Name: complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads
Uploaded: 2020-12-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע גרנט MCB-0092919 ומענק מחקר פנים-ארצי של אוניברסיטת מישיגן 09-CDFP-2001 (ל- RJP) ועל ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט GM-38740 ופרויקט MICL02455 של מישיגן AgBioResearch (ל- JLW).
מצע הקדם-mRNA של MINX ששימש בבדיקות ההסתבכות היה מתנה חביבה מד"ר סוזן ברגט (מכללת ביילור לרפואה, יוסטון, TX, ארה"ב).

1. הערות על נהלים כלליים
<ol><li>ודא כי כל הכימיקלים (רכיבי חוצץ, אנזימים, וכו ') נשמרים ללא ריבונוקלאז (RNase). לבודד את כל בקבוקי ריאגנט שנרכשו מסחרית משימוש כללי במעבדה. ללבוש כפפות לכל השלבים של ההליך הניסיוני. השתמש רק בכלי זכוכית וכלי נכי שנאפו (ראה שלב 1.2 להלן) ובפתרונות שטופלו מראש (ראה שלב 1.3 ...

<ol>
	<li>Hoskins, A. A., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spliceosome:+a+flexible,+reversible+macromolecular+machine.">The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine.</a> Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).</li><li>Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoproteins:+role+in+RNA+splicing.">Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing.</a> Science. 231, 1534-1539 (1986).</li><li>Lerner, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snurps+and+scyrps.">Snurps and scyrps.</a> Cell. 25, 298-300 (1981).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+in+pre-mRNA+splicing.">The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing.</a> Nature. 325, 673-678 (1987).</li><li>Hoskins, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+and+dynamic+assembly+of+single+spliceosomes.">Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes.</a> Science. 331, 1289-1295 (2011).</li><li>Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+life-cycle+in+cancer:+emerging+role+of+conventional+and+non-conventional+RNA-binding+proteins.">Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).</li><li>Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+galectin-3+as+a+factor+in+pre-mRNA+splicing.">Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).</li><li>Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+for+galectin-1+in+pre-mRNA+splicing.">Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).</li><li>Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+spliceosomal+RNAs+by+antisera+to+galectin-1+and+galectin-3.">Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3.</a> Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+incorporation+of+galectin-3+into+the+spliceosome+through+its+association+with+U1+snRNP.">A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP.</a> Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).</li><li>Fritsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+interacts+with+components+of+the+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex.</a> BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).</li><li>Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+splicing+factors+are+released+from+endogenous+complexes+during+in+vitro+pre-mRNA+splicing.">Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).</li><li>Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+glycerol+gradient+isolation+of+yeast+spliceosomes+containing+transcribed+or+synthetic+U6+snRNA.">Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA.</a> Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).</li><li>Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+post-splicing+lariat-intron+complexes.">Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes.</a> Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).</li><li>Malca, H., Shomron, N., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U1+snRNP+base+pairs+with+the+5'+splice+site+within+a+penta-snRNP+complex.">The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10S+galectin-3+-+snRNP+complex+assembles+into+active+spliceosomes.">A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes.</a> Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).</li><li>Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+proteomic+analysis+of+the+human+spliceosome.">Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome.</a> Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).</li><li>Jurica, M. S., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+splicing+complexes+to+study+structure+and+mechanism.">Capturing splicing complexes to study structure and mechanism.</a> Methods. 28, 336-345 (2002).</li><li>Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+role+of+galectins+in+pre-mRNA+splicing.">Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate-binding+protein+35.+I.+Properties+of+the+recombinant+polypeptide+and+the+individuality+of+the+domains.">Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).</li><li>Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+electrophoretic+isolation+of+splicing+complexes+containing+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles.">Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).</li><li>Barondes, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectins:+a+family+of+animal+&#946;-galactoside-binding+proteins.">Galectins: a family of animal &#946;-galactoside-binding proteins.</a> Cell. 76, 597-598 (1994).</li><li>Laing, J. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+carbohydrate+binding+protein+35+in+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex.</a> Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).</li><li>Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+nuclear+localization+study+of+galectin-1+with+other+splicing+components.">A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components.</a> Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).</li><li>Michaud, S., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATP-independent+complex+commits+pre-mRNA+to+the+mammalian+spliceosome+assembly+pathway.">An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway.</a> Genes &amp; Development. 5, 2534-2546 (1991).</li><li>Chiu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cwc25+is+a+novel+splicing+factor+required+after+Prp2+and+Yju2+to+facilitate+the+first+catalytic+reaction.">Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+Brownian+ratcheting+leads+to+pre-mRNA+remodeling+and+capture+prior+to+first-step+splicing.">Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).</li><li>Gray, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+on+splicing+of+two+monoclonal+antibodies+directed+against+the+amino-terminal+domain+of+galectin-3.">Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).</li></ol>

דו"ח זה מספק את הפרטים הניסיוניים המתעדים מתחם Gal3 - U1 snRNP הלכוד על חרוזים מצופים אנטי-Gal3 יכול להיקשר למצע טרום mRNA ומתחם טרנרי זה יכול לשחזר את פעילות החיבור ל- NE מרוקן U1 snRNP. Gal3 הוא חבר במשפחת חלבונים מבודדים במקור על בסיס פעילות מחייבת הפחמימות הספציפית לגלקטוז23 . מחקרי אימונופל?...

הייצור של רוב RNAs שליח eukaryotic (mRNAs) כרוך בהסרת introns וקשירה של exons בתהליך גרעיני המכונה חיבור לפני mRNA1. שני סוגים של מתחמי חלבון RNA (RNPs) מכוונים את העיבוד של RNA לפני השליח ל- mRNA בוגר באמצעות מתחמים spliceosomal. מחלקה אחת, RNPs טרום שליח המתהווה, נוצרת שיתוף תמלול על ידי כריכה של חלבונים גרעיניים הטרוגניים וחלבונים אחרים מחייבים RNA, כולל כמה מבני משפחת SR, מניב מתחמי hnRNP2. ה-RNPs הגרעיניים הקטנים העשירים בארסיל (U snRNPs עם U1, U2, U4, U5 ו-U6 snRNAs) קשורים לחלבונים ספציפיים ל-U ולחלבוני ליבה3,4. ה- snRNPs של ארה"ב מתקשרים באופן מסודר עם אזורים ספציפיים של RNPs לפני השליח במסלול שיפוץ דינמי כאשר אינטרונים נקטעים ואקסונים קשורים כדי לייצר mRNPs5 בוגרים. חלבונים גרעיניים רבים נוספים משתתפים באירועי עיבוד אלה6.
גלקטין-1 (Gal1) וגלקטין-3 (Gal3) הם שני חלבונים הנדרשים במסלול ההשתלבות כפי שמוצג על ידי מחקרי דלדול-שיקום7,8. הסרת שני הגלקטינים מליזוב תמציות גרעיניות מוסמכות (NE) מבטלת את ההרכבה המשולבת ואת פעילות ההשתלבות בשלב מוקדם. תוספת של כל גלקטין ל- NE מרוקן כפליים משחזרת את שתי הפעילויות. Gal1 ו- Gal3 הם מרכיבים של spliceosomes פעיל כפי שמעידים אימונופרציפיטציה ספציפית של טרום mRNA, שילוב ביניים, ו- mRNA בוגר על ידי אנטי-ספירום ספציפי עבור Gal1 או Gal39. חשוב לציין, Gal3 מקשר עם snRNA U אנדוגני המכיל חלקיקים ב- NE מחוץ למסלול ההשתלבות כפי שמוצג על ידי משקעים של snRNPs על ידי אנטי-Gal3 antisera10. לבסוף, השתקה של Gal3 בתאי HeLa משנה דפוסי שכפול של גנים רבים11.
ב- NE דגירה מראש כדי לפרק spliceosomes preformed12, snRNPs נמצאים במתחמים מרובים המשקעים בשיפועים גליצריל מ 7S ליותר מ 60S. למרות שבר הדרגתי גליצול היא טכניקה נפוצה לבידוד של מתחמים ורכיבים spliceosomal (ראה הפניות13,14,15 למשל), הרחבנו שיטה זו על ידי אפיון שברים ספציפיים באמצעות חיסונים נוגדנים. משקעים snRNP ב- 10S מכיל רק U1 snRNA יחד עם Gal3. אימונופרציפיטציה של שבר 10S עם אנטי-רה ספציפית עבור Gal3 או U1 snRNP שיתוף מזרז הן U1 והן Gal3 המציין כמה חלקיקים U1 snRNP קשורים Gal310. מכיוון ש- U1 snRNP הוא המתחם הראשון שנקשר ל- pre-mRNP בהרכבה spliceosomal1,5, שלב זה מייצג אתר כניסה פוטנציאלי עבור Gal3 למסלול ההשתתפות. על בסיס זה, הראינו כי 10S Gal3-U1 snRNP מונו-חלקיקים הקשורים אנטי-Gal3 המכיל חרוזים משוחזרים פעילות splicing ל- U1 snRNP מרוקן NE, הקמת מורכב זה כמנגנון אחד שבאמצעותו Gal3 מגויס לתוך המסלול spliceosomal16. זאת בניגוד לניסיונות לבודד את התרסיסים בשלבים ספציפיים בתגובת ההשתלבות ולקטלג את הגורמים הקשורים 17,18. במחקרים כאלה, נוכחותם של גורמים מסוימים בנקודת זמן כלשהי מובהר אך לא המנגנון שבאמצעותו הם נטענו.
תיארנו בעבר בפירוט את הכנת NE, את מצע ההשתלבות, את ההרכבה של תערובת התגובה המשתלבת, ואת הניתוח של מוצרים בתיעוד שלנו של תפקיד הגלקטינים ב- splicing לפני mRNA19. כעת אנו מתארים את ההליכים הניסיוניים לפירוק תמציות גרעיניות כדי להשיג שבר מועשר במתחם Gal3 - U1 snRNP ולבחירה חיסונית של המתחם האחרון כדי לחדש את פעילות ההכלאה בתמצית גרעינית מרוקנת U1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61990/61990fig01.jpg"> איור 1: תרשים סכמטי הממחיש את ההשלמה של פעילות ההצמדה בתמצית גרעינית מרוקנת מ- U1 snRNP על ידי קומפלקס Gal3-U1 snRNP על חרוזים. (A) NE במאגר C (NE(C)) הוא דגירה עם חרוזי חלבון A-Sepharose בשילוב עם נוגדי U1 snRNP (חרוזים αU1). השבר הלא מאוגד מתרוקן מ- U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE במאגר D (NE(D)) מחולק מעבר הדרגתי של 12%-32% גליצריל על-ידי אולטרה-צנטריפוגה. שברים המתאימים לאזור 10S (שברים 3-5) משולבים ומעורבבים עם חרוזים בשילוב עם נוגדנים נגד Gal3 (חרוזים αGal3). החומר הקשור החרוזים מכיל מונופרקל SnRNP 3-U1. (ג) מתחם Gal3-U1 snRNP מחלק (B) מעורבב עם U1ΔNE מחלק (A) בבדיקה משולבת באמצעות מצע קדם-mRNA של MINX עם תווית 32P והמתווכים והמוצרים של תגובת ההצמדה מנותחים על ידי אלקטרופורזה ג'ל ואוטרדיוגרפיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61990/61990fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-U1 snRNP</td>
			<td>The Binding Site</td>
			<td>Hu ENA-RNP #33471</td>
			<td>human autoimmune serum specific for U1 snRNP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottle top vacuum filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 431153 (0.22 &#956;m; PES 150 ml)</td>
			<td>for filtering solutions containing Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>International Equipment Company</td>
			<td>IEC Model PR-6</td>
			<td>for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-5G</td>
			<td>for treatment of water used in preparation of all solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylpimelimidate (DMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80490-5G</td>
			<td>for cross-linking antibody to Sepharose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis cell</td>
			<td>BioRad Laboratories, Inc</td>
			<td>Mini-Protean II</td>
			<td>for SDS-PAGE separation of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>411000-100ml</td>
			<td>for blocking after the cross-linking reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>HSI SE 500 Series</td>
			<td>for separating snRNAs by gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel slab dryer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Model 224</td>
			<td>for drying gel slabs for autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond ECL membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN3032D (0.2 &#956;m; 30 cm x 3 m)</td>
			<td>for immunoblotting of proteins on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer (12 x 100 &#956;l sample capacity)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Microdialyzer System 100</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer membranes (8K cutoff)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>66310</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Spartan Stores</td>
			<td>Spartan Instant Non-fat Dry Milk</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>for coupling antibody to beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2308-5mg</td>
			<td>for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td>for inhibiting ribonuclease activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker/rotator</td>
			<td>Lab Industries, Inc&#160;</td>
			<td>Labquake Shaker 400-110</td>
			<td>for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Solve</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>No. 111177</td>
			<td>scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation counter</td>
			<td>Beckman Instruments</td>
			<td>LS6000SC</td>
			<td>scintillation counter for determination of radioactivity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>speed vaccum concentrator</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SVC 100H</td>
			<td>for drying ethanol-precipitated RNA pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transphor electrophoresis unit</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>Hoefer TE Series Transphor</td>
			<td>for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads

ניסויים קלאסיים של דלדול-שחזור מצביעים על כך שגלקטין-3 הוא גורם שיתוף נדרש בתמציות גרעיניות. מנגנון ההשתלבות של גלקטין-3 במסלול ההשתלבות מטופל במאמר זה. משקעים של תמציות גרעיניות תא HeLa על 12%-32% שיפועי גליסול מניב שברים מועשרים חלקיק אנדוגני ~ 10S המכיל גלקטין-3 ו U1 snRNP. כעת אנו מתארים פרוטוקול לרוקן תמציות גרעיניות של U1 snRNP עם אובדן במקביל של פעילות חיבור. פעילות הצמדה בתמצית U1-מרוקנת ניתן ליישב מחדש על ידי חלקיק גלקטין-3 - U1 snRNP לכוד על חרוזי אגרוז covalented בשילוב עם נוגדנים אנטי גלקטין-3. התוצאות מצביעות על כך galectin-3 - U1 snRNP - מתחם טרנרי טרום mRNA הוא קומפלקס E פונקציונלי המוביל למתווכים ומוצרים של תגובת החיבור וכי galectin-3 נכנס למסלול החיבור באמצעות הקשר שלה עם U1 snRNP. התוכנית של שימוש במתחמים זיקה- או immuno-שנבחרו על חרוזים כדי לשחזר את פעילות ההשתתבות בתמציות מרוקן של גורם חרוז מסוים עשוי להיות ישים בדרך כלל למערכות אחרות.

NE מרוקן של U1 snRNP (U1ΔNE מסעיף 2.2.6) ו Gal3 - מתחמי SnRNP U1 מאזור 10S של שיפוע גליצריול immunoprecipitated על ידי אנטי-Gal3 (שלב 3.2.7) היו מעורבים בתגובה splicing. תערובת תגובה זו הכילה U1 snRNA (איור 2A, נתיב 3), כמו גם חלבון ספציפי U1, U1-70K (איור 2B, נתיב 3). כצפוי, האנטי-גל3 הקדים את ...

Watch this Scientific Journal Video about Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads at JoVE.com

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

מאמר זה מתאר את ההליכים הניסיוניים עבור (א) דלדול של U1 snRNP מתמציות גרעיניות, עם אובדן במקביל של פעילות splicing; ותואר (ב) שחזור של פעילות ההצמדה בתמצית U1-מרוקנת על ידי חלקיקי גלקטין-3 - U1 snRNP הקשורים חרוזים בשילוב עם נוגדנים אנטי-גלקטין-3.

השלמת פעילות התרסיס על ידי מתחם גלקטין-3 - U1 snRNP על חרוזים

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

הידרוליזה של תנאי Ni-שיף-Base מורכבים באמצעות מתאים שמירת חומצה-רָפִיף קבוצות הגנה

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

A השתנה- Hybrid מערכת אחת עבור חלבון Heteromeric מורכבות- DNA אינטראקציה מחקרים

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

התגבשות וקביעת מבנה של אנזים:קומפלקס מצע על ידי התגבשות סדרתית בשבב מיקרופלואידי רב-תכליתי

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

מדידת הרכב של CD95 מוות גרימת איתות מורכב ועיבוד של Procaspase-8 במתחם זה

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...