Name: studying cavitation enhanced therapy
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Cavitation Enhanced Therapy at JoVE.com

Författarna tackar Vetenskapsrådet för att ha stöttat detta arbete genom bidrag EP/L024012/1. VB stöds också av Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) och Medical Research Council (MRC) (grant EP/L016052/1). VB och AV tackar Clarendon Foundation för Post Graduate Scholarships. AV tackar också Exeter College för ett Santander-stipendium. Författarna står i skuld till James Fisk och David Salisbury för deras ovärderliga hjälp vid tillverkningen av apparaten. De erkänner också tacksamt dr Dario Carugos och Joshua Owens bidrag i utvecklingen av tidigare prototyp-SAT.

Författarna har inget att avslöja.

De kritiska stegen för alla akustiska mätningar kapslades in av Apfel 198176 som "känn din vätska, känn ditt ljudfält, vet när något händer.". Inom ramen för detta protokoll omfattar dessa transduktorns kalibrering och inriktning samt stegen för vattenberedning och bubbelhantering. För det första är det viktigt att hydrofonen som används för att kalibrera körgivaren och/eller kretskortskortet själv är korrekt kalibrerad genom regelbunden extern service eller in-house jämförelse med en referensstandard. På samma sätt måste svaret från både körgivaren och PCD regelbundet karakteriseras för att kontrollera om utgången ändras och/eller att känsligheten går förlorad. Om körförhållandena och systemets känslighet är okända kommer det att vara omöjligt att härleda något meningsfullt samband mellan exponeringsförhållanden, bioverkningar och akustiska utsläpp. Direkt i samband med detta måste givarens anpassning till varandra och provkammaren kontrolleras noggrant för att säkerställa att exponeringsförhållandena i kammaren är som förväntat och att provtagningsvolymen för produktkontrollexemplarar motsvarar den region som är av intresse. Som nämnts kan temperaturen och gashalten i suspenderingsmediet påverka de slutliga resultaten avsevärt och konsistensen är extremt viktig i dettaavseende 77,78. På samma sätt kräver beredningen, karakteriseringen och hanteringen av kavitationsmedlet suspension mycket noggrann uppmärksamhet för att säkerställa att den förväntade storleksfördelningen och koncentrationen av partiklar finns i provet. Om koncentrationen av bubblor till exempel är för hög kommer det att finnas en effektiv avskärmning av provvolymen från det amerikanska incidentfältet. MB-agenter är särskilt mottagliga för förstörelse och sammanslagning och ytterligare vägledning om deras hantering kan hittas i Mulvana et. (2012)79.
Ett mycket vanligt problem med detektering av kavitationssignaler är att uppnå en adekvat SNR. Detta beror delvis på själva signalens art, som beskrivits, men kan också bero på källor till elektriskt brus inom den experimentella uppsättningen. Kontroll av anslutningarna mellan systemkomponenter, särskilt de som rör medaxiella kablar, kan bidra till att eliminera vissa av dessa. Byte eller reparation av medaxiella kablar kan vara nödvändigt. Att identifiera och ta bort eller inaktivera annan utrustning i laboratoriet, t.ex. pumpar som kan orsaka elektriskt brus, kan också hjälpa. Dålig elektrisk impedansmatchning mellan systemkomponenter kan vara ytterligare en orsak till dåligt signal-till-brusförhållande och även potentiellt skada på utrustningen och bör kontrolleras noggrant. De utlösande inställningarna på signalgeneratorn och oscilloskopet bör också kontrolleras för att bekräfta att de är konfigurerade på lämpligt sätt för experimentet och inte har återställts till tillverkarens standardinställningar. Om det finns betydande destruktion av bubblor under hanteringen, i händelse av SAT2, kan det vara bra att fästa en andra spruta på utloppsporten och använda denna för att försiktigt extrahera vätska från kammaren och därigenom dra in suspensionen. Detta kan också hjälpa till att eliminera makrobubblor eller möjliggöra flöde under amerikansk exponering, om så önskas.
Det är inte möjligt att helt eliminera akustiska reflektioner i provkammaren och därför kommer incidentfältet inte att vara helt enhetligt över hela provvolymen. Som nämns i steg 1.3.2 och 1.3.3 kommer överförbarheten av akustiska fönster att vara frekvensberoende och därför bör önskad bandbredd för akustiska utsläppsmätningar övervägas noggrant. I synnerhet kan det finnas betydande flera reflektioner av komponenter med högre frekvens. Detta är en annan anledning till att kalibreringen av fältet inom det helt monterade systemet är så viktig för att minimera osäkerheten i incidenttrycket. Lämplig gating av de inspelade signalerna bör också övervägas för att minimera effekterna av flera reflektioner. Användningen av kommersiella anordningar för bekvämlighet och behovet av akustisk öppenhet innebär att viss optisk transparens måste offras. Detta kan påverka kvaliteten på efterföljande avbildning, t.ex. för att bedöma cellens livskraft eller läkemedelsupptag. Några av de membran som används i kommersiella enheter är också porösa och därmed uppstår ofullkomlig isolering mellan provkammaren och det omgivande vattenbadet. Som ovan kan motsvarande risk för kontaminering minskas med hjälp av en mindre underkammare, vars innehåll regelbundet kan bytas ut. De cellkulturanordningar som anges i materialförteckningen är främst lämpliga för cellmonoskikt som kanske inte är representativa för vävnader i fråga om alla USA/kavitationsmedierade bioverk. Cellernas närhet till en fast yta kommer också att påverka MB-dynamiken på ett sätt som kanske inte återspeglar förhållandena in vivo, t.ex. Dessa begränsningar kan dock åtgärdas genom en enkel ersättning av alternativa vävnadsmodeller.
Syftet med att föreslå de högre säkerhetsmekanismerna är att tillhandahålla ett sätt att förbättra reproducerbarheten av akustiska exponeringsförhållanden och akustiska utsläpp mellan studier av usa-medierade bioverkningar, och på så sätt förhoppningsvis underlätta en bättre förståelse av de underliggande mekanismerna och utvecklingen av behandlingsövervakningsmetoder för att förbättra säkerheten och effektiviteten. Systemen är utformade för att vara kompatibla med kommersiellt tillgängliga cellkulturenheter, vilket gör det möjligt att utföra ett brett spektrum av biologiska analyser enligt intresse och möjliggöra prestanda för experiment med hög genomströmning, vilket tar bort behovet av tidskrävande anpassningsförfaranden mellan körningar. Genom att standardisera protokoll för karakterisering av exponeringsförhållanden och avskiljning av akustiska utsläpp kan den systemberoende variabiliteten förhoppningsvis minskas. Det intervall av parametrar som bör undersökas för ett visst experiment beror på tillämpningen (önskad bioeffekt, celltyp, målvävnadens djup om in vivo etc.) och arten av eventuella kavitationsmedel som används. Med tanke på det stora antalet variabler (AMERIKANSK frekvens, tryckamlitud, pulslängd, pulsrepetitionsfrekvens etc.) är det osannolikt att det är praktiskt genomförbart att utforska hela parameterutrymmet. En fördel med det föreslagna protokollet är att det gör det möjligt att snabbt upprätta vissa gränser för det här parameterutrymmet. Det gör det till exempel möjligt att fastställa det minsta tryck vid vilket en kavitationssignal genereras, det maximala tryck eller pulslängd som kan användas innan cellavlossning/död inträffar och det tryck vid vilket fraktionerade övertoner eller bredbandsbuller produceras. Det rekommenderas att en sådan uppsättning omfångsmätningar utförs som ett första steg i en studie.
Som presenterats är SAT utformad för realtidsövervakning av akustiska utsläpp, med biologiska analyser som utförs utanför experimentet. Det skulle dock vara relativt enkelt att ändra SAT för att möjliggöra direkt optisk observation av provkammaren via ett mikroskopmål. Detta kan i sin tur kopplas till ett fluorescens- och/eller höghastighetsmikroskopisystem för att möjliggöra observation av exempelvis läkemedelsupptag och bubbeldynamik. PCD-utgången som för närvarande presenteras när det gäller spänning indikerar: i) typerna av kavitationsbeteende och deras relativa proportioner; ii) hur länge dessa kavitationsbeteenden kvarstår; iii) Huruvida de observerade tids-kumulativa exponeringsegenskaperna är korrelerade med en viss bioeffekt. och iv) om de relativa nivåerna och tidsberoende beteenden överensstämmer med tidigare experiment i exponeringssystemet. Även om PCD:s känslighet för mottagning kan kvantifieras, krävs ytterligare rumslig information för att på ett tillförlitligt sätt karakterisera de akustiska utsläppen i form av absolut energi. Detta kan uppnås genom att ersätta PCD med en matrissond för att implementera passiv akustisk mappning (PAM)80. Detta skulle dock öka komplexiteten i signalbehandlingen och den beräkningstid och effekt som krävs.
Annan instrumentering för mätning av membranelektriell resistans eller tillämpning av fysiska inriktningsmetoder, till exempel magnetfält, skulle också kunna införlivas. Det skulle också vara möjligt att använda tredimensionella vävnadsstrukturer som tumörsfäroider, organoider eller till och med ex vivo-vävnadsprover på akustiskt "mjuka" gelsubstrat i stället för cellmonoskikten för att studera amerikanska och kavitationsmedierade effekter i mer realistiska vävnadsmiljöer.

Ultraljud (USA) har använts i stor utsträckning som en diagnostisk bildteknik på grund av dess säkra och icke-invasiva natur, dess enkla genomförande vid en patients säng och desskostnadseffektivitet 1. Bredvid sin diagnostiska och övervakande kapacitet har USA stor potential för terapeutiska applikationer. Tidigt arbete utforskade dess användning i trombolys, DNA-transfektion och läkemedelsleverans2,3,4 och terapeutiska USA representerar nu ett mycket aktivt forskningsområde, med applikationer inklusive tumörbehandling5,6,7,immunterapi8,9,blod - hjärnbarriär (BBB)störning 10,11,12, trombolys13,14,15, och bakteriell infektionsbehandling16,17. Ett nyckelfenomen som ligger till grund för dessa tillämpningar är kavitation: kärnan, tillväxten och svängningen av gasformiga håligheter på grund av förändringar ivätsketrycket 18,19.
Det finns en rad mekanismer genom vilka kavitation ger biologiska effekter. Till exempel kan den mycket icke-linjära karaktären av bubbelsvängningar under påverkan av ett applicerat amerikanskt fält generera mikroströmning i den omgivande vätskan som både kan förbättra läkemedelskonvektion20 och utöva savspänningar på vävnaden i närheten av bubblorna. Detta är särskilt vanligt när bubblor är i närheten av en gräns, vilket orsakar bubblor att svänga icke-sfäriskt, och kan potentiellt främja läkemedelsupptag genom shear-inducerad permeabilisering21,22,23,24. Vid högre tryck observeras större amplitudsvängningar och snabb bubbelkollaps, vilket ger direkt mekanisk stress25 och ofta genererar chockvågor och därav följande stora tryckgradienter som kan störa och genomsyravävnader 26,27. Kollapsen av bubblor nära en yta kan också resultera i bildandet av flytande mikrojets med hög hastighet28,29,30. Dessa mikrojets kan tränga in i vävnad, potentiellt skapa porer eller inducera sekundärastressvågor 31,32. Permeabilisering av biologiska membran vid både vävnads- och cellnivåer kallas olika sonophoresis, som främst används i samband med USA-inducerad förbättring av hudens permeabilitet33,34, och sonoporation, som främst används för att beskriva reversibel permeabilisering av cellmembranet på grund av bildandet avmembranporer 35,36.
Viskös absorption i vätskan som omedelbart omger den oscillerande bubblan kan ge en betydande uppvärmningseffekt37. Dessutom producerar de mycket icke-linjära svängningarna akustisk strålning vid frekvenser högre än det drivande amerikanska fältet. Detta leder till ökad absorption i den omgivande vävnaden och ytterligare uppvärmning38. Bubbelkollaps kan också åtföljas av kemiska effekter på grund av de övergående höga temperaturerna och trycken i bubbelkärnan, såsom generering av mycket reaktiva arter och elektromagnetisk strålning, känd som sonoluminescens32. Dessa effekter har undersökts för att bedöma potentiella skador och/eller aktivering av relevanta cellulära vägar förleverans 39 och utnyttjas i lokal aktivering av ljuskänsliga läkemedel i ett tillvägagångssätt som kallas sonodynamisk terapi40,41,42,43.
Många USA-medierade bioverk kan initieras enbart genom kontroll av amerikanska fältparametrar (tryckamporud, frekvens, pulslängd och repetitionsfrekvens och exponeringstid), men tillförlitligt generera kavitation i biologisk vävnad kräver ofta hög ingångsenergi och medför därför en förhöjd risk för skador. Införandet av exogena eller konstgjorda kavitationkärnor kan avsevärt minska den ingångsenergi som krävs för att producera det breda spektrum av effekter som diskuteras ovan och ytterligare introducerar ytterligare effekter som kanske inte är möjliga enbart med USA. Kavitationskärnor inkluderargasbubblor 26,44,flytande droppar45,46,47 och fasta partiklar48,49,50, med nanoskala kavitationskärnor som ett framväxande undersökningsområde för sina fördelar när det gäller förlängd cirkulationstid, förbättrad extravasation och långvarig kavitationsaktivitet49,51,52,53.
De vanligaste kärnorna är gasmikrobubblor (MBs), som ursprungligen användes som kontrastmedel vid diagnostisk avbildning. De är vanligtvis 1-2 mikrometer i diameter och innehåller en kärna av en gas med hög molekylvikt med låg vattenlöslighet i det omgivande mediet. Kärnan är omgiven av ett skyddande lipid-, protein- eller polymerskal som oftast består av fosfolipider54. När de exponeras för ett amerikanskt fält gör MBs komprimerbarhet att de genomgår volymetriska svängningar, vilket ger en stark akustisk spridning, vilket är ansvarigt för MBs framgång som kontrastmedel. Som nämnts leder dessa svängningar också till ovannämnda mekaniska, termiska och kemiska effekter som kan utnyttjas i terapeutiska applikationer. MB-beläggningsprocessen erbjuder också en mekanism för att kapsla in läkemedel i MB-strukturen och för att fästa droger och/eller rikta arter på MB-ytan. Denna teknik underlättar den utlösta frisättningen av läkemedel för att minska systemisktoxicitet 55. Det har också nyligen visats att material från MB-ytan kan överföras till biologiska strukturer, vilket förbättrar läkemedelstillförseln genom så kallad "sonoprinting"56,57,58.
Övervakning av USA-medierad kavitationsaktivitet kan ge insikter om de resulterande biologiska effekterna både in vitro och in vivo och potentiellt möjliggör justering och optimering av dessa effekter. De två mest tillämpade metoderna för övervakning av kavitationsaktivitet är i) optiska, som använder ultrahöghastighetsvideomikroskopi och i allmänhet inte är genomförbara in vivo; och ii) akustiska, som registrerar de återstrålade ljudfälten som produceras av oscillerande och / eller kollapsande bubblor. Både amplitud- och frekvenskomponenterna i den akustiska signalen innehåller information om bubbelbeteende. Låga koncentrationer av bubblor vid låg incident Amerikanska amplituder har visat sig ge övervägande harmoniska utsläpp (heltals multipler av körfrekvensen)59. När körtrycket ökar kan bubbelutsläppsspektrumet också innehålla fraktionerade komponenter som kallas subharmoniker och ultraharmoniker60 som indikerar starkare icke-linjärt beteende, liksom bredbandsbuller, vilket tyder på inertial kavitation. Heltalsövertoner är en primär indikator på bubbelsvängning men kan också orsakas av icke-linjäriteter var som helst i ett experimentellt system, t.ex. på grund av icke-linjär spridning. Däremot är fraktionerade övertoner och bredbandsbuller mycket starkt korrelerade med bubbeldynamik.
Förhållandet mellan bubbelbeteende och de upptäckta akustiska utsläppen kan kompliceras av faktorer som incident USA-fältet, nukleationsmiljön och egenskaperna hos detektionsvägen60. Ändå kan viktig information om bubbelbeteende och deras interaktioner med celler vinnas genom att urskilja trender i frekvens och energi i det akustiska spektrumet. Dessa data kan också ge värdefull information som kan användas för att ligga till grund för kliniska behandlingsövervakningstekniker. För att fullt ut utnyttja denna information krävs utveckling av robusta, översättbara och reproducerbara experimentella metoder.
För närvarande finns det betydande variation i rapporterade protokoll för att utforma system och genomföra studier för att stödja utvecklingen av kavitation-assisterade terapier. När det gäller apparaten har en rad designmetoder genomförts. Flera grupper har utnyttjat parallellplåtskammare56,61,62,63, antingen specialbyggda eller kommersiellt tillgängliga (t.ex. OptiCell, ThermoFisher Scientific). (2013) utvecklade en cellkammare i kombination med en amerikansk ultraljudsbehandlingsmodul och konfokal avbildning i realtid64, Carugo et al. (2015) använde ett system som består av en kommersiellt tillgänglig cellkulturrätt med ett skräddarsytt PDMS-lock för att möjliggöra nedsänkning i ett vattenbad under exponering i USA65, och Pereno et al. (2018) använde en anordning bestående av skiktade akoustofluidiska resonatorer som möjliggör samtidig optisk och akustisk karakterisering av bubbeldynamik och bubbelcellsinteraktioner66. Användningen av specialtillverkade och applikationsspecifika konstruktioner komplicerar karakteriseringen av det amerikanska fältet och andra miljöexponeringsförhållanden, vilket gör jämförelser mellan studier utmanande. Till exempel finns det betydande variation i de amerikanska parametrar som identifierats för att uppnå framgångsrik sonoporation, som inkluderar centrumfrekvenser som sträcker sig från 0,02 till 15 MHz, arbetscykler som varierar från 1% till kontinuerlig våg och sällsynta blodtryck som sträcker sig från 0,1 till 20 MPa23,64,67,68,69,70 ( Tabell1). Det finns också en liknande stor variation i de spektralkomponenter (övertoner, undertoner osv.) som har identifierats som associerade med särskilda bioverkningar.
Syftet med detta arbete är därför att tillhandahålla en lätt reproducerbar systemdesign och implementeringsram för in vitro-studier av kavitation-inducerade cellulära bioverk med specifik inkludering av en kavitationsövervakningsförmåga.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorber</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>APTFlex F28 panel</td>
			<td>1.0 cm standard thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (power)</td>
			<td>E&#38;I Ltd.</td>
			<td>1040L</td>
			<td>400W power amplifier to drive ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (pre)</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR445A</td>
			<td>Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium heater</td>
			<td>Aquael</td>
			<td>Ultra 50W</td>
			<td>Different models for different tank sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>TiePie Engineering</td>
			<td>HS5-110-XM</td>
			<td>Extended memory option: 32M points per channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>FOH</td>
			<td>0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>SonoVue</td>
			<td>FDA approved microbubbles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD mirror (SAT3)</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>F-102</td>
			<td>90 degree beam reflection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD transducer</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>V320-SU</td>
			<td>Immersion transducer, 7.5MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD waterproof cable</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>BCU-58-1 W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (SAT2 compartment lid)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer rod (SAT2 seal)</td>
			<td>Zeus</td>
			<td>PTFE monofilament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber plug (SAT3 lid/seal)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-2101</td>
			<td>6mm bottom dia., 8mm top dia., red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>33250</td>
			<td>Waveform generator for ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>&#181;-Dish 35mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT3</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Transwell 6.5mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound source (SAT3)</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>H107 with central hole</td>
			<td>Use of a HIFU-capable source allows pressures &#62;1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying cavitation enhanced therapy

Intresset för terapeutiska tillämpningar av ultraljud är betydande och växande, med potentiella kliniska mål som sträcker sig från cancer till Alzheimers sjukdom. Kavitation - bildandet och efterföljande rörelse av bubblor inom ett ultraljudsfält - representerar ett nyckelfenomen som ligger till grund för många av dessa behandlingar. Det finns dock fortfarande en betydande osäkerhet om de detaljerade verkningsmekanismer genom vilka kavitation främjar terapeutiska effekter och det finns ett behov av att utveckla tillförlitliga övervakningsmetoder som kan genomföras kliniskt. Det finns framför allt betydande variationer mellan studier av de exponeringsparametrar som rapporterats framgångsrikt ge terapeutiska effekter och motsvarande akustiska utsläpp. Syftet med detta dokument är att tillhandahålla designriktlinjer och ett experimentellt protokoll med hjälp av allmänt tillgängliga komponenter för att utföra studier av kavitation-medierade bioverk och inkludera akustisk övervakning i realtid. Förhoppningen är att protokollet ska möjliggöra ett mer utbrett införlivande av akustisk övervakning i terapeutiska ultraljudsexperiment och underlätta enklare jämförelser mellan studier av exponeringsförhållanden och deras korrelation till relevanta bioeffekter.

Figur 4 visar exempel på PCD-svar för tids- och frekvensdomäner, vilket illustrerar tre distinkta kavitationsbeteenden. Alla data samlades in på SAT3 med SonoVue MBs utspädd 5x i PBS, med en slutlig koncentration på ~2*107 MBs/ml. Temperaturen för alla exempel i detta avsnitt var 19 ± 1 °C. Den amerikanska källan kördes med en puls på 2,0 ms vid 0,5 MHz för att uppnå en högsta undertryck på 0,20 (figur 4A och 4B),0,30 (figur 4C och 4D) och 0,70 MPa (Figur 4E och 4F). Signalinspelningarna började 1,4 ms före t = 0 start av den amerikanska pulsen. De inset spåren visar signalen som inspelad (röd) och med ett 2 MHz högpassfilter (blå) för ett tidsfönster centrerat vid tidpunkten för flygningen från källa till cellexponeringsfack till PCD. Lågnivåsvaret före denna tid beror på direkt mottagen strålning från källan, vilket är vanligt i konfigurationer där PCD ligger bakom den amerikanska källan.
Vid det lägsta incidenttrycket består PCD-svaret helt av helt och hållet helt och hållet av heltals övertoner av den grundläggande amerikanska frekvensen på 0,5 MHz. Att öka från 0,20 till 0,30 MPa resulterar i uttalade ultraharmoniker i spektrumet förutom ytterligare förhöjda heltals övertoner. Tidsdomänens vågformer vid dessa två tryck ser lika ut, även om 0,30 MPa-resultaten visar mer variabilitet under pulsens varaktighet. Vid det högsta trycket har tidsdomänens vågformsamlitud vuxit olinant i förhållande till de lägre trycken till följd av tydligt förhöjt bredbandsbuller synligt i spektrumet. Detta buller anses allmänt vara ett resultat av inertial kavitation och i detta exempel motsvarar förstörelse av MBs.
För att se detta tydligare visas PCD-svar som en tidsfunktion i figur 5. I den vänstra panelen (figur 5A) visas hela spektrat under en 50 sekunders exponeringstid, under vilken källan avgav 2,0 ms pulser var 0,20 sekund. Motsvarande totala, harmoniska och bredbandskrafter visas i den högra panelen (figur 5B). USA var på aktiverat på t =3,0 s, då stora amplitud bredband svar sågs. Den första spiken tros motsvara förstörelsen av de största bubblorna i suspensionen (SonoVue är polydisperse) och är en vanlig observation i kavitationsexperiment med skalade bubblor och även med icke-avgasade medier (t.ex. PBS).
Efter några sekunder minskade bredbandsresponsen snabbt, uppenbarligen på grund av bubbelförstörelse, och signalen består huvudsakligen av övertoner. Detta tyder på att den frigjorda gasen och de återstående MBs vibrerar stabilt och icke-trögt. Vid t ~ 50-talet har bredbandskomponenten fallit till nivån för det ursprungliga bakgrundsljudet. Exponeringstester som detta är därför viktiga när man försöker förstå de tidsskalor under vilka olika bubbeleffekter kan fungera på cellerna i kammaren.
Bubblor kommer sannolikt att översättas som svar på strålningskrafter som genereras under amerikansk exponering och rörelse av MBs in och ut ur PCD-synfältet kan leda till ökad variation i den övervakade kavitationssignalen, särskilt när det gäller utspädda suspensioner. PcD:s känsliga region bör därför omfatta så mycket av cellexponeringsytan som möjligt. En jämförelse av svarsfokuserade och ofokuserade PCD med identiska mittfrekvenser (se figur 2)visas i figur 6, med en utspädning på 20:1 av MBs i normal PBS är SAT2. Tids- och provgenomsnittsspektrat i panel figur 6A visar att det ofokuserade pcd-programmet innehåller ett starkare bredbandssvar, åtföljt av minskad variabilitet mellan prov i både harmoniska (figur 6B) och ultraharmoniska krafter (figur 6C).
Det är viktigt att inse att media som används för in vitro-cellarbete inte avgasas och kan presentera en förbättrad bakgrundsnivå av bubbelaktivitet. Figur 7 visar svaret i SAT2 på PBS som används i leverantörstillhandahållna former och efter två timmars avgasning under vakuum, varefter luftmättnaden minskades från 92 % till 46 % enligt en optisk sensor (PreSens, Tyskland). Spektrat i figur 7A var genomsnittliga över exponeringstid och upprepningar med fem oberoende prover, och visar tydligt förhöjda ultraharmoniker i normala PBS. Befogenheter som summeras över tre övertoner (figur 7B) ligger väl inom standardavvikelsen för varje experimentell produktion. Däremot visar de ultraharmoniska summorna i figur 7C att normal PBS har nästan en storleksordning som är högre och betydligt högre variation mellan proverna. Dessa exempel tyder på att ett vanligt cellkompatibelt medium kan uppvisa beteenden som (felaktigt) kan tillskrivas förekomsten av MBs. Eftersom det vanligtvis är opraktiskt att avgasa odlingsmedium på grund av den negativa inverkan på celler och/eller kavitation agent stabilitet, är det viktigt att utföra lämpliga kontroller i alla kavitation-relaterade studier.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg"> Figur 1: Illustrationer av två amerikanska exponeringssystem som innehåller kavitationsövervakning: SAT3 (D-F). (A) SAT2 kommenterad montering med sidovägg borttagen för tydlighetens skull. (B) SAT2 med sidoväggen intakt. C)SAT2-cellexponeringsutrymme, demonterat. (D) SAT3 kommenterad montering. (E) SAT3 i normala (vänster) och linsade (höger) konfigurationer för balkbreddsmatchning vid olika frekvenser. (F) SAT3 cellexponeringsfack, demonterat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg"> Figur 2: Beräkningar av halv amplitudtrycksfältkonturer för 12,7 mm diameter ofokuserade (vänster) och sfäriskt fokuserade (höger) givare. Frekvenser på 2, 4 och 8 MHz visas som röda, blå respektive gröna konturer för ett PCD-element vid koordinatursprunget (0,0). De yttersta konturerna av den ofokuserade enheten är relativt okänsliga för frekvens, men den inre strukturen är frekvensberoende. Det sfäriskt fokuserade fältet kontrakterar när frekvensen ökar, men inuti konturerna varierar fälten smidigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg"> Figur 3: Instrumentering för kavitationssignalkonditionering och inspelning (blå pilar), upphetsning av amerikanska källor (röda linjer) och datainsamling utlöser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg"> Figur 4: Tid (vänster) och frekvens (höger) domän PCD-svar inspelade med MBs utspädda 5x i PBS. Incidenttoppens undertryck var (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, alla vid 0,5 MHz. Signalinspelningar börjar 1,4 ms före t =0-starten av ultraljudspulsen på 2,0 ms varaktighet. (A, C, E) Tidsdomänsignaler (röda) visas på en fast vertikal skala, vilket anger hur svarsnivån ändras med incidenttryck. De inset spåren visar signalen som inspelad (röd) och med ett 2 MHz högpassfilter (blå) för ett tidsfönster centrerat vid tidpunkten för flygningen från källa till cellexponeringsfack till PCD. (B, D, F) Ljud- och signaleffektspektrala densiteter beräknas för t<0 respektive t>0. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg"> Figur 5: Spektrumhistoria över en 50 sekunders exponering av en suspension av MBs utspädd 5x i PBS. A)Fullständiga spektra- och B-total-, harmoniska och bredbandssignalkrafter, allt som en funktion av tiden. Körförhållandena var 0,5 MHz, 0,7 MPa högsta undertryck, 2,0 ms pulsvaraktighet, 200 ms pulsrepetitionsperiod. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg"> Figur 6: Effekt av PCD-fokuseringsgeometri inspelad med en utspädning på 20:1 av mikrobubblor i normal PBS. Körförhållandena var: 1,0 MHz, 0,50 MPa högsta undertryck, 3,0 ms pulsvaraktighet, 10 ms pulsrepetitionsperiod. A)Fullständigt spektra i genomsnitt över exponeringstiden och tre oberoende provrepetitioner. B)Effekt i 3, 4 och 5 MHz övertoner och(C)effekt i 2,5, 3,5 och 4,5 MHz ultraharmoniker. Tjocka linjer är provmedel, skuggade områden anger +/- 1 standardavvikelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg"> Figur 7: Effekt av avgasade medier inspelade med PBS. A)Fullständigt spektra i genomsnitt över exponeringstid och fem oberoende provrepetitioner. B)Effekt i 3, 4 och 5 MHz övertoner och(C)effekt i 2,5, 3,5 och 4,5 MHz ultraharmoniker. Tjocka linjer är provmedel, skuggade områden anger +/- 1 standardavvikelse. Körförhållandena var 1,0 MHz, 0,50 MPa högsta undertryck, 1,0 ms pulsvaraktighet, 200 ms pulsrepetitionsperiod. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>parameter</td>
			<td>enhet</td>
			<td>minimum</td>
			<td>maximal</td>
		</tr>
<tr>
<td>frekvens</td>
			<td>megahertz</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>tryck (toppnegativ)</td>
			<td>Mpa</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>pulslängd</td>
			<td>Cykler</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>tjänstecykel</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>Cw</td>
		</tr>
<tr>
<td>exponeringstid</td>
			<td>s</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Sammanfattning av intervallet av rapporterade parametrar som underlättar sonoporation in vitro.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Cavitation Enhanced Therapy at JoVE.com

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Det presenterade experimentella protokollet kan användas för att utföra realtidsmätningar av kavitationsaktivitet i en cellkulturell anordning i syfte att möjliggöra undersökning av de villkor som krävs för framgångsrik läkemedelsleverans och/eller andra bioverkningar.

Studera kavitation förbättrad terapi

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Dessa bänk-top system design, data insamling och analys principer kan användas som en rationell grund för in vitro studie av kavitation förbättrade terapier. Våra tekniker möjliggör testning med hög genomströmning samtidigt som de kritiska experimentella attributen intervallkaitationsövervakning bevaras, att provinriktningen och kompatibiliteten kan upprepas med vanliga cellulära analysmetoder. Kavitation förbättrad terapi har flera potentiella tillämpningar, inklusive behandling av sjukdomar som cancer och stroke.Genom att bättre förstå underbyggnadsmekanismerna kan vi utveckla bättre terapier. Detta arbete ger en lätt reproducerbar systemdesign och implementeringsram för att möjliggöra forskning om en mängd olika kavitation inducerade cellulära bioeffekter. Inklusive läkemedelsleverans, sonoporation och sonoprinting.För att få ett meningsfullt resultat måste reproducerbarheten säkerställas och kontrollen för alla variabler i experimentet. Det är absolut nödvändigt att utföra alla relevanta kontroller och mäta det elektriska bruset. För beredning av systemen för akustisk transfektion avgasar fyllningsvätskan under ett tryck av 100kPa i minst två timmar för att minimera sannolikheten för kavitation i spridningsvägen.Bekräftelse med en upplöst syresond att det partiella syretrycket är under 10kPa rekommenderas. Fyll provningskammaren långsamt för att minimera återinföring av luft i den avgasade vätskan och omedelbart rensa eventuella restbubblor från givarens och medelbehållarens ytor. Låt ultraljudskällans effektförstärkare värmas upp enligt tillverkarens rekommendation så att förstärkningen och utgången är stabil med avseende på tid.Och späd kavitationsmedlet medan du försiktigt och kontinuerligt rör om för att göra en enhetlig suspension utan att fånga makrobubblor eller förstöra medlet. När du arbetar med mikrobubblor, se till att hantera dem noggrant. För SAT2-beredning, innan experimentet påbörjas, använd etanol för att sterilisera PDMs-locket.Tryck på det steriliserade locket på odlingsskålen för att bilda cellfacket och ladda en 10 milliliter spruta utrustad med en 18 gauge trubbig nål med 10 milliliter av påfyllningsvätskan. För in nålen genom ett av PDMs fyll hål och fyll långsamt kammaren medan du lutar så att makrobubblor kan komma ut genom det öppna fyllningshålet. När kammaren har fyllts, sätt in en fyra till fem millimeters polymerstång i det öppna hålet och placera enheten så att hålen är horisontella.Ta bort nålen medan du injicerar extra vätska så att luft inte dras in i kammaren och stäng fyllningshålet med en annan polymerstång. Kontrollera visuellt utrymmet efter tecken på inspädda makrobubblor och tryck in cellexponeringsutrymmet i fackhållaren. Tänk på partiklarnas flytkraft i suspension och hur deras flytkraft kommer att påverka deras kontakt med celler när de bestämmer cellexponeringsutrymmets orientering.Sänk sedan kammarlocket i horisontell vinkel för att avskräcka makrobubblor från att vila på enhetens nedsänkta delar, installera locket på toppen av kammaren. Innan du utför de experimentella mätningarna, låt suspensionen termiskt jämvikta med kammarens temperatur. Använd en fin nåltermoelement för att bekräfta att temperaturen i kammaren har stabiliserats.Om du vill övervaka experimenten i realtid, både i tids- och frekvensdomäner, startar du datainsamlingsprocessen och aktiverar ultraljudskällans enhetssignal. Använd en högspänningssond för att övervaka förstärkarens utgångssignal som driver ultraljudskällan under hela experimentet för att säkerställa att exponeringen fortsätter som förväntat. Och se till att oscilloskopet är inställt för att kompensera för sonddämpningen.Tidsdomänövervakning av den passiva kavitationsdetektorn avslöjar om signalerna är lämpliga för de aktuella instrumenteringsinställningarna och om kavitationssignalerna ses tidigare än förväntat. Frekvensdomänövervakning möjliggör analys av typen av bubbelbeteende och kan användas för att justera enhetsnivåer efter behov för att uppnå önskad cellstimulans. I denna analys, vid det lägsta incidenttrycket, bestod passiv kavitation detektor svar helt av heltal övertoner av 0,5MHz grundläggande ultraljud frekvens.Öka från 0,2 till 0,3MPa resulterade i uttalade ultra övertoner i spektrumet utöver ytterligare förhöjda heltal övertoner. Tid domän våg bildas vid dessa två tryck såg liknande även om 0.3MPa resultaten visade mer variabilitet under puls varaktigheten. Vid det högsta trycket växte tidsdomänvågens amplitud icke-linjärt i förhållande till de lägre trycken till följd av tydligt förhöjt bredbandsbuller, sannolikt på grund av inertial kavitation orsakad av mikrobubbla förstörelse.Här visas hela spektra över en 50 sekunders exponeringstid under vilken källan avgav två millisekunders pulser var 0,2 sekund. Som konstaterats i detta diagram, som illustrerar motsvarande totala harmoniska och bredbandskrafter, genererades stora amplitud bredband svar med den första spiken anses korrelera med förstörelsen av de största bubblorna. Efter några sekunder minskar bredbandsresponsen snabbt, uppenbarligen på grund av bubbelförstörelse.I denna analys med en utspädning på 20 till 1 av mikrobubblor och normal PBS visade tids- och provgenomsnittet spektra att den ofokuserade passiva kavitationsdetektorn innehöll ett starkare bredbandssvar än fokusdetektorn. Åtföljd av ett reducerat prov till provvariation i både harmoniska och ultraharmoniska krafter. Kavitation inducerade bioeffekter kan bedömas med hjälp av tekniker såsom fluorescensmikroskopi, flöde cytometri eller biologiska analyser.Detta möjliggör upprättandet av ett robust samband mellan kavitationsaktivitet och de biologiska effekterna. Denna teknik har gjort det möjligt för oss att bättre identifiera sambanden mellan bubbelbeteende och biologiska effekter som har avslöjat några potentiella nya mekanismer som ligger till grund för kavitation medierad läkemedelsleverans.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Studera Cell Rolling Trajectories på asymmetrisk Receptor Mönster

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

Utnyttjande av Plasmoniska och fotoniska kristaller nanostrukturer för förbättrade mikro-och nanopartiklar Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Endotelialiserade Mikrofluidik för att studera Mikrovaskulära Interaktioner i hematologiska sjukdomar

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Mikroflödessystem Blandare för att studera protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

En mikroflödessystem enheten för att studera flera olika stammar

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Diagnosis of Neoplasia in Barrett&#8217;s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Diagnosis of Neoplasia in BarrettÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Diagnos av neoplasi i Barretts esofagus använda Vital-dye Enhanced fluorescens avbildning

The ability to differentiate benign metaplasia in Barrett&#8217;s Esophagus (BE) from neoplasia in vivo remains difficult as both tissue types can be flat ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Syntes av guld nanopartiklar Integrerad fotokänsliga liposomer och mätning av deras mikrobubblor Kavitation på Pulse laser excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Robotic Mirror Therapy för funktionell återhämtning av hemiplegisk Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

En mikroflödessystem med Surface Mönstring för utredning Kavitation Bubble (s) -cell Interaktion och den resulterande bioeffekter vid encelliga nivå

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...