Name: complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads
Uploaded: 2020-12-09T13:00:00
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Diese Arbeit wurde durch den National Science Foundation Grant MCB-0092919 und den Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (an RJP) sowie durch den National Institutes of Health Grant GM-38740 und das Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (an JLW) unterstützt.
Das minx pre-mRNA-Substrat, das in den Spleißassays verwendet wurde, war ein freundliches Geschenk von Dr. Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA).

1. Hinweise zu den allgemeinen Verfahren
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass alle Chemikalien (Pufferkomponenten, Enzyme usw.) frei von Ribonuklease (RNase) gehalten werden. Sequester alle kommerziell gekauften Reagenzflaschen aus dem allgemeinen Laborgebrauch. Tragen Sie Handschuhe für alle Schritte des experimentellen Verfahrens. Verwenden Sie nur Gebackene Gläser und Utensilien (siehe Schritt 1.2 unten) und vorbehandelte Lösungen (siehe Schritt 1.3 unten).</li>
	<li>Alle Gläser (Becher, Kolben, Flaschen, Pipetten u...

<ol>
	<li>Hoskins, A. A., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spliceosome:+a+flexible,+reversible+macromolecular+machine.">The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine.</a> Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).</li><li>Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoproteins:+role+in+RNA+splicing.">Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing.</a> Science. 231, 1534-1539 (1986).</li><li>Lerner, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snurps+and+scyrps.">Snurps and scyrps.</a> Cell. 25, 298-300 (1981).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+in+pre-mRNA+splicing.">The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing.</a> Nature. 325, 673-678 (1987).</li><li>Hoskins, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+and+dynamic+assembly+of+single+spliceosomes.">Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes.</a> Science. 331, 1289-1295 (2011).</li><li>Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+life-cycle+in+cancer:+emerging+role+of+conventional+and+non-conventional+RNA-binding+proteins.">Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).</li><li>Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+galectin-3+as+a+factor+in+pre-mRNA+splicing.">Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).</li><li>Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+for+galectin-1+in+pre-mRNA+splicing.">Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).</li><li>Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+spliceosomal+RNAs+by+antisera+to+galectin-1+and+galectin-3.">Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3.</a> Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+incorporation+of+galectin-3+into+the+spliceosome+through+its+association+with+U1+snRNP.">A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP.</a> Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).</li><li>Fritsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+interacts+with+components+of+the+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex.</a> BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).</li><li>Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+splicing+factors+are+released+from+endogenous+complexes+during+in+vitro+pre-mRNA+splicing.">Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).</li><li>Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+glycerol+gradient+isolation+of+yeast+spliceosomes+containing+transcribed+or+synthetic+U6+snRNA.">Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA.</a> Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).</li><li>Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+post-splicing+lariat-intron+complexes.">Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes.</a> Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).</li><li>Malca, H., Shomron, N., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U1+snRNP+base+pairs+with+the+5'+splice+site+within+a+penta-snRNP+complex.">The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10S+galectin-3+-+snRNP+complex+assembles+into+active+spliceosomes.">A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes.</a> Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).</li><li>Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+proteomic+analysis+of+the+human+spliceosome.">Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome.</a> Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).</li><li>Jurica, M. S., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+splicing+complexes+to+study+structure+and+mechanism.">Capturing splicing complexes to study structure and mechanism.</a> Methods. 28, 336-345 (2002).</li><li>Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+role+of+galectins+in+pre-mRNA+splicing.">Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate-binding+protein+35.+I.+Properties+of+the+recombinant+polypeptide+and+the+individuality+of+the+domains.">Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).</li><li>Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+electrophoretic+isolation+of+splicing+complexes+containing+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles.">Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).</li><li>Barondes, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectins:+a+family+of+animal+&#946;-galactoside-binding+proteins.">Galectins: a family of animal &#946;-galactoside-binding proteins.</a> Cell. 76, 597-598 (1994).</li><li>Laing, J. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+carbohydrate+binding+protein+35+in+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex.</a> Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).</li><li>Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+nuclear+localization+study+of+galectin-1+with+other+splicing+components.">A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components.</a> Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).</li><li>Michaud, S., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATP-independent+complex+commits+pre-mRNA+to+the+mammalian+spliceosome+assembly+pathway.">An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway.</a> Genes &amp; Development. 5, 2534-2546 (1991).</li><li>Chiu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cwc25+is+a+novel+splicing+factor+required+after+Prp2+and+Yju2+to+facilitate+the+first+catalytic+reaction.">Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+Brownian+ratcheting+leads+to+pre-mRNA+remodeling+and+capture+prior+to+first-step+splicing.">Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).</li><li>Gray, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+on+splicing+of+two+monoclonal+antibodies+directed+against+the+amino-terminal+domain+of+galectin-3.">Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).</li></ol>

Dieser Bericht enthält die experimentellen Details, die einen Gal3 - U1 snRNP-Komplex dokumentieren, der auf Anti-Gal3-beschichteten Kügelchen gefangen ist, kann an prä-mRNA-Substrat binden und dieser ternäre Komplex kann die Spleißaktivität zu einem U1 snRNP-depletierten NE wiederherstellen. Gal3 ist ein Mitglied einer Familie von Proteinen, die ursprünglich auf der Grundlage seiner Galactose-spezifischen Kohlenhydratbindungsaktivität isoliert wurden23 . Frühe Immunfluoreszenz- und subze...

Die Produktion der meisten eukaryotischen Boten-RNAs (mRNAs) beinhaltet die Entfernung von Introns und die Ligatur von Exons in einem Kernprozess, der als Prä-mRNA-Spleißen bezeichnet wird1. Zwei Klassen von RNA-Protein-Komplexen (RNPs) lenken die Verarbeitung von Pre-Messenger-RNA in reife mRNA über spleißosomale Komplexe. Eine Klasse, entstehende Prä-Messenger-RNPs, wird co-transkriptionell durch die Bindung heterogener kerniger RNP-Proteine und anderer RNA-bindender Proteine, einschließlich einiger Mitglieder der SR-Familie, gebildet, was hnRNP-Komplexe ergibt2. Die zweite Klasse, Uracil-reiche kleine Kern-RNPs (U snRNPs mit U1, U2, U4, U5 und U6 snRNAs) ist mit U-spezifischen und Kernproteinen assoziiert3,4. Die U-snRNPs interagieren geordnet mit bestimmten Regionen von Pre-Messenger-RNPs in einem dynamischen Remodeling-Pfad, wenn Introns herausgeschnitten und Exons ligatiert werden, um reife mRNPs zu erzeugen5. Viele weitere Kernproteine sind an diesen Verarbeitungsereignissen beteiligt6.
Galectin-1 (Gal1) und Galectin-3 (Gal3) sind zwei Proteine, die erforderliche Faktoren im Spleißweg sind, wie Ausschöpfungs-Rekonstitutionsstudien zeigen7,8. Die Entfernung beider Galectine aus dem Spleißen kompetenter Kernextrakte (NE) schafft die Spleißosomenmontage und die Spleißaktivität frühzeitig ab. Die Zugabe von Galektin zu einem so doppelt erschöpften NE stellt beide Aktivitäten wieder her. Gal1 und Gal3 sind Komponenten aktiver Spleißosomen, wie durch spezifische Immunpräzipitation von pre-mRNA, spleißenden Zwischenprodukten und reifer mRNA durch Antiserum spezifisch für Gal1 oder Gal39 belegt wird. Wichtig ist, dass Gal3 mit endogener U-snRNA assoziiert ist, die Partikel im NORDOSTEN außerhalb des Spleißweges enthält, wie die Ausfällung von snRNPs durch Anti-Gal3-Antisera10 zeigt. Schließlich verändert das Stummschalten von Gal3 in HeLa-Zellen die Spleißmuster zahlreicher Gene11.
In NE, die vorinkubiert wurden, um vorgeformte Spleißosomen12 zu zerlegen, werden snRNPs in mehreren Komplexen gefunden, die in Glyceringradienten von 7S bis größer als 60S sedimentieren. Obwohl die Glyceringradientenfraktionierung eine gängige Technik zur Isolierung von spleißosomalen Komplexen und Komponenten ist (siehe z.B. Referenzen 13,14,15), haben wir diese Methode erweitert, indem wir spezifische Fraktionen mittels Antikörperimmunpräzipitationen charakterisieren. Eine snRNP-Sedimentation bei 10S enthält nur U1-snRNA zusammen mit Gal3. Die Immunpräzipitation der 10S-Fraktion mit Antiseren, die spezifisch für Gal3 oder U1 snRNP sind, ko-präzipitiert sowohl U1 als auch Gal3, was darauf hindeutet, dass einige der U1-snRNP-Monopartikel an Gal310 gebunden sind. Da U1 snRNP der erste Komplex ist, der in der spleißosomalen Montage an prä-mRNP bindet1,5, stellt dieser Schritt eine potenzielle Eintrittsstelle für Gal3 in den Spleißweg dar. Auf dieser Grundlage zeigten wir, dass 10S Gal3-U1 snRNP-Monopartikel, die an Anti-Gal3-haltige Kügelchen gebunden waren, die Spleißaktivität eines U1-snRNP-erschöpften NE wiederherstellten, was diesen Komplex als einen Mechanismus etablierte, durch den Gal3 in den spleißosomalen Weg rekrutiert wird16. Dies steht im Gegensatz zu Versuchen, Spleißosomen in bestimmten Stadien der Spleißreaktion zu isolieren und die damit verbundenen Faktoren zu katalogisieren17,18. In solchen Studien wird das Vorhandensein bestimmter Faktoren zu einem bestimmten Zeitpunkt festgestellt, nicht jedoch der Mechanismus, durch den sie belastet wurden.
Zuvor hatten wir die Herstellung von NE, das Spleißsubstrat, die Montage des Spleißreaktionsgemisches und die Analyse von Produkten in unserer Dokumentation der Rolle von Galectinen beim Pre-mRNA-Spleißen ausführlich beschrieben19. Wir beschreiben nun die experimentellen Verfahren zur Fraktionierung von Kernextrakten zur Erlangung einer mit Gal3 - U1 snRNP-Komplex angereicherten Fraktion und zur Immunselektion des letzteren Komplexes zur Rekonstitution der Spleißaktivität in einem U1-depletierten Kernextrakt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61990/61990fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Komplementierung der Spleißaktivität in Kernextrakt, der an U1-snRNP durch einen Gal3-U1-snRNP-Komplex auf Kügelchen abgereichert ist. (A) NE in Puffer C (NE(C)) wird mit Protein A-Sepharose-Perlen kovalent gekoppelt mit Anti-U1-SnRNP (αU1-Perlen) inkubiert. Der ungebundene Anteil ist an U1 snRNP (U1ΔNE) erschöpft. (B) NE in Puffer D (NE(D)) wird über einen 12%-32%igen Glyceringradienten durch Ultrazentrifugation fraktioniert. Fraktionen, die der 10S-Region (Fraktionen 3-5) entsprechen, werden kombiniert und mit Perlen gemischt, die kovalent mit Anti-Gal3-Antikörpern (αGal3-Perlen) gekoppelt sind. Das an die Kügelchen gebundene Material enthält ein Gal3-U1 snRNP-Monopartikel. (C) Der Gal3-U1 snRNP-Komplex aus Teil (B) wird mit U1ΔNE aus Teil (A) in einem Spleißassay unter Verwendung eines 32P-markierten MINX-Prä-mRNA-Substrats gemischt und die Zwischenprodukte und Produkte der Spleißreaktion werden durch Gelelektrophorese und Autoradiographie analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61990/61990fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-U1 snRNP</td>
			<td>The Binding Site</td>
			<td>Hu ENA-RNP #33471</td>
			<td>human autoimmune serum specific for U1 snRNP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottle top vacuum filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 431153 (0.22 &#956;m; PES 150 ml)</td>
			<td>for filtering solutions containing Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>International Equipment Company</td>
			<td>IEC Model PR-6</td>
			<td>for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-5G</td>
			<td>for treatment of water used in preparation of all solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylpimelimidate (DMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80490-5G</td>
			<td>for cross-linking antibody to Sepharose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis cell</td>
			<td>BioRad Laboratories, Inc</td>
			<td>Mini-Protean II</td>
			<td>for SDS-PAGE separation of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>411000-100ml</td>
			<td>for blocking after the cross-linking reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>HSI SE 500 Series</td>
			<td>for separating snRNAs by gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel slab dryer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Model 224</td>
			<td>for drying gel slabs for autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond ECL membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN3032D (0.2 &#956;m; 30 cm x 3 m)</td>
			<td>for immunoblotting of proteins on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer (12 x 100 &#956;l sample capacity)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Microdialyzer System 100</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer membranes (8K cutoff)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>66310</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Spartan Stores</td>
			<td>Spartan Instant Non-fat Dry Milk</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>for coupling antibody to beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2308-5mg</td>
			<td>for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td>for inhibiting ribonuclease activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker/rotator</td>
			<td>Lab Industries, Inc&#160;</td>
			<td>Labquake Shaker 400-110</td>
			<td>for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Solve</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>No. 111177</td>
			<td>scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation counter</td>
			<td>Beckman Instruments</td>
			<td>LS6000SC</td>
			<td>scintillation counter for determination of radioactivity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>speed vaccum concentrator</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SVC 100H</td>
			<td>for drying ethanol-precipitated RNA pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transphor electrophoresis unit</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>Hoefer TE Series Transphor</td>
			<td>for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads

Klassische Depletions-Rekonstitutionsexperimente deuten darauf hin, dass Galectin-3 ein erforderlicher Spleißfaktor in Kernextrakten ist. Der Mechanismus der Integration von Galectin-3 in den Spleißweg wird in diesem Artikel behandelt. Die Sedimentation von HeLa-Zellkernextrakten auf 12%-32% Glyceringradienten ergibt Fraktionen, die in einem endogenen ~10S-Partikel angereichert sind, das Galectin-3 und U1 snRNP enthält. Wir beschreiben nun ein Protokoll zur Depletion von Kernextrakten von U1 snRNP mit gleichzeitigem Verlust der Spleißaktivität. Die Spleißaktivität im U1-depletierten Extrakt kann durch das Galectin-3 - U1 snRNP-Partikel rekonstituiert werden, das auf Agaroseperlen eingeschlossen ist, kovalent gekoppelt mit Anti-Galectin-3-Antikörpern. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der galectin-3 - U1 snRNP - pre-mRNA ternäre Komplex ein funktioneller E-Komplex ist, der zu Zwischenprodukten und Produkten der Spleißreaktion führt und dass Galectin-3 durch seine Assoziation mit U1 snRNP in den Spleißweg eintritt. Das Schema der Verwendung von Komplexen, affinitäts- oder immunselektioniert auf Kügelchen zur Rekonstitution der Spleißaktivität in Extrakten, die von einem bestimmten Spleißfaktor erschöpft sind, kann allgemein auf andere Systeme anwendbar sein.

NE-depletierte U1-snRNP-Komplexe (U1ΔNE aus Abschnitt 2.2.6) und Gal3-U1-snRNP-Komplexe aus der 10S-Region des Glyceringradientenimimpräzipitats durch Anti-Gal3 (Schritt 3.2.7) wurden in einer Spleißreaktion gemischt. Dieses Reaktionsgemisch enthielt U1-snRNA (Abbildung 2A, Bahn 3) sowie das U1-spezifische Protein U1-70K (Abbildung 2B, Bahn 3). Wie erwartet, fiel der Anti-Gal3 Gal3 aus (Abbildung 2B</stro...

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Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Dieser Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur (a) Depletion von U1 snRNP aus Kernextrakten mit gleichzeitigem Verlust der Spleißaktivität; und (b) Rekonstitution der Spleißaktivität im U1-depletierten Extrakt durch Galectin-3 - U1-snRNP-Partikel, die an Perlen gebunden sind, kovalent gekoppelt mit Anti-Galectin-3-Antikörpern.

Komplementierung der Spleißaktivität durch einen Galectin-3 - U1 snRNP Komplex auf Perlen

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Forschung

Biochemie

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Herstellung von Riesenvesikeln Encapsulating Microspheres durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyse eines Ni-Schiff-Base-Komplex unter Verwendung von Bedingungen, die für Retention von säurelabilen Schutzgruppen

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisation und strukturelle Bestimmung eines Enzyms: Substratkomplex durch serielle Kristallisation in einem vielseitigen mikrofluidischen Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

Messung der Zusammensetzung von CD95 Death-Inducing Signaling Complex und Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...