Name: complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads
Uploaded: 2020-12-09T13:00:00
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この研究は、国立科学財団グラントMCB-0092919とミシガン州立大学の壁内研究助成金09-CDFP-2001(RJPへ)、国立衛生研究所GM-38740とミシガンAgBioResearchプロジェクトMICL02455(JLWへ)によって支援されています。
スプライシングアッセイに使用されるMINXプレmRNA基質は、スーザン・ベルゲット博士(米国テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学)からの親切な贈り物でした。

1. 一般的な手順に関する注意事項
<ol><li>すべての化学物質(緩衝成分、酵素など)にリボヌクレアーゼ(RNase)を含めないようにしてください。一般的なラボ使用からすべての市販の試薬ボトルを購入した後遺言。実験手順のすべてのステップのために手袋を着用してください。焼き付けたガラス製品と調理器具(下記のステップ1.2を参照)と、処理済みのソリューション(下記のステップ1.3を参照)?...

<ol>
	<li>Hoskins, A. A., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spliceosome:+a+flexible,+reversible+macromolecular+machine.">The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine.</a> Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).</li><li>Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoproteins:+role+in+RNA+splicing.">Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing.</a> Science. 231, 1534-1539 (1986).</li><li>Lerner, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snurps+and+scyrps.">Snurps and scyrps.</a> Cell. 25, 298-300 (1981).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+in+pre-mRNA+splicing.">The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing.</a> Nature. 325, 673-678 (1987).</li><li>Hoskins, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+and+dynamic+assembly+of+single+spliceosomes.">Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes.</a> Science. 331, 1289-1295 (2011).</li><li>Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+life-cycle+in+cancer:+emerging+role+of+conventional+and+non-conventional+RNA-binding+proteins.">Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).</li><li>Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+galectin-3+as+a+factor+in+pre-mRNA+splicing.">Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).</li><li>Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+for+galectin-1+in+pre-mRNA+splicing.">Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).</li><li>Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+spliceosomal+RNAs+by+antisera+to+galectin-1+and+galectin-3.">Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3.</a> Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+incorporation+of+galectin-3+into+the+spliceosome+through+its+association+with+U1+snRNP.">A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP.</a> Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).</li><li>Fritsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+interacts+with+components+of+the+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex.</a> BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).</li><li>Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+splicing+factors+are+released+from+endogenous+complexes+during+in+vitro+pre-mRNA+splicing.">Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).</li><li>Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+glycerol+gradient+isolation+of+yeast+spliceosomes+containing+transcribed+or+synthetic+U6+snRNA.">Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA.</a> Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).</li><li>Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+post-splicing+lariat-intron+complexes.">Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes.</a> Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).</li><li>Malca, H., Shomron, N., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U1+snRNP+base+pairs+with+the+5'+splice+site+within+a+penta-snRNP+complex.">The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10S+galectin-3+-+snRNP+complex+assembles+into+active+spliceosomes.">A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes.</a> Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).</li><li>Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+proteomic+analysis+of+the+human+spliceosome.">Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome.</a> Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).</li><li>Jurica, M. S., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+splicing+complexes+to+study+structure+and+mechanism.">Capturing splicing complexes to study structure and mechanism.</a> Methods. 28, 336-345 (2002).</li><li>Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+role+of+galectins+in+pre-mRNA+splicing.">Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate-binding+protein+35.+I.+Properties+of+the+recombinant+polypeptide+and+the+individuality+of+the+domains.">Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).</li><li>Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+electrophoretic+isolation+of+splicing+complexes+containing+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles.">Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).</li><li>Barondes, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectins:+a+family+of+animal+&#946;-galactoside-binding+proteins.">Galectins: a family of animal &#946;-galactoside-binding proteins.</a> Cell. 76, 597-598 (1994).</li><li>Laing, J. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+carbohydrate+binding+protein+35+in+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex.</a> Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).</li><li>Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+nuclear+localization+study+of+galectin-1+with+other+splicing+components.">A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components.</a> Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).</li><li>Michaud, S., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATP-independent+complex+commits+pre-mRNA+to+the+mammalian+spliceosome+assembly+pathway.">An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway.</a> Genes &amp; Development. 5, 2534-2546 (1991).</li><li>Chiu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cwc25+is+a+novel+splicing+factor+required+after+Prp2+and+Yju2+to+facilitate+the+first+catalytic+reaction.">Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+Brownian+ratcheting+leads+to+pre-mRNA+remodeling+and+capture+prior+to+first-step+splicing.">Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).</li><li>Gray, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+on+splicing+of+two+monoclonal+antibodies+directed+against+the+amino-terminal+domain+of+galectin-3.">Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).</li></ol>

このレポートは、抗Gal3コーティングビーズに閉じ込められたGal3 - U1 snRNP複合体がmRNA前の基質に結合し、この三級複合体がU1 snRNP枯渇NEにスプライシング活性を回復させることができることを文書化する実験的詳細を提供します。.初期の免疫蛍光および細胞下分画研究は、Gal3とスプライシング機構の構成要素との関連の最初のヒントを提供した:スナンプとセリンとアルギニ?...

ほとんどの真核メッセンジャーRNA(mRNA)の生産は、プレmRNAスプライシング1と呼ばれる核プロセスにおけるイントロンの除去およびエキソンの結紮を伴う。RNA-タンパク質複合体(RRP)の2つのクラスは、プロミセソーム複合体を介して成熟mRNAにメッセンジャー前RNAの処理を指示します。1つのクラス、新生プレメッセンジャーRnPsは、異種核RNPタンパク質および他のRNA結合タンパク質の結合によって共同転写されて形成され、SRファミリーの一部のメンバーを含む、hnRNP complexes2を生じる。第2級はウラシルが豊富な小型核RnPs(U1、U2、U4、U5、およびU6 snRNAを有するU snRNPs)がU特異的およびコアタンパク質3,4に関連している。U snRNPsは、イントロンが切除され、エキソンが合わせて成熟したmRNPs5を生成するように、動的改造経路でメッセンジャー前のRnPsの特定の領域と秩序ある方法で相互作用する。これらの処理イベントには、多くの追加核タンパク質が関与する6。
ガレクチン-1(Gal1)およびガレクチン-3(Gal3)は、枯渇再構成研究で示されるように、スプライシング経路に必要な因子である2つのタンパク質である7,8。有能な核抽出物(NE)のスプライシングから両方のガレクチンを除去することは、初期の段階でスプライセソームアセンブリとスプライシング活性を廃止する。このような二重に枯渇したNEにガレクチンを加えて、両方の活動を復元します。Gal1およびGal3は、前mRNAの特異的免疫沈降法、中間体のスプライシング、およびGal1またはGal39のいずれかに対する抗血清による成熟mRNAによって証明される活性スプライセソームの成分である。重要なことに、Gal3は、抗Gal3抗sera10によるsnRNPsの沈殿によって示されるように、NEの外側のスプライシング経路に粒子を含む内因性U snRNAと関連する。最後に、HeLa細胞におけるGal3のサイレンシングは、多数の遺伝子11のスプライシングパターンを変化させる。
NEでは、プレフォームスプライセソソーム12を分解するためにインキュベートされ、snRNPは7Sから60S以上のグリセロール勾配で堆積する複数の複合体に見られる。グリセロール勾配分画は、スプライセソーム複合体および成分の分離のための一般的な技術であるが(例えば、参照13,14,15参照)、我々は抗体免疫沈降を用いて特定の画分を特徴付け、この方法を拡張した。10SのsnRNP沈積物は、Gal3と一緒にU1 snRNAのみを含む。10S分の免疫沈降は、Gal3またはU1 snRNPに特異的な抗セラを有するU1およびGal3の両方が、一部のU1 snRNPモノ粒子がGal310に結合していることを示す共沈殿する。U1 snRNPは、スプライセソームアセンブリ1,5においてmRNP前に結合する最初の複合体であるため、このステップは、Gal3がスプライシング経路に入り込む可能性のある部位を表す。これに基づき、ビーズを含む抗Gal3に結合した10S Gal3-U1 snRNPモノ粒子がU1 snRNP枯渇NEにスプライシング活性を回復し、Gal3がスプライオソーム経路16に採用される1つのメカニズムとしてこの複合体を確立することを示した。これは、スプライシング反応の特定の段階でスプライセソームを分離し、関連する因子17,18をカタログ化する試みとは対照的です。このような研究では、ある時点で特定の因子の存在が確認されるが、それらがロードされたメカニズムは確認されない。
我々は、NEの調製、スプライシング基質、スプライシング反応混合物の組立、およびプレmRNAスプライシング19におけるガレクチンの役割の文書における製品の分析について詳細に説明した。我々は、核抽出物の分画を用いて、Gal3-U1 snRNP複合体で濃縮された分画を得るための実験手順と、U1枯渇核抽出物中のスプライシング活性を再構成するための後者複合体の免疫選択について説明する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61990/61990fig01.jpg"> 図1:ビーズ上のGal3-U1 snRNP複合体によるU1 snRNPの枯渇した核抽出物におけるスプライシング活性の相補を示す模式図 (A)NEインバッファーC(NE(C)))は、プロテインA-セファローズビーズと共有結合したタンパク質A-セファローズビーズ(α1ビーズ)と結合した。非バインドの分数は U1 snRNP (U1ΔNE) の枯渇です。(B) NEインバッファーD(NE(D))は、超遠心化により12%~32%のグリセロール勾配に分画される。10S領域(画3〜5)に対応する画分は、抗Gal3抗体(αGal3ビーズ)と共有結合してビーズと組み合わされて混合される。ビーズに結合した材料には、Gal3-U1 snRNP モノ粒子が含まれています。(C)Part(B)のGal3-U1 snRNP複合体を、32P標識MINXプレmRNA基質を用いたスプライシングアッセイで第1部(A)からU1ΔNEと混合し、スプライシング反応の中間体および生成物をゲル電気泳動とオートラジオグラフィーで分析する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61990/61990fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-U1 snRNP</td>
			<td>The Binding Site</td>
			<td>Hu ENA-RNP #33471</td>
			<td>human autoimmune serum specific for U1 snRNP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottle top vacuum filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 431153 (0.22 &#956;m; PES 150 ml)</td>
			<td>for filtering solutions containing Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>International Equipment Company</td>
			<td>IEC Model PR-6</td>
			<td>for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-5G</td>
			<td>for treatment of water used in preparation of all solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylpimelimidate (DMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80490-5G</td>
			<td>for cross-linking antibody to Sepharose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis cell</td>
			<td>BioRad Laboratories, Inc</td>
			<td>Mini-Protean II</td>
			<td>for SDS-PAGE separation of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>411000-100ml</td>
			<td>for blocking after the cross-linking reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>HSI SE 500 Series</td>
			<td>for separating snRNAs by gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel slab dryer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Model 224</td>
			<td>for drying gel slabs for autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond ECL membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN3032D (0.2 &#956;m; 30 cm x 3 m)</td>
			<td>for immunoblotting of proteins on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer (12 x 100 &#956;l sample capacity)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Microdialyzer System 100</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer membranes (8K cutoff)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>66310</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Spartan Stores</td>
			<td>Spartan Instant Non-fat Dry Milk</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>for coupling antibody to beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2308-5mg</td>
			<td>for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td>for inhibiting ribonuclease activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker/rotator</td>
			<td>Lab Industries, Inc&#160;</td>
			<td>Labquake Shaker 400-110</td>
			<td>for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Solve</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>No. 111177</td>
			<td>scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation counter</td>
			<td>Beckman Instruments</td>
			<td>LS6000SC</td>
			<td>scintillation counter for determination of radioactivity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>speed vaccum concentrator</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SVC 100H</td>
			<td>for drying ethanol-precipitated RNA pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transphor electrophoresis unit</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>Hoefer TE Series Transphor</td>
			<td>for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads

従来の枯渇再構成実験は、ガレクチン-3が核抽出物に必要なスプライシング因子であることを示している。この論文では、ガレクチン-3をスプライシング経路に組み込むメカニズムについて説明する。12%~32%のグリセロール勾配に対するHeLa細胞核抽出物の沈積は、ガレクチン-3およびU1 snRNPを含む内因性〜10S粒子に富んだ分画を生み出す。我々は、スプライシング活性の伴う損失を伴うU1 snRNPの核抽出物を枯渇させるプロトコルを記述する。U1枯渇した抽出物におけるスプライシング活性は、アガロースビーズに閉じ込められたガレクチン-3-U1 snRNP粒子と抗ガレクチン-3抗体と共価的に結合することによって再構成することができる。結果は、ガレクチン-3- U1 snRNP - mRNA前三元複合体がスプライシング反応の中間体および産物につながる機能的E複合体であり、ガレクチン-3がU1 snRNPとの関連を通じてスプライシング経路に入ることを示している。特定のスプライシング因子の枯渇した抽出物におけるスプライシング活性を再構成するためにビーズ上で親和性または免疫選択された複合体を使用するスキームは、一般的に他のシステムに適用され得る。

U1 snRNP(2.2.6からU1ΔNE)とGal3-U1 snRNP複合体を欠乏させた、抗Gal3(ステップ3.2.7)によりグリセロール勾配免疫沈降した10S領域から、スプライシング反応で混合した。この反応混合物には、U1 snRNA(図2A、レーン3)、ならびにU1特異的タンパク質、U1-70K(図2B、レーン3)が含まれていた。予想通り、抗Gal3はGal3を沈殿させた(<strong class="xfig"...

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Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

この記事では、(a)核抽出物からのU1 snRNPの枯渇に関する実験的手順について説明し、それに伴うスプライシング活性の喪失について説明します。(b)ガレクチン-3-U1 snRNP粒子に結合したU1枯渇エキスにおけるスプライシング活性の再構成を抗ガレクチン-3抗体と共有結合した。

ガレクチン-3 - ビーズ上のU1 snRNP複合体によるスプライシング活性の相補

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

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酸に不安定な保護基を保持するのに適したNi-シッフ塩基錯体の使用条件の加水分解

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

異種タンパク質複合体-DNA相互作用研究のための改変酵母1ハイブリッドシステム

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

酵素の結晶化と構造決定:多用途マイクロ流体チップにおける連続結晶学による基質複合体

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

CD95死誘導シグナル複合体の組成とプロスパスパーゼ-8の処理の測定

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...