>parameter</td>
			<td>enhet</td>
			<td>minimum</td>
			<td>maksimum</td>
		</tr>
<tr>
<td>frekvens</td>
			<td>Mhz</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>trykk (topp negativ)</td>
			<td>Mpa</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>puls lengde</td>
			<td>Sykluser</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>Driftssyklus</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>eksponeringstid</td>
			<td>s</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Oppsummering av utvalget av rapporterte parametere som letter sonoporasjon in vitro.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Cavitation Enhanced Therapy at JoVE.com

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Den presenterte eksperimentelle protokollen kan brukes til å utføre sanntidsmålinger av kavitasjonsaktivitet i en cellekulturenhet med sikte på å muliggjøre undersøkelse av forholdene som kreves for vellykket legemiddellevering og / eller andre bioeffekter.

Studere kavitasjon forbedret terapi

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Disse benk-topp systemdesign, datainnsamling og analyseprinsipper kan brukes som et rasjonelt grunnlag for in-vitro studie av kavitasjon forbedrede terapier. Teknikkene våre muliggjør testing av høy gjennomstrømning samtidig som de kritiske eksperimentelle egenskapene til intervallkavitasjonsovervåking bevares, repeterbar prøvejustering og kompatibilitet med vanlige cellulære analysemetoder. Kavitasjon forbedret terapi har flere potensielle applikasjoner, inkludert behandling av sykdommer som kreft og hjerneslag.Ved å bedre forstå understøttelsesmekanismene kan vi utvikle bedre terapier. Dette arbeidet gir et lett reproduserbart systemdesign og implementeringsrammeverk for å tillate forskning på et bredt spekter av kavitasjon indusert cellulære bioeffekter. Inkludert legemiddellevering, sonoporasjon og sonoprinting.Å få meningsfulle resultater krever å sikre reproduserbarhet og kontroll for alle variabler i eksperimentet. Det er viktig å utføre alle relevante kontroller og måle den elektriske støyen. For fremstilling av systemene for akustisk transfeksjon, degas fyllvæsken under et trykk på 100kPa i minst to timer for å minimere sannsynligheten for kavitasjon i forplantningsbanen.Bekreftelse med en oppløst oksygensonde om at det delvise oksygentrykket er under 10kPa anbefales. Fyll testkammeret langsomt for å minimere gjeninnføringen av luft i avgasset væske og fjern umiddelbart eventuelle gjenværende bobler fra transduseren og middels beholderflater. La ultralydkildestrømforsterkeren varme opp i henhold til produsentens anbefaling, slik at forsterkningen og utgangen er stabil med hensyn til tid.Og fortynn kavitasjonsmiddelet mens du forsiktig og kontinuerlig rører for å lage en jevn suspensjon uten å fange makrobobler eller ødelegge agenten. Når du arbeider med mikrobobler, må du sørge for å håndtere dem nøye. For SAT2-forberedelse, før du begynner eksperimentet, bruk etanol for å sterilisere PDMs lokket.Trykk på det steriliserte lokket til kulturfatet for å danne cellerommet og last en 10 milliliter sprøyte utstyrt med en 18 gauge stump nål med 10 milliliter fyllvæske. Sett nålen gjennom en av PDM-ene fyll hull og fyll kammeret langsomt mens du vipper, slik at makrobobler kan slippe ut gjennom det åpne fyllhullet. Når kammeret er fylt, setter du inn en fire til fem millimeter polymerstang i det åpne hullet og plasserer enheten slik at hullene er horisontale.Fjern nålen mens du injiserer ekstra væske slik at luft ikke trekkes inn i kammeret og lukk fyllhullet med en annen polymerstang. Kontroller rommet visuelt for å se om det finnes tegn på oppfangede makrobobler, og trykk monter celleeksponeringsrommet i romholderen. Vurder oppdriften av partiklene i suspensjon og hvordan deres oppdrift vil påvirke deres kontakt med celler når de bestemmer retningen av celleeksponeringsrommet.Senk deretter kammerlokket i horisontal vinkel for å hindre makrobobler i å hvile på de nedsenkede delene av enheten, installer lokket på toppen av kammeret. Før du utfører de eksperimentelle målingene, la suspensjonen termisk likevekte med kammertemperaturen. Bruk en fin nål termokobling for å bekrefte at temperaturen i kammeret har stabilisert seg.For å overvåke forsøkene i sanntid, i både tids- og frekvensdomener, start datainnsamlingsprosessen og slå på ultralydkildedrivsignalet. Bruk en høyspenningssonde til å overvåke forsterkerutgangssignalet som driver ultralydkilden gjennom hele eksperimentet for å sikre at eksponeringen fortsetter som forventet. Og sørg for at oscilloskopet er satt til å kompensere for sondens demping.Tidsdomeneovervåking av passiv kavitasjonsdetektor avslører om signalene er dimensjonert riktig for dagens instrumenteringsinnstillinger og om kavitasjonssignalene ses tidligere enn forventet. Frekvensdomeneovervåking tillater analyse av typen bobleadferd og kan brukes til å justere stasjonsnivåer etter behov for å oppnå ønsket celleamulans. I denne analysen, ved det laveste hendelsestrykket, besto den passive kavitasjonsdetektorresponsen helt av heltallsharmonier av den grunnleggende ultralydfrekvensen på 0,5 MHz.Økning fra 0,2 til 0,3 MPa resulterte i uttalt ultraharmonier i spekteret i tillegg til en ytterligere forhøyet heltallsharmoni. Tidsdomenebølgeformene ved disse to trykkene så like ut, selv om 0,3MPa-resultatene viste mer variasjon i løpet av pulsvarigheten. Ved høyeste trykk vokste tidsdomenebølgeformamplituden ikke-lineært i forhold til lavere trykk som følge av tydelig forhøyet bredbåndsstøy, sannsynligvis på grunn av inertiell kavitasjon forårsaket av mikrobobleødeleggelse.Her vises full spektra over en 50 sekunders eksponeringstid der kilden sendte ut to millisekundpulser hvert 0,2 sekund. Som observert i denne grafen, som illustrerer de tilsvarende totale harmoniske og bredbåndskreftene, ble det generert store amplitude bredbåndsresponser med den første piggen som ble vurdert å korrelere med ødeleggelsen av de største boblene. Etter noen sekunder reduseres bredbåndsresponsen raskt, tilsynelatende på grunn av bobleødeleggelse.I denne analysen ved hjelp av en 20 til 1 fortynning av mikrobobler og normal PBS viste tids- og prøvegjennomsnittet spektra at den ufokuserte passive kavitasjonsdetektoren inneholdt en sterkere bredbåndsrespons enn fokusdetektoren. Ledsaget av en redusert prøve for å prøvevariabilitet i både harmoniske og ultraharmoniske krefter. Kavitasjonsinduserte bioeffekter kan vurderes ved hjelp av teknikker som fluorescensmikroskopi, strømningscytometri eller biologiske analyser.Dette muliggjør etablering av et robust forhold mellom kavitasjonsaktivitet og de biologiske effektene. Denne teknikken har gjort det mulig for oss å bedre identifisere sammenhengene mellom bobleadferd og biologiske effekter som har avslørt noen potensielle nye mekanismer som underbygger kavitasjon mediert legemiddellevering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Microfluidic Mixers for å studere Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

En Microfluidic enhet for Studerer Flere Tydelig Stammer

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Diagnosis of Neoplasia in Barrett&#8217;s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Diagnosis of Neoplasia in BarrettÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Diagnose av Neoplasia i Barretts øsofagus med Vital-dye Forbedret Fluorescens Imaging

The ability to differentiate benign metaplasia in Barrett&#8217;s Esophagus (BE) from neoplasia in vivo remains difficult as both tissue types can be flat ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Syntese av gull nanopartikkel Integrated Photo-responsive liposomer og måling av deres av mikro Kavitasjon på Pulse Laser Eksitasjon

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Robotic Mirror Therapy System for funksjonell bedring av hemiplegisk Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

En mikrofluidsystem med Surface Mønstring for Gransker Kavitasjon Bubble (e)-celle Samhandling og den resulterende bioeffekter på Single-cellenivå

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...