Name: studying cavitation enhanced therapy
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00
Duration: 7 min 36 s
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Os autores agradecem ao Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas por apoiar este trabalho através da concessão EP/L024012/1. A VB também conta com o apoio do Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas (EPSRC) e do Medical Research Council (MRC) (concessão EP/L016052/1). VB e AV agradecem à Fundação Clarendon por Bolsas de Pós-Graduação. A AV também agradece ao Exeter College por uma bolsa de estudos do Santander. Os autores estão em dívida com James Fisk e David Salisbury por sua inestimável assistência na fabricação do aparelho. Eles também reconhecem com gratidão as contribuições dos Drs. Dario Carugo e Joshua Owen no desenvolvimento de sats protótipos anteriores.

Os autores não têm nada a revelar.

Os passos críticos para qualquer medição acústica foram encapsulados pela Apfel em 198176 como "conheça seu líquido, conheça seu campo sonoro, saiba quando algo acontece". No contexto deste protocolo, estes englobam a calibração e alinhamento do transdutor e as etapas de preparação e manuseio de bolhas. Em primeiro lugar, é essencial que o hidrofone usado para calibrar o transdutor de condução e/ou o PCD seja calibrado com precisão através de manutenção externa regular ou comparação interna com um padrão de referência. Da mesma forma, a resposta tanto do transdutor de condução quanto do PCD precisa ser regularmente caracterizada para verificar se há qualquer alteração na saída e/ou perda de sensibilidade. Se as condições de condução e receber sensibilidade do sistema são desconhecidas, então será impossível inferir qualquer relação significativa entre condições de exposição, bioefeitos e emissões acústicas. Diretamente relacionados a isso, o alinhamento dos transdutores entre si e a câmara amostral precisa ser cuidadosamente verificado para garantir que as condições de exposição dentro da câmara sejam como esperado e que o volume amostral para o PCD corresponda à região de interesse. Como indicado, o teor de temperatura e gás do meio suspenso pode afetar significativamente os resultados finais e a consistência é extremamente importante neste sentido77,78. Da mesma forma, a preparação, caracterização e manuseio da suspensão do agente de cavitação requerem muita atenção para garantir que a distribuição e concentração de tamanho esperados das partículas esteja presente dentro da amostra. Por exemplo, se a concentração de bolhas for muito alta, haverá uma proteção eficaz do volume amostral do campo dos EUA incidente. Os agentes mb são particularmente suscetíveis à destruição e à coalescência e mais orientações sobre seu manuseio podem ser encontradas em Mulvana et. al. (2012)79.
Um problema muito comum com a detecção de sinais de cavitação é alcançar um SNR adequado. Isso se deve, em parte, à natureza do sinal em si, como descrito, mas também pode ser devido a fontes de ruído elétrico dentro da configuração experimental. Verificar as conexões entre os componentes do sistema, em particular aqueles que envolvem cabos coaxiais, pode ajudar a eliminar alguns deles. Pode ser necessário substituir ou reparar cabos coaxiais. Identificar e remover ou desativar outros equipamentos em laboratório, como bombas que podem causar ruídos elétricos, também pode ajudar. A má impedância elétrica entre os componentes do sistema pode ser uma outra causa de má relação sinal/ruído e também potencialmente de danos ao equipamento e deve ser cuidadosamente verificada. As configurações de acionamento do gerador de sinal e do osciloscópio devem ser verificadas da mesma forma para confirmar se estão configuradas adequadamente para o experimento e não reverteram para as configurações padrão do fabricante. Se houver destruição significativa de bolhas durante o manuseio, no caso do SAT2, pode ser útil anexar uma segunda seringa à porta de saída e usá-la para extrair suavemente o fluido da câmara, desenhando assim a suspensão. Isso também pode ajudar na eliminação de macrobolhas ou na habilitação do fluxo durante a exposição dos EUA, se desejar.
Não é possível eliminar completamente os reflexos acústicos dentro da câmara de amostra e, portanto, o campo de incidentes não será completamente uniforme sobre todo o volume amostral. Como mencionado nas etapas 1.3.2 e 1.3.3, a transmissibilidade das janelas acústicas será dependente da frequência e, portanto, deve ser cuidadosamente considerada a largura de banda desejada para medições de emissão acústica. Em particular, pode haver reflexos múltiplos significativos de componentes de maior frequência. Esta é outra razão pela qual a calibração do campo dentro do sistema totalmente montado é tão importante para minimizar a incerteza na pressão incidente. O exemplo adequado dos sinais registrados também deve ser considerado para minimizar os efeitos de múltiplas reflexões. O uso de dispositivos comerciais para conveniência e a necessidade de transparência acústica significa que alguma transparência óptica deve ser sacrificada. Isso pode afetar a qualidade da imagem subsequente, por exemplo, para avaliar a viabilidade celular ou a absorção de drogas. Algumas das membranas utilizadas em dispositivos comerciais também são porosas e, portanto, ocorre um isolamento imperfeito entre a câmara de amostra e o banho de água circundante. Como acima, o risco correspondente de contaminação pode ser mitigado usando uma subdálida menor, cujo conteúdo pode ser regularmente substituído. Os dispositivos de cultura celular indicados na Tabela de Materiais são adequados principalmente para monocamadas celulares que podem não ser representativas de tecidos em termos de todos os biofeitos mediados pelos EUA/cavitação. A proximidade das células com uma superfície sólida também afetará a dinâmica do MB de uma forma que pode não refletir as condições in vivo, por exemplo, promovendo microstreaming e microjetagem, como descrito na introdução. Essas limitações podem ser abordadas, no entanto, através de uma simples substituição de modelos de tecidos alternativos.
O objetivo de propor os SATs é fornecer um meio de melhorar a reprodutibilidade das condições de exposição acústica e as emissões acústicas entre estudos de biofeitos mediados pelos EUA, facilitando assim uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes e o desenvolvimento de técnicas de monitoramento de tratamento para melhorar a segurança e a eficácia. Os sistemas são projetados para serem compatíveis com dispositivos de cultura celular disponíveis comercialmente, permitindo que uma ampla gama de ensaios biológicos sejam realizados de acordo com a aplicação de interesse e permitindo o desempenho de experimentos de alto rendimento, removendo a necessidade de procedimentos de alinhamento demorados entre as corridas. Ao padronizar protocolos para a caracterização das condições de exposição e a captura de emissões acústicas, a variabilidade dependente do sistema pode ser reduzida. A gama de parâmetros que devem ser explorados para um determinado experimento dependerá da aplicação (bio-efeito desejado, tipo celular, profundidade do tecido alvo se in vivo etc.) e da natureza de qualquer agente de cavitação sendo utilizado. Dado o grande número de variáveis (frequência dos EUA, amplitude de pressão, comprimento do pulso, frequência de repetição de pulso etc.) explorar completamente todo o espaço do parâmetro é improvável que seja viável. Uma vantagem do protocolo proposto é que permite que alguns limites neste espaço de parâmetro sejam rapidamente estabelecidos. Por exemplo, permite a determinação da pressão mínima na qual um sinal de cavitação é gerado, a pressão máxima ou o comprimento do pulso que pode ser usado antes do descolamento/morte celular ocorrer, e a pressão na qual harmônicos fracionados ou ruído de banda larga são produzidos. Recomenda-se que tal conjunto de medições de escopo sejam realizadas como um primeiro passo em qualquer estudo.
Como apresentado, os SATs são projetados para monitoramento em tempo real das emissões acústicas, com ensaios biológicos sendo realizados fora do experimento. Seria relativamente simples, no entanto, modificar o SAT para permitir a observação óptica direta da câmara amostral através de um objetivo de microscópio. Isso poderia, por sua vez, ser acoplado a um sistema de fluorescência e/ou microscopia de alta velocidade para permitir a observação da absorção de drogas e dinâmica de bolhas, por exemplo. A saída de PCD apresentada atualmente em termos de tensão indica: i) os tipos de comportamento de cavitação e suas proporções relativas; ii) quanto tempo esses comportamentos de cavitação persistem; iii) se as características de exposição tempo-cumulativa observadas estão correlacionadas a um determinado efeito bioeffeito; e iv) se os níveis relativos e comportamentos dependentes do tempo são consistentes com experimentos anteriores no sistema de exposição. Embora a sensibilidade de recebimento do PCD possa ser quantificada, a fim de caracterizar de forma confiável as emissões acústicas em termos de energia absoluta, são necessárias informações espaciais adicionais. Isso poderia ser conseguido substituindo o PCD por um teste de matriz para implementar o mapeamento acústico passivo (PAM)80. Isso aumentaria, no entanto, a complexidade do processamento de sinais e o tempo e o poder computacionais necessários.
Outras instrumentações para medição da resistência elétrica da membrana ou aplicação de métodos de segmentação física, por exemplo, campos magnéticos, também poderiam ser incorporadas. Também seria possível usar estruturas de tecidos tridimensionais, como esferoides tumorais, organoides ou mesmo amostras de tecido ex vivo em substratos de gel acústico "macios" no lugar das monocamadas celulares para estudar os efeitos mediados pelos EUA e pela cavitação em ambientes teciduais mais realistas.

O ultrassom (EUA) tem sido amplamente utilizado como técnica de diagnóstico por imagem devido à sua natureza segura e não invasiva, à sua facilidade de implementação ao lado do paciente e ao seu custo efetivo1. Ao lado de suas capacidades de diagnóstico e monitoramento, os EUA têm um potencial considerável para aplicações terapêuticas. Os primeiros trabalhos exploraram seu uso em trombílise, A transfecção de DNA e o fornecimento de medicamentos2,3,4 e os EUA terapêuticos representam agora uma área muito ativa de pesquisa, com aplicações incluindo tratamento tumoral5,6,7, imunoterapia8,9, barreira hematoencefálica (BBB) interrupção10,11,12, trombolise13,14,15, e tratamento de infecção bacteriana16,17. Um fenômeno-chave que sustenta essas aplicações é a cavitação: a nucleação, o crescimento e a oscilação das cavidades gasosas devido a alterações na pressão do fluido18,19.
Há uma gama de mecanismos pelos quais a cavitação produz efeitos biológicos. Por exemplo, a natureza altamente não linear das oscilações de bolhas sob a influência de um campo aplicado nos EUA pode gerar microstreaming no líquido circundante que pode tanto melhorar a convecção de drogas20 e exercer tensões de cisalhamento no tecido nas proximidades das bolhas. Isso é particularmente prevalente quando as bolhas estão nas proximidades de um limite, fazendo com que as bolhas oscilem não esfericamente, e podem potencialmente promover a absorção de drogas através da permeabilização induzida por tesoura21,22,23,24. Em pressões mais altas, são observadas oscilações de amplitude maiores e rápido colapso da bolha, transmitindo estresse mecânico direto25 e frequentemente gerando ondas de choque, e consequentemente grandes gradientes de pressão que podem interromper e permeabiliar tecidos26,27. O colapso de bolhas perto de uma superfície também pode resultar na formação de microjatos líquidos de alta velocidade28,29,30. Esses microjatos podem penetrar no tecido, potencialmente criando poros ou induzindo ondas de estressesecundárias 31,32. A permeabilização das membranas biológicas nos níveis tecidual e celular é várias vezes referida como sonoforese, utilizada principalmente no contexto do aprimoramento induzido pelos EUA na permeabilidade da pele33,34e sonoporação, utilizada principalmente para descrever a permeabilização reversível da membrana celular devido à formação de poros de membrana35,36.
A absorção viscosa no líquido imediatamente em torno da bolha oscilante pode produzir um efeito de aquecimento substancial37. Além disso, as oscilações altamente não lineares produzem radiação acústica em frequências superiores ao campo norte-americano. Isso leva a um aumento da absorção no tecido circundante e um aquecimento adicionalde 38. O colapso da bolha também pode ser acompanhado por efeitos químicos devido às altas temperaturas e pressões transitórias no núcleo da bolha, como a geração de espécies altamente reativas e radiação eletromagnética, conhecida como sonoluminescência32. Esses efeitos têm sido investigados para avaliar danos potenciais e/ou ativação de vias celulares relevantes para entrega39 e explorados na ativação local de drogas sensíveis à luz em uma abordagem conhecida como terapia sonodinâmica40,41,42,43.
Muitos biofeitos mediados pelos EUA podem ser iniciados apenas através do controle dos parâmetros de campo dos EUA (amplitude de pressão, frequência, comprimento do pulso e frequência de repetição e duração da exposição), mas gerar de forma confiável na cavitação no tecido biológico muitas vezes requer altas energias de entrada e, portanto, carrega um risco elevado de dano. A introdução de núcleos de cavitação exógena ou artificial pode reduzir substancialmente a energia de entrada necessária para produzir a ampla gama de efeitos discutidos acima e introduz ainda efeitos adicionais que podem não ser possíveis apenas com os EUA. Os núcleos de cavitação incluem bolhas de gás26,44, gotículas líquidas45,46,47 e partículas sólidas48,49,50, com núcleos de cavitação nanoescala sendo uma área emergente de investigação para seus benefícios em termos de tempo de circulação prolongada, extravasação melhorada e atividade de cavitação prolongada49,51,52,53.
Os núcleos mais utilizados são microbolhas de gás (MBs), originalmente utilizadas como agentes de contraste em imagens de diagnóstico. Eles são tipicamente de 1-2 micrômetros de diâmetro e contêm um núcleo de um gás de alto peso molecular com baixa solubilidade aquosa no meio circundante. O núcleo é cercado por um lipídio protetor, proteína ou concha de polímero mais comumente consistindo de fosfolipídios54. Quando expostos a um campo norte-americano, a compressão dos MBs faz com que eles passem por oscilações volumosas, consequentemente produzindo forte dispersão acústica, responsável pelo sucesso dos MBs como agente de contraste. Como mencionado, essas oscilações também levam aos efeitos mecânicos, térmicos e químicos acima mencionados que podem ser aproveitados em aplicações terapêuticas. O processo de revestimento MB também oferece um mecanismo para encapsular drogas dentro da estrutura MB e para anexar drogas e/ou direcionar espécies à superfície MB. Essa técnica facilita a liberação desencadeada de medicamentos para reduzir a toxicidade sistêmica55. Também foi demonstrado recentemente que o material da superfície mb pode ser transferido para estruturas biológicas, aumentando a entrega de medicamentos através da chamada "sonoimpressão"56,57,58.
O monitoramento da atividade de cavitação mediada pelos EUA pode fornecer insights sobre os efeitos biológicos resultantes, tanto in vitro quanto in vivo, e potencialmente permite a sintonia e otimização desses efeitos. Os dois métodos mais amplamente aplicados para monitorar a atividade de cavitação são i) ópticos, que usam microscopia de vídeo de ultra alta velocidade e geralmente não são viáveis in vivo; e ii) acústico, que registram os campos de som re-irradiados produzidos por bolhas oscilantes e/ou em colapso. Tanto os componentes de amplitude quanto de frequência do sinal acústico contêm informações sobre o comportamento da bolha. Baixas concentrações de bolhas em baixas amplitudes dos EUA têm sido demonstradas para produzir emissões predominantemente harmônicas (múltiplos inteiros da frequência de condução)59. À medida que as pressões de condução aumentam, o espectro de emissões de bolhas também pode conter componentes fracionados conhecidos como subharmônicas e ultraharmônicas60 que indicam comportamento não linear mais forte, bem como ruído de banda larga, que é indicativo de cavitação inercial. Harmônicos inteiros são um indicador primário da oscilação da bolha, mas também podem ser causados por não linearidades em qualquer lugar de um sistema experimental, por exemplo, devido à propagação não linear. Em contraste, harmônicos fracionados e ruídos de banda larga estão fortemente correlacionados com a dinâmica das bolhas.
A relação entre o comportamento das bolhas e as emissões acústicas detectadas pode ser complicada por fatores como o campo dos EUA incidente, o ambiente de nucleação e as características da via de detecção60. No entanto, informações importantes sobre o comportamento das bolhas e suas interações com as células podem ser obtidas por tendências criteriosas de frequência e energia no espectro acústico. Esses dados também podem fornecer informações valiosas que podem ser usadas para formar a base para técnicas de monitoramento de tratamento clínico. Para explorar plenamente essas informações, é necessário o desenvolvimento de métodos experimentais robustos, traduzíveis e reprodutíveis.
Atualmente, há uma variação substancial nos protocolos relatados para a concepção de sistemas e a realização de estudos para apoiar o desenvolvimento de terapias assistidas por cavitação. Em termos do aparelho, uma série de abordagens de design foi realizada. Vários grupos fizeram uso de câmaras de placas paralelas56,61,62,63, construídas sob medida ou comercialmente disponíveis (por exemplo, OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et al. (2013) desenvolveram uma câmara celular juntamente com um módulo de sônica dos EUA e imagem confocal em tempo real64, Carugo et al. (2015) utilizou um sistema composto por um prato de cultura celular comercialmente disponível com uma tampa PDMS personalizada para permitir a submersão em um banho de água durante a exposição dos EUA65, e Pereno et al. (2018) utilizaram um dispositivo composto por ressonadores acoustofluidos em camadas que permitem a caracterização óptica e acústica simultânea da dinâmica das bolhas e das interaçõesbubble-cell 66. O uso de projetos personalizados e específicos de aplicativos complica a caracterização do campo dos EUA e outras condições de exposição ambiental, tornando as comparações de estudos cruzados desafiadoras. Por exemplo, há uma variação considerável nos parâmetros dos EUA identificados para alcançar a sonoporação bem sucedida, que incluem frequências centrais que variam de 0,02 a 15 MHz, ciclos de impostos variando de 1% a ondas contínuas, e pressões de 0,1 a 20 MPa23,64,67,68,69,70 ( Tabela1). Há uma variação igualmente considerável nos componentes espectrais (harmônicos, sub-harmônicos etc.) que foram identificados como associados a efeitos biológicos particulares.
O objetivo deste trabalho, portanto, é fornecer uma estrutura de design e implementação de sistema facilmente reprodutível para o estudo in vitro de biofeitos celulares induzidos pela cavitação com a inclusão específica de uma capacidade de monitoramento de cavitação.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorber</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>APTFlex F28 panel</td>
			<td>1.0 cm standard thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (power)</td>
			<td>E&#38;I Ltd.</td>
			<td>1040L</td>
			<td>400W power amplifier to drive ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (pre)</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR445A</td>
			<td>Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium heater</td>
			<td>Aquael</td>
			<td>Ultra 50W</td>
			<td>Different models for different tank sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>TiePie Engineering</td>
			<td>HS5-110-XM</td>
			<td>Extended memory option: 32M points per channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>FOH</td>
			<td>0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>SonoVue</td>
			<td>FDA approved microbubbles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD mirror (SAT3)</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>F-102</td>
			<td>90 degree beam reflection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD transducer</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>V320-SU</td>
			<td>Immersion transducer, 7.5MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD waterproof cable</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>BCU-58-1 W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (SAT2 compartment lid)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer rod (SAT2 seal)</td>
			<td>Zeus</td>
			<td>PTFE monofilament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber plug (SAT3 lid/seal)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-2101</td>
			<td>6mm bottom dia., 8mm top dia., red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>33250</td>
			<td>Waveform generator for ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>&#181;-Dish 35mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT3</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Transwell 6.5mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound source (SAT3)</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>H107 with central hole</td>
			<td>Use of a HIFU-capable source allows pressures &#62;1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying cavitation enhanced therapy

O interesse pelas aplicações terapêuticas do ultrassom é significativo e crescente, com potenciais alvos clínicos que vão do câncer à doença de Alzheimer. A cavitação - a formação e o movimento subsequente de bolhas dentro de um campo de ultrassom - representa um fenômeno-chave que sustenta muitos desses tratamentos. Permanece, no entanto, uma incerteza considerável em relação aos mecanismos detalhados de ação pelos quais a cavitação promove efeitos terapêuticos e há a necessidade de desenvolver técnicas de monitoramento confiáveis que possam ser implementadas clinicamente. Em particular, há uma variação significativa entre os estudos nos parâmetros de exposição relatados como com sucesso, fornecendo efeitos terapêuticos e as emissões acústicas correspondentes. O objetivo deste artigo é fornecer diretrizes de design e um protocolo experimental utilizando componentes amplamente disponíveis para a realização de estudos de biofeitos mediados pela cavitação, e incluir monitoramento acústico em tempo real. Espera-se que o protocolo possibilite a incorporação mais difundida do monitoramento acústico em experimentos de ultrassom terapêutico e facilite a comparação entre estudos de condições de exposição e sua correlação com biofes relevantes.

A Figura 4 mostra exemplos de respostas pcD de domínio de tempo e frequência, ilustrando três comportamentos distintos de cavitação. Todos os dados foram coletados no SAT3 utilizando MBs SonoVue diluídos 5x na PBS, com uma concentração final de ~2*107 MBs/ml. A temperatura para todos os exemplos nesta seção foi de 19 ± 1 °C. A fonte norte-americana foi conduzida com um pulso de 2,0 ms a 0,5 MHz para atingir o pico de rajadas de pressão negativa de 0,20(Figura 4A e 4B),0,30(Figura 4C e 4D),e 0,70 MPa(Figura 4E e 4F). As gravações de sinal começaram 1,4 ms antes do t = 0 início do pulso dos EUA. Os traços de entrada mostram o sinal como gravado (vermelho) e com um filtro de passagem de 2 MHz (azul) para uma janela de tempo centrada no momento do voo de fonte para compartimento de exposição celular para PCD. A resposta de baixo nível antes deste tempo deve-se à radiação recebida diretamente da fonte, o que é comum em configurações onde o PCD está por trás da fonte dos EUA.
Na menor pressão incidente, a resposta do PCD consiste inteiramente de harmônicos inteiros da frequência fundamental dos EUA de 0,5 MHz. O aumento de 0,20 para 0,30 MPa resulta em ultraarmônicas pronunciadas no espectro, além de harmônicos inteiros ainda mais elevados. As formas de onda de domínio de tempo nessas duas pressões são semelhantes, embora os resultados de 0,30 MPa mostrem mais variabilidade durante a duração do pulso. Na maior pressão, a amplitude de forma de onda do domínio do tempo cresceu quase perto das pressões mais baixas como resultado de ruído de banda larga claramente elevado visível no espectro. Esse ruído é comumente considerado como resultado de cavitação inercial e, neste exemplo, corresponde à destruição de MBs.
Para ver isso com mais clareza, as respostas do PCD em função do tempo são mostradas na Figura 5. No painel esquerdo(Figura 5A),os espectros completos são mostrados ao longo de um tempo de exposição de 50 segundos, durante o qual a fonte emitiu pulsos de 2,0 ms a cada 0,20 segundos. Os poderes totais, harmônicos e de banda larga correspondentes são mostrados no painel direito(Figura 5B). Os EUA foram ligados em t =3.0 s, momento em que foram vistas respostas de banda larga de grande amplitude. Acredita-se que o pico inicial corresponda à destruição das maiores bolhas na suspensão (SonoVue é polidisperse) e é uma observação comum em experimentos de cavitação com bolhas descascadas e até mesmo com mídia não desgaseada (por exemplo, PBS).
Após alguns segundos, a resposta da banda larga diminuiu rapidamente, aparentemente devido à destruição da bolha, e o sinal é predominantemente composto de harmônicos. Isso sugere que o gás liberado e os MBs restantes estão vibrando de forma estável e não inertimente. Na década de 50, o componente de banda larga caiu para o nível do ruído de fundo original. Testes de exposição como este são, portanto, importantes ao tentar entender as escalas de tempo durante as quais diferentes efeitos de bolha podem estar agindo sobre as células na câmara.
É provável que as bolhas se traduzam em resposta às forças de radiação geradas durante a exposição e o movimento dos MBs nos EUA dentro e fora do campo de visão PCD pode levar a uma maior variabilidade no sinal de cavitação monitorado, especialmente quando se lida com suspensões diluídas. A região sensível do PCD deve, portanto, abranger o máximo possível da superfície de exposição celular. Uma comparação das respostas focadas e pcds desfocados com frequências centrais idênticas (ver Figura 2) é mostrada na Figura 6, usando uma diluição de 20:1 de MBs em PBS normal é SAT2. O espectro de tempo e média de amostra no painel Figura 6A mostra que o PCD desfocado contém uma resposta de banda larga mais forte, acompanhada de variabilidade amostral-amostra reduzida tanto em poderes harmônicos(Figura 6B) quanto ultraharmônicos(Figura 6C).
É importante reconhecer que as mídias usadas para trabalhos in vitro não são desgaseadas e podem apresentar um nível de fundo aprimorado de atividade bolha. A Figura 7 mostra a resposta no SAT2 da PBS usada em sua forma fornecida pelo fornecedor e após duas horas de desgaseamento sob vácuo, após a qual a saturação do ar foi reduzida de 92% para 46% conforme determinado com um sensor óptico (PreSens, Alemanha). Os espectros na Figura 7A foram mediados ao longo do tempo de exposição e repetições com cinco amostras independentes, e mostram claramente ultraharmônicas claramente elevadas na PBS normal. Os poderes somados ao longo de três harmônicos (Figura 7B) estão bem dentro do desvio padrão de cada saída experimental. Em contraste, as somas ultraharmônicas na Figura 7C mostram que o PBS normal tem quase uma ordem de magnitude de maior nível e variabilidade substancialmente maior entre as amostras. Esses exemplos indicam que um meio comum compatível com células pode apresentar comportamentos que podem ser (incorretamente) atribuídos à presença de MBs. Uma vez que geralmente é impraticável para o meio de cultura desgas devido ao impacto negativo sobre as células e/ou estabilidade do agente de cavitação, é fundamental realizar controles adequados em qualquer estudo relacionado à cavitação.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg"> Figura 1: Ilustrações de dois projetos do sistema de exposição dos EUA incorporando o monitoramento da cavitação: SAT3 (D-F). (A) Montagem anotada SAT2 com parede lateral removida para clareza. (B) SAT2 com parede lateral intacta. (C) Compartimento de exposição celular SAT2, desmontado. (D) Montagem anotada SAT3. (E) SAT3 em configurações normais (esquerda) e lentes (direita) para correspondência de largura do feixe em diferentes frequências. (F) Compartimento de exposição celular SAT3, desmontado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg"> Figura 2: Cálculos de contornos de campo de pressão de meia amplitude para transdutores de campo de 12,7 mm de diâmetro desfocados (esquerda) e esfericamente focados (direita). Frequências de 2, 4 e 8 MHz são mostradas como contornos vermelhos, azuis e verdes, respectivamente, para um elemento PCD na origem coordenada (0,0). Os contornos mais externos do dispositivo desfocado são relativamente insensíveis à frequência, mas a estrutura interna é dependente da frequência. Os contratos de campo esferoticamente focados à medida que a frequência aumenta, mas dentro dos contornos, os campos variam suavemente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg"> Figura 3: Instrumentação para condicionamento e gravação de sinal de cavitação (setas azuis), excitação de origem dos EUA (linhas vermelhas) e acionamento de aquisição de dados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg"> Figura 4: Respostas de PCD de domínio (esquerda) e frequência (direita) registradas com MBs diluídos 5x no PBS. As pressões negativas de pico incidente foram (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, todas em 0,5 MHz. As gravações de sinal começam em 1,4 ms antes do início do t=0 do pulso de ultrassom de duração de 2,0 ms. (A, C, E) Os sinais de domínio de tempo (vermelho) são mostrados em uma escala vertical fixa, indicando como o nível de resposta muda com a pressão do incidente. Os traços de entrada mostram o sinal como gravado (vermelho) e com um filtro de passagem de 2 MHz (azul) para uma janela de tempo centrada no momento do voo de fonte para compartimento de exposição celular para PCD. (B, D, F) As densidades espectrais de ruído e potência do sinal são calculadas para t<0 e t>0, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg"> Figura 5: Históricos de espectro sobre uma exposição de 50 segundos de uma suspensão de MBs diluídos 5x em PBS. (A) Espectro completo e (B) total, harmônico e poderes de sinal de banda larga, tudo em função do tempo. As condições de acionamento foram de 0,5 MHz, 0,7 MPa de pressão negativa máxima, duração de pulso de 2,0 ms, período de repetição de pulso de 200 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg"> Figura 6: Efeito da geometria focalizante do PCD registrada com diluição de 20:1 de microbolhas em PBS normal. As condições de acionamento foram: 1,0 MHz, 0,50 MPa de pressão negativa máxima, duração de pulso de 3,0 ms, período de repetição de pulso de 10 ms. (A) Espectro completo mediado ao longo do tempo de exposição e três repetições de amostra independente. (B) Potência em harmônicos de 3, 4 e 5 MHz, e(C) potência em ultraharmônicas de 2,5, 3,5 e 4,5 MHz. Linhas grossas são meios amostrais, áreas sombreadas indicam +/- 1 desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg"> Figura 7: Efeito da mídia desgaseada gravada com PBS. (A) Espectro completo mediado ao longo do tempo de exposição e cinco repetições de amostra independente. (B) Potência em harmônicos de 3, 4 e 5 MHz, e(C) potência em ultraharmônicas de 2,5, 3,5 e 4,5 MHz. Linhas grossas são meios amostrais, áreas sombreadas indicam +/- 1 desvio padrão. As condições de acionamento foram de 1,0 MHz, 0,50 MPa de pressão negativa máxima, duração de pulso de 1,0 ms, período de repetição de pulso de 200 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>parâmetro</td>
			<td>unidade</td>
			<td>mínimo</td>
			<td>máximo</td>
		</tr>
<tr>
<td>frequência</td>
			<td>Mhz</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>pressão (pico negativo)</td>
			<td>Mpa</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>comprimento de pulso</td>
			<td>Ciclos</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>ciclo de dever</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>tempo de exposição</td>
			<td>s</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Resumo da gama de parâmetros relatados facilitando a sonoporação in vitro.

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Studying Cavitation Enhanced Therapy

O protocolo experimental apresentado pode ser usado para realizar medições em tempo real da atividade de cavitação em um dispositivo de cultura celular com o objetivo de permitir a investigação das condições necessárias para a entrega bem sucedida de medicamentos e/ou outros efeitos biológicos.

Estudando terapia aprimorada da cavitação

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Esses princípios de design de sistema de bancada, coleta de dados e análise podem ser usados como base racional para o estudo in vitro de terapias aprimoradas da cavitação. Nossas técnicas permitem testes de alto rendimento, preservando os atributos experimentais críticos do monitoramento de cavitação de intervalo, alinhamento de amostras repetível e compatibilidade com métodos comuns de análise celular. A terapia aprimorada da cavitação tem múltiplas aplicações potenciais, incluindo o tratamento de doenças como câncer e derrame.Ao entender melhor os mecanismos de sustentação, podemos desenvolver melhores terapias. Este trabalho fornece uma estrutura de design e implementação de sistemas facilmente reprodutíveis para permitir a pesquisa em uma grande variedade de efeitos biocelulares induzidos pela cavitação. Incluindo entrega de drogas, sonoporação e sonoimpressão.Obter resultados significativos requer garantir a reprodutibilidade e o controle de todas as variáveis do experimento. É imprescindível realizar todos os controles relevantes e medir o ruído elétrico. Para a preparação dos sistemas de transfecção acústica, degas o líquido de enchimento sob uma pressão de 100kPa por pelo menos duas horas para minimizar a probabilidade de cavitação no caminho de propagação.Recomenda-se a confirmação com uma sonda de oxigênio dissolvida de que a pressão parcial do oxigênio está abaixo de 10kPa. Encha lentamente a câmara de teste para minimizar a reintrodução do ar no líquido desgaseado e limpar imediatamente quaisquer bolhas residuais das superfícies do transdutor e médio do recipiente. Permita que o amplificador de energia de fonte de ultrassom aqueça conforme recomendação do fabricante para que o ganho e a saída sejam estáveis em relação ao tempo.E diluir o agente de cavitação enquanto mexe suavemente e continuamente para fazer uma suspensão uniforme sem prender bolhas macro ou destruir o agente. Ao trabalhar com micro bolhas, certifique-se de manuseá-las com cuidado. Para a preparação do SAT2, antes de iniciar o experimento, use etanol para esterilizar a tampa dos PDMs.Pressione colocar a tampa esterilizada no prato de cultura para formar o compartimento celular e carregar uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha cega de calibre 18 com 10 mililitros do líquido de enchimento. Insira a agulha através de um dos PDMs preencher buracos e encher lentamente a câmara enquanto inclina para que bolhas macro possam escapar através do orifício de preenchimento aberto. Quando a câmara estiver cheia, insira uma haste de polímero de quatro a cinco milímetros no orifício aberto e posicione o conjunto para que os orifícios sejam horizontais.Remova a agulha enquanto injeta fluido extra para que o ar não seja puxado para dentro da câmara e feche o orifício de enchimento com outra haste de polímero. Verifique visualmente o compartimento em busca de evidências de bolhas macro presas e pressione encaixar o compartimento de exposição celular no suporte do compartimento. Considere a flutuação das partículas em suspensão e como sua flutuação afetará seu contato com as células ao decidir a orientação do compartimento de exposição celular.Em seguida, abaixando a tampa da câmara em um ângulo horizontal para desencorajar bolhas macro de descansar sobre as partes submersas do dispositivo, instalar a tampa na parte superior da câmara. Antes de realizar as medições experimentais, permita que a suspensão se equilibre termicamente com a temperatura da câmara. Usando um termopar de agulha fina para confirmar que a temperatura na câmara estabilizou.Para monitorar os experimentos em tempo real, tanto em domínios de tempo quanto de frequência, inicie o processo de coleta de dados e ligue o sinal de unidade de origem do ultrassom. Use uma sonda de alta tensão para monitorar o sinal de saída do amplificador que conduz a fonte de ultrassom durante todo o experimento para garantir que a exposição esteja acontecendo como esperado. E certifique-se de que o osciloscópio está definido para compensar a atenuação da sonda.O monitoramento do domínio temporal do detector de cavitação passiva revela se os sinais são dimensionados adequadamente para as configurações de instrumentação atuais e se os sinais de cavitação são vistos antes do esperado. O monitoramento de domínio de frequência permite a análise do tipo de comportamento da bolha e pode ser usado para ajustar os níveis de unidade conforme necessário para alcançar o estímulo celular desejado. Nesta análise, na menor pressão incidente, a resposta do detector de cavitação passiva consistiu inteiramente de harmônicos inteiros da frequência de ultrassom fundamental de 0,5MHz.O aumento de 0,2 para 0,3MPa resultou em ultra harmônicos pronunciados no espectro, além de uma harmônica integer ainda mais elevada. As formas de onda de domínio de tempo nessas duas pressões pareciam semelhantes, embora os resultados do 0.3MPa demonstrassem mais variabilidade durante a duração do pulso. Na maior pressão, a amplitude da forma de onda de domínio do tempo cresceu não linearmente em relação às pressões mais baixas como resultado de ruído de banda larga claramente elevado, provavelmente devido à cavitação inercial causada pela destruição de micro bolhas.Aqui, espectros completos são mostrados ao longo de um tempo de exposição de 50 segundos durante o qual a fonte emitiu dois pulsos de milissegundo a cada 0,2 segundos. Como observado neste gráfico, ilustrando os correspondentes poderes harmônicos e de banda larga, foram geradas grandes respostas de banda larga de amplitude com o pico inicial considerado correlacionado com a destruição das maiores bolhas. Após alguns segundos, a resposta da banda larga diminui rapidamente, aparentemente devido à destruição da bolha.Nesta análise, utilizando uma diluição de 20 a 1 de micro bolhas e PBS normal, os espectros médios de tempo e amostra mostraram que o detector de cavitação passiva não focalizado continha uma resposta de banda larga mais forte do que o detector de foco. Acompanhado de uma amostra reduzida à variabilidade amostral tanto nos poderes harmônicos quanto ultra harmônicos. Os efeitos bioinduzidos pela cavitação podem ser avaliados usando técnicas como microscopia de fluorescência, citometria de fluxo ou ensaios biológicos.Isso permite o estabelecimento de uma relação robusta entre a atividade de cavitação e os efeitos biológicos. Essa técnica nos permitiu identificar melhor as relações entre o comportamento da bolha e os efeitos biológicos que revelaram alguns potenciais novos mecanismos que sustentam a cavitação mediada na entrega de medicamentos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Estudando Trajetórias celular Rolamento no Patterns Receptor Asymmetric

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Bioengenharia

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

Utilização de Nanoestruturas Cristal plasmônicos e Fotônica para Manipulação de Micro-e Nanopartículas melhorada

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Misturadores microfluídicos para Estudar o dobramento de proteínas

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Um dispositivo micro para o Estudo múltiplas linhagens distintas

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Diagnosis of Neoplasia in Barrett&#8217;s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Diagnosis of Neoplasia in BarrettÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Diagnóstico de neoplasia de esôfago de Barrett usando-dye Vital Aprimorado imagens de fluorescência

The ability to differentiate benign metaplasia in Barrett&#8217;s Esophagus (BE) from neoplasia in vivo remains difficult as both tissue types can be flat ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Síntese de nanopartículas de ouro lipossomas Integrated Photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Robotic Espelho Sistema de Terapia de recuperação funcional de hemiplégicos Braços

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

Um sistema microfluídico com padrões de superfície para investigar bolha de cavitação (s) Interação -cell e os Efeitos Biológicos resultante no nível de célula única

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...