Name: studying cavitation enhanced therapy
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00
Duration: 7 min 36 s
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Los autores agradecen al Consejo de Investigación en Ingeniería y Ciencias Físicas por apoyar este trabajo a través de la beca EP/L024012/1. VB también cuenta con el apoyo del Consejo de Investigación en Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC) y el Consejo de Investigación Médica (MRC) (subvención EP/L016052/1). VB y AV agradecen a la Fundación Clarendon por becas de posgrado. AV también agradece a Exeter College por una beca Santander. Los autores están en deuda con James Fisk y David Salisbury por su inestimable ayuda en la fabricación del aparato. También agradecen las contribuciones de los Dres. Dario Carugo y Joshua Owen en el desarrollo de prototipos anteriores de SATs.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos críticos para cualquier medición acústica fueron encapsulados por Apfel en 198176 como "conoce tu líquido, conoce tu campo sonoro, sabe cuándo sucede algo". En el contexto de este protocolo, estos abarcan la calibración y alineación del transductor y los pasos de preparación de agua y manejo de burbujas. En primer lugar, es esencial que el hidrófono utilizado para calibrar el transductor de conducción y/o el PCD se calibre con precisión mediante el mantenimiento externo regular o la comparación interna con una norma de referencia. Del mismo modo, la respuesta tanto del transductor de conducción como de la PCD debe caracterizarse regularmente para comprobar si hay algún cambio en la salida y/o pérdida de sensibilidad. Si se desconocen las condiciones de conducción y la sensibilidad de recepción del sistema, entonces será imposible inferir ninguna relación significativa entre las condiciones de exposición, los bioefectos y las emisiones acústicas. Directamente relacionado con esto, la alineación de los transductores entre sí y la cámara de muestra debe verificarse cuidadosamente para garantizar que las condiciones de exposición dentro de la cámara son las esperadas y que el volumen de muestreo para el PCD corresponde a la región de interés. Como se ha indicado, la temperatura y el contenido de gas del medio suspendiendo pueden afectar significativamente a los resultados finales y la consistencia es extremadamente importante a este respecto77,78. Del mismo modo, la preparación, caracterización y manipulación de la suspensión del agente de cavitación requieren una atención muy estrecha para garantizar que la distribución del tamaño esperado y la concentración de partículas esté presente dentro de la muestra. Por ejemplo, si la concentración de burbujas es demasiado alta, habrá un blindaje efectivo del volumen de la muestra del campo estadounidense incidente. Los agentes MB son particularmente susceptibles a la destrucción y coalescencia y se puede encontrar más orientación sobre su manejo en Mulvana et al. al. (2012)79.
Un problema muy común con la detección de señales de cavitación es lograr una SNR adecuada. Esto se debe en parte a la naturaleza de la señal en sí, como se describe, pero también puede deberse a fuentes de ruido eléctrico dentro de la configuración experimental. La comprobación de las conexiones entre los componentes del sistema, en particular las que implican cables coaxiales, puede ayudar a eliminar algunos de ellos. Puede ser necesario reemplazar o reparar los cables coaxiales. Identificar y retirar o desactivar otros equipos en el laboratorio, como bombas que pueden causar ruido eléctrico, también puede ayudar. La mala coincidencia de impedancia eléctrica entre los componentes del sistema puede ser otra causa de la mala relación señal/ruido y también potencialmente de daños en el equipo, y debe verificarse cuidadosamente. Los ajustes de activación en el generador de señales y el osciloscopio deben comprobarse de forma similar para confirmar que están configurados adecuadamente para el experimento y no han vuelto a la configuración predeterminada del fabricante. Si hay una destrucción significativa de las burbujas durante la manipulación, en el caso del SAT2, puede ser útil conectar una segunda jeringa al puerto de salida y usarla para extraer suavemente el líquido de la cámara, dibujando así la suspensión. Esto también puede ayudar a eliminar las macroburbujas o habilitar el flujo durante la exposición a los EE. UU., Si se desea.
No es posible eliminar completamente las reflexiones acústicas dentro de la cámara de muestras y, por lo tanto, el campo incidente no será completamente uniforme en todo el volumen de la muestra. Como se menciona en los pasos 1.3.2 y 1.3.3, la transmisibilidad de las ventanas acústicas dependerá de la frecuencia y, por lo tanto, la anchura de banda deseada para las mediciones de emisiones acústicas debe considerarse cuidadosamente. En particular, puede haber reflexiones múltiples significativas de componentes de frecuencia más alta. Esta es otra razón por la que la calibración del campo dentro del sistema completamente ensamblado es tan importante para minimizar la incertidumbre en la presión incidente. También debe considerarse la posibilidad de utilizar adecuadamente las señales grabadas para reducir al mínimo los efectos de múltiples reflexiones. El uso de dispositivos comerciales por comodidad y la necesidad de transparencia acústica significa que se debe sacrificar cierta transparencia óptica. Esto puede afectar la calidad de las imágenes posteriores, por ejemplo, para evaluar la viabilidad celular o la absorción de fármacos. Algunas de las membranas utilizadas en dispositivos comerciales también son porosas y, por lo tanto, se produce un aislamiento imperfecto entre la cámara de muestra y el baño de agua circundante. Como se indicó anteriormente, el riesgo correspondiente de contaminación puede mitigarse mediante el uso de una subcámara más pequeña, cuyo contenido puede reemplazarse regularmente. Los dispositivos de cultivo celular indicados en la Tabla de Materiales son adecuados principalmente para monocapas celulares que pueden no ser representativas de los tejidos en términos de todos los bioefectos mediados por us/cavitación. La proximidad de las células a una superficie sólida también afectará a la dinámica de MB de una manera que puede no reflejar las condiciones in vivo, por ejemplo, promover la microstreaming y el microjetting como se describe en la introducción. Estas limitaciones se pueden abordar, sin embargo, a través de una simple sustitución de modelos de tejido alternativos.
El objetivo al proponer los SATs es proporcionar un medio para mejorar la reproducibilidad de las condiciones de exposición acústica y las emisiones acústicas entre los estudios de bioefectos mediados por los Estados Unidos, con lo que se espera que facilite una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes y el desarrollo de técnicas de monitoreo del tratamiento para mejorar la seguridad y la eficacia. Los sistemas están diseñados para ser compatibles con los dispositivos de cultivo celular disponibles en el comercio, lo que permite realizar una amplia gama de ensayos biológicos de acuerdo con la aplicación de interés y permite la realización de experimentos de alto rendimiento, eliminando la necesidad de procedimientos de alineación que consumen mucho tiempo entre las corridas. Mediante la estandarización de protocolos para la caracterización de las condiciones de exposición y la captura de emisiones acústicas, se espera que se pueda reducir la variabilidad dependiente del sistema. La gama de parámetros que deben explorarse para un experimento en particular dependerá de la aplicación (bioe efecto deseado, tipo de célula, profundidad del tejido diana si está in vivo, etc.) y de la naturaleza de cualquier agente de cavitación que se utilice. Dado el gran número de variables (frecuencia estadounidense, amplitud de presión, longitud de pulso, frecuencia de repetición de impulsos, etc.) es poco probable que sea factible explorar completamente todo el espacio de parámetros. Una ventaja del protocolo propuesto es que permite establecer rápidamente algunos límites en este espacio de parámetros. Por ejemplo, permite determinar la presión mínima a la que se genera una señal de cavitación, la presión máxima o la longitud de pulso que se puede utilizar antes de que se produzca el desprendimiento/muerte de la célula, y la presión a la que se producen armónicos fraccionarios o ruido de banda ancha. Se recomienda que este conjunto de mediciones de alcance se lleve a cabo como primer paso en cualquier estudio.
Como se presentó, los SATs están diseñados para el monitoreo en tiempo real de las emisiones acústicas, con ensayos biológicos que se realizan fuera del experimento. Sería relativamente sencillo, sin embargo, modificar el SAT para permitir la observación óptica directa de la cámara de muestra a través de un objetivo de microscopio. Esto podría a su vez acoplarse a un sistema de fluorescencia y/o microscopía de alta velocidad para permitir la observación de la absorción de fármacos y la dinámica de burbujas, por ejemplo. La salida de PCD tal como se presenta actualmente en términos de voltaje indica: i) los tipos de comportamiento de cavitación y sus proporciones relativas; ii) cuánto tiempo persisten estos comportamientos de cavitación; iii) si las características de exposición acumulativa de tiempo observadas están correlacionadas con un bioefecto particular; y iv) si los niveles relativos y los comportamientos dependientes del tiempo son consistentes con experimentos anteriores en el sistema de exposición. Si bien se puede cuantificar la sensibilidad de recepción de la PCD, para caracterizar de forma fiable las emisiones acústicas en términos de energía absoluta, se requiere información espacial adicional. Esto podría lograrse reemplazando el PCD con una sonda de matriz para implementar el mapeo acústico pasivo (PAM)80. Sin embargo, esto aumentaría la complejidad del procesamiento de la señal y el tiempo computacional y la potencia requeridos.
También podrían incorporarse otros instrumentos para la medición de la resistencia eléctrica de las membranas o la aplicación de métodos de focalización física, por ejemplo, campos magnéticos. También sería posible utilizar estructuras tridimensionales de tejido como esferoides tumorales, organoides o incluso muestras de tejido ex vivo en sustratos de gel acústicamente "blandos" en lugar de las monocapas celulares para estudiar los efectos estadounidenses y mediados por cavitación en entornos tisulares más realistas.

La ecografía (US) ha sido ampliamente utilizada como técnica diagnóstica de imagen debido a su carácter seguro y no invasivo, su facilidad de implementación al lado de la cama de un paciente y su rentabilidad1. Junto a sus capacidades de diagnóstico y monitoreo, EE.UU. tiene un potencial considerable para aplicaciones terapéuticas. Los primeros trabajos exploraron su uso en la trombólisis, la transfección del ADN y la administración de fármacos2,3,4 y la us terapéutica ahora representa un área muy activa de investigación, con aplicaciones que incluyen el tratamiento tumoral5,6,7,inmunoterapia8,9,la interrupción de la barrera hematoencefálica (BBB)10,11,12,la trombólisis13,14,15y el tratamiento de infeccionesbacterianas 16,17. Un fenómeno clave que sustenta estas aplicaciones es la cavitación: la nucleación, el crecimiento y la oscilación de las cavidades gaseosas debido a cambios en la presión del fluido18,19.
Hay una gama de mecanismos por los cuales la cavitación produce efectos biológicos. Por ejemplo, la naturaleza altamente no lineal de las oscilaciones de burbujas bajo la influencia de un campo estadounidense aplicado puede generar microfluyen en el líquido circundante que puede mejorar la convección de fármacos20 y ejercer tensiones de cizallamiento en el tejido en las proximidades de las burbujas. Esto es particularmente frecuente cuando las burbujas están en las proximidades de un límite, haciendo que las burbujas oscilen no esféricamente, y potencialmente pueden promover la absorción de drogas a través de la permeabilización inducida por cizallamiento21,22,23,24. A presiones más altas, se observan oscilaciones de mayor amplitud y rápido colapso de burbujas, impartiendo tensión mecánica directa25 y generando con frecuencia ondas de choque, y consecuentes grandes gradientes de presión que pueden interrumpir y permeabilizar los tejidos26,27. El colapso de burbujas cerca de una superficie también puede resultar en la formación de microjets líquidos de alta velocidad28,29,30. Estos microjets pueden penetrar en el tejido, creando potencialmente poros o induciendo ondas de tensión secundarias31,32. La permeabilización de las membranas biológicas tanto a nivel tisular como celular se conoce como sonoforesis, utilizada principalmente en el contexto de la mejora inducida por los Estados Unidos en la permeabilidad de la piel33,34,y la sonoporación, utilizada principalmente para describir la permeabilización reversible de la membrana celular debido a la formación de poros de membrana35,36.
La absorción viscosa en el líquido que rodea inmediatamente la burbuja oscilante puede producir un efecto de calentamiento sustancial37. Además, las oscilaciones altamente no lineales producen radiación acústica a frecuencias más altas que el campo de conducción de EE. UU. Esto conduce a una mayor absorción en el tejido circundante y a un mayor calentamiento38. El colapso de burbujas también puede ir acompañado de efectos químicos debido a las altas temperaturas y presiones transitorias en el núcleo de la burbuja, como la generación de especies altamente reactivas y la radiación electromagnética, conocida como sonoluminiscencia32. Estos efectos han sido investigados para evaluar el daño potencial y/o la activación de las vías celulares relevantes para el parto39 y explotados en la activación local de fármacos sensibles a la luz en un enfoque conocido como terapia sonodinámica40,41,42,43.
Muchos bioefectos mediados por los Estados Unidos pueden iniciarse únicamente a través del control de los parámetros del campo estadounidense (amplitud de la presión, frecuencia, longitud del pulso y frecuencia de repetición, y duración de la exposición), pero la generación confiable de cavitación en el tejido biológico a menudo requiere altas energías de entrada y, por lo tanto, conlleva un riesgo elevado de daño. La introducción de núcleos de cavitación exógenos o artificiales puede reducir sustancialmente la energía de entrada necesaria para producir la amplia gama de efectos discutidos anteriormente e introduce además efectos adicionales que pueden no ser posibles solo con los Estados Unidos. Los núcleos de cavitación incluyen burbujas de gas26,44,gotitas líquidas45,46,47 y partículas sólidas48,49,50,siendo los núcleos de cavitación a nanoescala un área emergente de investigación por sus beneficios en términos de tiempo de circulación prolongado, extravasación mejorada y actividad de cavitación prolongada49,51,52,53.
Los núcleos más comúnmente utilizados son las microburbujas de gas (MB), utilizadas originalmente como agentes de contraste en imágenes de diagnóstico. Son típicamente 1-2 micrómetros de diámetro y contienen un núcleo de un gas de alto peso molecular con baja solubilidad acuosa en el medio circundante. El núcleo está rodeado por una capa protectora de lípidos, proteínas o polímeros que comúnmente consiste en fosfolípidos54. Cuando se exponen a un campo estadounidense, la compresibilidad de los MB hace que sufran oscilaciones volumétricas, produciendo en consecuencia una fuerte dispersión acústica, que es responsable del éxito de los MB como agente de contraste. Como se mencionó, estas oscilaciones también conducen a los efectos mecánicos, térmicos y químicos antes mencionados que se pueden aprovechar en aplicaciones terapéuticas. El proceso de recubrimiento de MB también ofrece un mecanismo para encapsular fármacos dentro de la estructura de MB y para unir fármacos y/o especies objetivo a la superficie de MB. Esta técnica facilita la liberación desencadenada de fármacos para reducir la toxicidad sistémica55. También se ha demostrado recientemente que el material de la superficie mb puede ser transferido a estructuras biológicas, mejorando la administración de drogas a través de la llamada "sonoimpresión"56,57,58.
La supervisión de la actividad de cavitación mediada por los Estados Unidos puede proporcionar información sobre los efectos biológicos resultantes tanto in vitro como in vivo y potencialmente permite el ajuste y la optimización de estos efectos. Los dos métodos más ampliamente aplicados para monitorear la actividad de cavitación son i) óptico, que utiliza microscopía de video de ultra alta velocidad y generalmente no son factibles invivo; y ii) acústico, que registran los campos sonoros re-irradiados producidos por burbujas oscilantes y /o colapsantes. Tanto los componentes de amplitud como de frecuencia de la señal acústica contienen información sobre el comportamiento de las burbujas. Se ha demostrado que las bajas concentraciones de burbujas a bajas amplitudes incidentes en los Estados Unidos producen emisiones predominantemente armónicas (múltiplos enteros de la frecuencia de conducción)59. A medida que aumentan las presiones de conducción, el espectro de emisión de burbujas también puede contener componentes fraccionarios conocidos como subharmonics y ultraharmonics60 que indican un comportamiento no lineal más fuerte, así como ruido de banda ancha, que es indicativo de cavitación inercial. Los armónicos enteros son un indicador primario de la oscilación de burbujas, pero también pueden ser causados por no linealidades en cualquier parte de un sistema experimental, por ejemplo, debido a la propagación no lineal. Por el contrario, los armónicos fraccionarios y el ruido de banda ancha están muy fuertemente correlacionados con la dinámica de burbujas.
La relación entre el comportamiento de las burbujas y las emisiones acústicas detectadas puede complicarse por factores como el campo estadounidense incidente, el entorno de nucleación y las características de la vía de detección60. Sin embargo, se puede obtener información importante sobre el comportamiento de las burbujas y sus interacciones con las células al discernir las tendencias en frecuencia y energía en el espectro acústico. Estos datos también pueden proporcionar información valiosa que se puede utilizar para formar la base de las técnicas de monitorización del tratamiento clínico. Para explotar plenamente esta información, se requiere el desarrollo de métodos experimentales robustos, traducibles y reproducibles.
Actualmente hay una variación sustancial en los protocolos reportados para diseñar sistemas y realizar estudios para apoyar el desarrollo de terapias asistidas por cavitación. En cuanto al aparato, se ha adoptado una serie de enfoques de diseño. Varios grupos han hecho uso de cámaras de placa paralela56,61,62,63,ya sea construidas a medida o disponibles comercialmente (por ejemplo, OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et al. (2013) desarrollaron una cámara celular junto con un módulo de sonicación estadounidense e imágenes confocales en tiempo real64, Carugo et al. (2015) utilizaron un sistema que comprende un plato de cultivo celular disponible comercialmente con una tapa PDMS hecha a medida para permitir la inmersión en un baño de agua durante la exposición estadounidense65, y Pereno et al. (2018) utilizaron un dispositivo que consiste en resonadores acoustofluídicos en capas que permiten la caracterización óptica y acústica simultánea de la dinámica de burbujas y las interacciones burbuja-célula66. El uso de diseños fabricados a medida y específicos de la aplicación complica la caracterización del campo estadounidense y otras condiciones de exposición ambiental, lo que hace que las comparaciones de estudios cruzados sean difíciles. Por ejemplo, hay una variación considerable en los parámetros estadounidenses identificados para lograr una sonoporación exitosa, que incluyen frecuencias centrales que van de 0,02 a 15 MHz, ciclos de trabajo que varían del 1% a la onda continua, y presiones de fabricación raras que van de 0,1 a 20 MPa23,64,67,68,69,70 (Tabla 1). Hay una variación igualmente considerable en los componentes espectrales (armónicos, sub-armónicos, etc.) que se han identificado como asociados con bioefectos particulares.
El objetivo de este trabajo, por lo tanto, es proporcionar un marco de diseño e implementación de sistemas fácilmente reproducible para el estudio in vitro de bioefectos celulares inducidos por cavitación con la inclusión específica de una capacidad de monitoreo de cavitación.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorber</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>APTFlex F28 panel</td>
			<td>1.0 cm standard thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (power)</td>
			<td>E&#38;I Ltd.</td>
			<td>1040L</td>
			<td>400W power amplifier to drive ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (pre)</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR445A</td>
			<td>Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium heater</td>
			<td>Aquael</td>
			<td>Ultra 50W</td>
			<td>Different models for different tank sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>TiePie Engineering</td>
			<td>HS5-110-XM</td>
			<td>Extended memory option: 32M points per channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>FOH</td>
			<td>0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>SonoVue</td>
			<td>FDA approved microbubbles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD mirror (SAT3)</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>F-102</td>
			<td>90 degree beam reflection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD transducer</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>V320-SU</td>
			<td>Immersion transducer, 7.5MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD waterproof cable</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>BCU-58-1 W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (SAT2 compartment lid)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer rod (SAT2 seal)</td>
			<td>Zeus</td>
			<td>PTFE monofilament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber plug (SAT3 lid/seal)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-2101</td>
			<td>6mm bottom dia., 8mm top dia., red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>33250</td>
			<td>Waveform generator for ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>&#181;-Dish 35mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT3</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Transwell 6.5mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound source (SAT3)</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>H107 with central hole</td>
			<td>Use of a HIFU-capable source allows pressures &#62;1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying cavitation enhanced therapy

El interés en las aplicaciones terapéuticas del ultrasonido es significativo y creciente, con potenciales dianas clínicas que van desde el cáncer hasta la enfermedad de Alzheimer. La cavitación - la formación y el movimiento posterior de burbujas dentro de un campo del ultrasonido - representa un fenómeno dominante que sostiene muchos de estos tratamientos. Sigue habiendo, sin embargo, la considerable incertidumbre con respecto a los mecanismos detallados de la acción por los cuales la cavitación promueve efectos terapéuticos y hay una necesidad de desarrollar las técnicas confiables de la supervisión que se puedan poner en práctica clínico. En particular, existe una variación significativa entre los estudios en los parámetros de exposición notificados como que han producido con éxito efectos terapéuticos y las emisiones acústicas correspondientes. El objetivo de este trabajo es proporcionar directrices de diseño y un protocolo experimental utilizando componentes ampliamente disponibles para realizar estudios de bioefectos mediados por cavitación, e incluir monitoreo acústico en tiempo real. Se espera que el protocolo permita una incorporación más generalizada de la monitorización acústica en los experimentos de ultrasonido terapéutico y facilite la comparación entre los estudios de las condiciones de exposición y su correlación con los efectos bioeseguros relevantes.

La Figura 4 muestra ejemplos de respuestas pcd del dominio del tiempo y la frecuencia, ilustrando tres comportamientos de cavitación distintos. Todos los datos fueron recolectados en SAT3 usando SonoVue MBs diluido 5x en PBS, con una concentración final de ~2*107 MBs/ml. La temperatura para todos los ejemplos en esta sección fue de 19 ± 1 °C. La fuente estadounidense fue conducida con un pulso de 2,0 ms a 0,5 MHz para alcanzar presiones negativas de cresta incidente de 0,20(Figura 4A y 4B),0,30(Figura 4C y 4D),y 0,70 MPa(Figura 4E y 4F). Las grabaciones de la señal comenzaron el ms 1,4 antes del comienzo t = 0 del pulso de los E.E.U.U. Las trazas insertadas muestran la señal como grabada (rojo) y con un filtro de paso alto de 2 MHz (azul) para una ventana de tiempo centrada en el momento del vuelo desde la fuente hasta el compartimiento de exposición celular a PCD. La respuesta de bajo nivel antes de este tiempo se debe a la radiación recibida directamente de la fuente, que es común en configuraciones donde el PCD está detrás de la fuente de EE. UU.
A la presión incidente más baja, la respuesta PCD consiste enteramente en armónicos enteros de la frecuencia fundamental estadounidense de 0,5 MHz. El aumento de 0,20 a 0,30 MPa da como resultado ultraarmónicos pronunciados en el espectro, además de armónicos enteros más elevados. Las formas de onda del dominio del tiempo en estas dos presiones parecen similares, aunque los resultados de 0,30 MPa muestran más variabilidad a lo largo de la duración del pulso. A la presión más alta, la amplitud de la forma de onda del dominio del tiempo ha crecido de forma no lineal en relación con las presiones más bajas como resultado del ruido de banda ancha claramente elevado visible en el espectro. Este ruido se considera comúnmente como resultado de la cavitación inercial y, en este ejemplo, corresponde a la destrucción de los MB.
Para ver esto más claramente, las respuestas de PCD en función del tiempo se muestran en la Figura 5. En el panel izquierdo(Figura 5A),los espectros completos se muestran durante un tiempo de exposición de 50 segundos, durante el cual la fuente emite pulsos de 2,0 ms cada 0,20 segundos. Las potencias totales, armónicas y de banda ancha correspondientes se muestran en el panel derecho (Figura 5B). Los E.E.U.U. fueron encendidos en t =3 .0 s, en cuyo momento las respuestas de banda ancha de la grande-amplitud fueron consideradas. Se cree que el pico inicial corresponde a la destrucción de las burbujas más grandes de la suspensión (SonoVue es polidisperse) y es una observación común en experimentos de cavitación con burbujas descascaradas e incluso con medios no desgasados (por ejemplo, PBS).
Después de unos segundos, la respuesta de banda ancha disminuyó rápidamente, aparentemente debido a la destrucción de la burbuja, y la señal se compone predominantemente de armónicos. Esto sugiere que el gas liberado y los MB restantes están vibrando de forma estable y no inercial. En t ~ 50s, el componente de banda ancha ha caído al nivel del ruido de fondo original. Por lo tanto, las pruebas de exposición como esta son importantes cuando se trata de comprender las escalas de tiempo durante las cuales diferentes efectos de burbujas pueden estar actuando sobre las células de la cámara.
Es probable que las burbujas se traduzcan en respuesta a las fuerzas de radiación generadas durante la exposición a los Estados Unidos y el movimiento de los MB dentro y fuera del campo de visión de pcd puede conducir a una mayor variabilidad en la señal de cavitación monitoreada, especialmente cuando se trata de suspensiones diluidas. Por lo tanto, la región sensible de la PCD debe abarcar la mayor parte posible de la superficie de exposición celular. Una comparación de las respuestas enfocadas y desenfocadas pcds con frecuencias centrales idénticas (ver Figura 2)se muestra en la Figura 6,utilizando una dilución 20:1 de MBs en PBS normal es SAT2. El tiempo y los espectros promediados por la muestra en el panel Figura 6A muestran que el PCD desenfocado contiene una respuesta de banda ancha más fuerte, acompañada de una variabilidad reducida de muestra a muestra tanto en potencias armónicas (Figura 6B) como ultraarmónicas (Figura 6C).
Es importante reconocer que los medios usados para el trabajo in vitro de la célula no se desgastan y pueden presentar un nivel de fondo aumentado de actividad de la burbuja. La Figura 7 muestra la respuesta en SAT2 del PBS utilizado en su forma proporcionada por el proveedor y después de dos horas de desgasificación al vacío, después de lo cual la saturación del aire se redujo del 92% al 46% según lo determinado con un sensor óptico (PreSens, Alemania). Los espectros de la Figura 7A se promediaron a lo largo del tiempo de exposición y las repeticiones con cinco muestras independientes, y muestran claramente que muestran ultraarmoníacos claramente elevados en PBS normal. Las potencias sumadas en tres armónicos(Figura 7B)están bien dentro de la desviación estándar de cada salida experimental. Por el contrario, las sumas ultraarmónicas de la Figura 7C muestran que el PBS normal tiene un nivel casi un orden de magnitud más alto y una variabilidad sustancialmente mayor entre las muestras. Estos ejemplos indican que un medio común compatible con células puede exhibir comportamientos que podrían atribuirse (incorrectamente) a la presencia de MB. Puesto que es generalmente poco práctico desgasificar el medio de cultivo debido al impacto negativo sobre las células y/o la estabilidad del agente de cavitación, es crítico realizar controles adecuados en cualquier estudio relacionado con la cavitación.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg"> Figura 1: Ilustraciones de dos diseños de sistemas de exposición estadounidenses que incorporan monitoreo de cavitación: SAT3 (D-F). (A)Conjunto anotado SAT2 con pared lateral removida para mayor claridad. (B) SAT2 con pared lateral intacta. (C) Compartimiento de exposición a celdas SAT2, desmontado. (D) Sat3 montaje anotado. (E) SAT3 en configuraciones normales (izquierda) y con lentes (derecha) para la coincidencia de ancho de haz a diferentes frecuencias. (F)Compartimento de exposición a células SAT3, desmontado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg"> Figura 2: Cálculos de contornos de campo de presión de media amplitud para transductores desenfocados (izquierda) y enfocados esféricamente (derecha) de 12,7 mm de diámetro. Las frecuencias de 2, 4 y 8 MHz se muestran como contornos rojo, azul y verde, respectivamente, para un elemento PCD en el origen de coordenadas (0,0). Los contornos más exteriores del dispositivo desenfocado son relativamente insensibles a la frecuencia, pero la estructura interior depende de la frecuencia. El campo enfocado esféricamente se contrae a medida que aumenta la frecuencia, pero dentro de los contornos, los campos varían suavemente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg"> Figura 3: Instrumentación para el acondicionamiento y registro de señales de cavitación (flechas azules), excitación de la fuente estadounidense (líneas rojas) y activación de la adquisición de datos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg"> Figura 4: Respuestas pcd de dominio de tiempo (izquierda) y frecuencia (derecha) registradas con MB diluidas 5x en PBS. Las presiones negativas máximas incidentes fueron (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, todas a 0,5 MHz. Las grabaciones de señales comienzan 1,4 ms antes del inicio t=0 del pulso de ultrasonido de duración de 2,0 ms. (A, C, E) Las señales del dominio del tiempo (rojo) se muestran en una escala vertical fija, que indica cómo cambia el nivel de respuesta con la presión incidente. Las trazas insertadas muestran la señal como grabada (rojo) y con un filtro de paso alto de 2 MHz (azul) para una ventana de tiempo centrada en el momento del vuelo desde la fuente hasta el compartimiento de exposición celular a PCD. (B, D, F) Las densidades espectrales de ruido y potencia de la señal se calculan para t<0 y t>0, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg"> Figura 5: Historiales del espectro durante una exposición de 50 segundos de una suspensión de MB diluida 5 veces en PBS. (A) Espectros completos y (B) potencias totales, armónicas y de señal de banda ancha, todo en función del tiempo. Las condiciones de accionamiento fueron de 0,5 MHz, 0,7 MPa de presión negativa de pico, 2,0 ms de duración del impulso, 200 ms de período de repetición de impulsos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg"> Figura 6: Efecto de la geometría de enfoque PCD registrada con una dilución 20:1 de microburbujas en PBS normal. Las condiciones de accionamiento fueron: 1,0 MHz, 0,50 MPa de presión negativa de pico, 3,0 ms de duración del pulso, 10 ms de período de repetición de impulsos. (A) Espectros completos promediados durante el tiempo de exposición y tres repeticiones de muestra independientes. (B)Potencia en armónicos de 3, 4 y 5 MHz, y(C)potencia en ultraarmoníacos de 2,5, 3,5 y 4,5 MHz. Las líneas gruesas son medias de muestra, las áreas sombreadas indican +/- 1 desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg"> Figura 7: Efecto de los medios desgasteados grabados con PBS. (A) Espectros completos promediados a lo largo del tiempo de exposición y cinco repeticiones de muestra independientes. (B)Potencia en armónicos de 3, 4 y 5 MHz, y(C)potencia en ultraarmoníacos de 2,5, 3,5 y 4,5 MHz. Las líneas gruesas son medias de muestra, las áreas sombreadas indican +/- 1 desviación estándar. Las condiciones de accionamiento fueron 1,0 MHz, presión negativa de pico de 0,50 MPa, duración del pulso de 1,0 ms, período de repetición de pulsos de 200 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>parámetro</td>
			<td>unidad</td>
			<td>mínimo</td>
			<td>máximo</td>
		</tr>
<tr>
<td>frecuencia</td>
			<td>MHz</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>presión (pico negativo)</td>
			<td>Mpa</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>longitud del pulso</td>
			<td>Ciclos</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>ciclo de trabajo</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>tiempo de exposición</td>
			<td>S</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Resumen de la gama de parámetros notificados que facilitan la sonoporación in vitro.

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Studying Cavitation Enhanced Therapy

El protocolo experimental presentado se puede utilizar para realizar medidas en tiempo real de la actividad de cavitación en un dispositivo de cultivo celular con el objetivo de permitir la investigación de las condiciones requeridas para la administración exitosa de fármacos y / u otros bioefectos.

Estudio de la terapia mejorada de cavitación

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Estos principios de diseño, recopilación de datos y análisis de sistemas de sobremesa se pueden utilizar como una base racional para el estudio in vitro de terapias mejoradas de cavitación. Nuestras técnicas permiten pruebas de alto rendimiento al tiempo que preservan los atributos experimentales críticos de monitoreo de cavitación por intervalos, alineación de muestras repetibles y compatibilidad con métodos comunes de análisis celular. La terapia mejorada por cavitación tiene múltiples aplicaciones potenciales, incluido el tratamiento de enfermedades como el cáncer y el accidente cerebrovascular.Al comprender mejor los mecanismos subyacentes, podemos desarrollar mejores terapias. Este trabajo proporciona un marco de diseño e implementación de sistemas fácilmente reproducible para permitir la investigación de una amplia variedad de efectos biocelulares inducidos por cavitación. Incluyendo la administración de fármacos, sonoporación y sonoimpresión.Obtener resultados significativos requiere garantizar la reproducibilidad y el control de todas las variables del experimento. Es imprescindible realizar todos los controles pertinentes y medir el ruido eléctrico. Para la preparación de los sistemas de transfección acústica, desgasificar el líquido de llenado bajo una presión de 100kPa durante al menos dos horas para minimizar la probabilidad de cavitación en el trayecto de propagación.Se recomienda la confirmación con una sonda de oxígeno disuelto de que la presión parcial de oxígeno está por debajo de 10kPa. Llene la cámara de prueba lentamente para minimizar la reintroducción de aire en el líquido desgastado y elimine inmediatamente cualquier burbuja residual del transductor y las superficies del contenedor medio. Permita que el amplificador de potencia de la fuente de ultrasonido se caliente por recomendación del fabricante para que la ganancia y la salida sean estables con respecto al tiempo.Y diluya el agente de cavitación mientras se agita suave y continuamente para hacer una suspensión uniforme sin atrapar burbujas macro o destruir el agente. Cuando trabaje con microburbujas, asegúrese de manejarlas con cuidado. Para la preparación de SAT2, antes de comenzar el experimento, use etanol para esterilizar la tapa de los PDP.Presione ajustar la tapa esterilizada al plato de cultivo para formar el compartimiento celular y cargar una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja roma de calibre 18 con 10 mililitros del líquido de llenado. Inserte la aguja a través de uno de los orificios de relleno de PD y llene lentamente la cámara mientras se inclina para que las burbujas macro puedan escapar a través del orificio de relleno abierto. Cuando se haya llenado la cámara, inserte una varilla de polímero de cuatro a cinco milímetros en el orificio abierto y coloque el conjunto de modo que los orificios sean horizontales.Retire la aguja mientras inyecta líquido adicional para que el aire no se atrajo en la cámara y cierre el orificio de relleno con otra varilla de polímero. Revise visualmente el compartimiento en busca de evidencia de macro burbujas atrapadas y presione para colocar el compartimiento de exposición celular en el soporte del compartimiento. Considere la flotabilidad de las partículas en suspensión y cómo su flotabilidad afectará su contacto con las células al decidir la orientación del compartimiento de exposición celular.Luego, bajando la tapa de la cámara en un ángulo horizontal para desalentar que las burbujas macro descansen en las partes sumergidas del dispositivo, instale la tapa en la parte superior de la cámara. Antes de realizar las mediciones experimentales, permita que la suspensión se equilibre térmicamente con la temperatura de la cámara. Uso de un termopar de aguja fina para confirmar que la temperatura en la cámara se ha estabilizado.Para monitorear los experimentos en tiempo real, tanto en el dominio del tiempo como en el de la frecuencia, inicie el proceso de recopilación de datos y encienda la señal de la unidad de la fuente de ultrasonido. Utilice una sonda de alto voltaje para monitorear la señal de salida del amplificador que impulsa la fuente de ultrasonido durante todo el experimento para asegurarse de que la exposición está procediendo según lo esperado. Y asegúrese de que el osciloscopio esté configurado para compensar la atenuación de la sonda.La supervisión del dominio del tiempo del detector de cavitación pasiva revela si las señales tienen el tamaño adecuado para la configuración de instrumentación actual y si las señales de cavitación se ven antes de lo esperado. El monitoreo del dominio de frecuencia permite el análisis del tipo de comportamiento de la burbuja y se puede utilizar para ajustar los niveles de accionamiento según sea necesario para lograr el estímulo celular deseado. En este análisis, a la presión incidente más baja, la respuesta pasiva del detector de cavitación, consistió enteramente en armónicos enteros de la frecuencia de ultrasonido fundamental de 0.5MHz.El aumento de 0.2 a 0.3MPa resultó en armónicos ultra pronunciados en el espectro, además de otros armónicos enteros elevados. Las formas de onda del dominio del tiempo en estas dos presiones parecían similares, aunque los resultados de 0,3MPa demostraron más variabilidad durante la duración del pulso. A la presión más alta, la amplitud de la forma de onda del dominio del tiempo creció no linealmente en relación con las presiones más bajas como resultado de un ruido de banda ancha claramente elevado, probablemente debido a la cavitación inercial causada por la destrucción de micro burbujas.Aquí, los espectros completos se muestran durante un tiempo de exposición de 50 segundos durante el cual la fuente emitió pulsos de dos milisegundos cada 0,2 segundos. Como se observa en este gráfico, ilustrando las potencias armónicas y de banda ancha totales correspondientes, se generaron respuestas de banda ancha de gran amplitud con el pico inicial que se considera que se correlaciona con la destrucción de las burbujas más grandes. Después de unos segundos, la respuesta de banda ancha disminuye rápidamente, aparentemente debido a la destrucción de burbujas.En este análisis utilizando una dilución de 20 a 1 de micro burbujas y PBS normal, los espectros promedio de tiempo y muestra mostraron que el detector de cavitación pasiva desenfocado contenía una respuesta de banda ancha más fuerte que el detector de enfoque. Acompañado de una reducción de la variabilidad de la muestra a la muestra en los poderes armónicos y ultra armónicos. Los efectos biológicos inducidos por cavitación se pueden evaluar mediante técnicas como la microscopía de fluorescencia, la citometría de flujo o los ensayos biológicos.Esto permite el establecimiento de una relación robusta entre la actividad de cavitación y los efectos biológicos. Esta técnica nos ha permitido identificar mejor las relaciones entre el comportamiento de la burbuja y los efectos biológicos que han revelado algunos nuevos mecanismos potenciales que sustentan la administración de fármacos mediada por cavitación.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

El estudio de las trayectorias celular Rolling en los patrones del receptor asimétrica

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Investigación

Bioingeniería

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

Utilización de nanoestructuras fotónicas de cristal plasmónicos y para la manipulación mejorada de Micro y nanopartículas

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Microfluídica endotelizado para estudiar las interacciones microvasculares en Enfermedades Hematológicas

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Mezcladores de microfluidos para el estudio plegamiento de proteínas

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Un dispositivo de microfluidos para el estudio de varias cepas distintas

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Diagnosis of Neoplasia in Barrett&#8217;s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Diagnosis of Neoplasia in BarrettÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

El diagnóstico de la neoplasia en el esófago de Barrett utilizando Vital-dye Enhanced Imaging Fluorescencia

The ability to differentiate benign metaplasia in Barrett&#8217;s Esophagus (BE) from neoplasia in vivo remains difficult as both tissue types can be flat ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Síntesis de nanopartículas de oro liposomas Integrado fotosensible y la medición de su microburbujas cavitación al pulso láser de excitación

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Sistema de terapia robótica Espejo para la recuperación funcional de armas hemipléjica

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

Un sistema de microfluidos con modelar superficie de Investigación de la burbuja de cavitación (s) Interacción -Cell y los Bioefectos resultante en el nivel de celda única

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...