Name: complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads
Uploaded: 2020-12-09T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation Grant MCB-0092919 e Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (para RJP) e pelos Institutos Nacionais de Saúde Grant GM-38740 e Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (para JLW).
O substrato minx pré-mRNA usado nos ensaios de emenda foi um presente gentil da Dra.

1. Notas sobre procedimentos gerais
<ol><li>Certifique-se de que todos os produtos químicos (componentes tampão, enzimas, etc.) sejam mantidos livres de ribonuclease (RNase). Sequester todas as garrafas de reagente compradas comercialmente do uso geral do laboratório. Use luvas para todas as etapas do procedimento experimental. Utilize apenas vidros e utensílios assados (veja o passo 1.2 abaixo) e soluções que foram pré-tratadas (veja o passo 1.3 abaixo).</li>
	<li>Asse todos os vidros (béquers, frascos, garraf...

<ol>
	<li>Hoskins, A. A., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spliceosome:+a+flexible,+reversible+macromolecular+machine.">The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine.</a> Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).</li><li>Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoproteins:+role+in+RNA+splicing.">Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing.</a> Science. 231, 1534-1539 (1986).</li><li>Lerner, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snurps+and+scyrps.">Snurps and scyrps.</a> Cell. 25, 298-300 (1981).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+in+pre-mRNA+splicing.">The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing.</a> Nature. 325, 673-678 (1987).</li><li>Hoskins, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+and+dynamic+assembly+of+single+spliceosomes.">Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes.</a> Science. 331, 1289-1295 (2011).</li><li>Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+life-cycle+in+cancer:+emerging+role+of+conventional+and+non-conventional+RNA-binding+proteins.">Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).</li><li>Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+galectin-3+as+a+factor+in+pre-mRNA+splicing.">Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).</li><li>Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+for+galectin-1+in+pre-mRNA+splicing.">Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).</li><li>Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+spliceosomal+RNAs+by+antisera+to+galectin-1+and+galectin-3.">Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3.</a> Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+incorporation+of+galectin-3+into+the+spliceosome+through+its+association+with+U1+snRNP.">A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP.</a> Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).</li><li>Fritsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+interacts+with+components+of+the+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex.</a> BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).</li><li>Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+splicing+factors+are+released+from+endogenous+complexes+during+in+vitro+pre-mRNA+splicing.">Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).</li><li>Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+glycerol+gradient+isolation+of+yeast+spliceosomes+containing+transcribed+or+synthetic+U6+snRNA.">Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA.</a> Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).</li><li>Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+post-splicing+lariat-intron+complexes.">Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes.</a> Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).</li><li>Malca, H., Shomron, N., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U1+snRNP+base+pairs+with+the+5'+splice+site+within+a+penta-snRNP+complex.">The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10S+galectin-3+-+snRNP+complex+assembles+into+active+spliceosomes.">A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes.</a> Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).</li><li>Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+proteomic+analysis+of+the+human+spliceosome.">Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome.</a> Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).</li><li>Jurica, M. S., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+splicing+complexes+to+study+structure+and+mechanism.">Capturing splicing complexes to study structure and mechanism.</a> Methods. 28, 336-345 (2002).</li><li>Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+role+of+galectins+in+pre-mRNA+splicing.">Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate-binding+protein+35.+I.+Properties+of+the+recombinant+polypeptide+and+the+individuality+of+the+domains.">Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).</li><li>Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+electrophoretic+isolation+of+splicing+complexes+containing+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles.">Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).</li><li>Barondes, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectins:+a+family+of+animal+&#946;-galactoside-binding+proteins.">Galectins: a family of animal &#946;-galactoside-binding proteins.</a> Cell. 76, 597-598 (1994).</li><li>Laing, J. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+carbohydrate+binding+protein+35+in+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex.</a> Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).</li><li>Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+nuclear+localization+study+of+galectin-1+with+other+splicing+components.">A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components.</a> Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).</li><li>Michaud, S., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATP-independent+complex+commits+pre-mRNA+to+the+mammalian+spliceosome+assembly+pathway.">An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway.</a> Genes &amp; Development. 5, 2534-2546 (1991).</li><li>Chiu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cwc25+is+a+novel+splicing+factor+required+after+Prp2+and+Yju2+to+facilitate+the+first+catalytic+reaction.">Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+Brownian+ratcheting+leads+to+pre-mRNA+remodeling+and+capture+prior+to+first-step+splicing.">Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).</li><li>Gray, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+on+splicing+of+two+monoclonal+antibodies+directed+against+the+amino-terminal+domain+of+galectin-3.">Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).</li></ol>

Este relatório fornece os detalhes experimentais que documentam um complexo Gal3 - U1 snRNP preso em contas revestidas anti-Gal3 pode se ligar ao substrato pré-mRNA e este complexo ternário pode restaurar a atividade de emenda a um NE er. . Os estudos de imunofluorescência precoce e fracionamento subcelular forneceram o indício inicial de uma associação de Gal3 com componentes da máquina de emenda: colocalização em manchas nucleares com polipeptídeos de núcleo Sm de snRNPs e serina e a...

A produção da maioria dos RNAs (mRNAs) do mensageiro eucariótico envolve a remoção de introns e a ligadura de exons em um processo nuclear chamado de emenda pré-mRNA1. Duas classes de complexos de proteína RNA (RNPs) direcionam o processamento do RNA pré-mensageiro em mRNA maduro através de complexos spliceossômicos. Uma classe, rnps pré-mensageiro nascente, é formada co-transcrição pela vinculação de proteínas heterogêneas nucleares RNP e outras proteínas de ligação de RNA, incluindo alguns membros da família SR, produzindo complexos hnRNP2. A segunda classe, rica em uracil, pequenas RNPs nucleares (U snRNPs com U1, U2, U4, U5 e U6 snRNAs) está associada com proteínas específicas e core u3,4. Os SNRNPs da U interagem de forma ordenada com regiões específicas de RNPs pré-mensageiros em um caminho de remodelação dinâmica à medida que os introns são extirpados e exons são ligados para produzir mRNPs5 maduros. Muitas proteínas nucleares adicionais participam desses eventos de processamento6.
Galectin-1 (Gal1) e galectin-3 (Gal3) são duas proteínas que são fatores necessários na via de emenda, como mostrado pelos estudos de esgotamento-reconstituição7,8. A remoção de ambas as galectinas de emendas extratos nucleares competentes (NE) abolia a montagem de emendas e a atividade de emenda em um passo inicial. A adição de uma galectina a um NE duplamente esgotado restaura ambas as atividades. Gal1 e Gal3 são componentes de emendas ativas, evidenciadas por imunoprecipitação específica de pré-mRNA, intermediários de emenda e mRNA maduro por antiserum específico para Gal1 ou Gal39. É importante ressaltar que a Gal3 associa-se ao snRNA u endógeno contendo partículas no NE fora da via de emenda, como mostrado pela precipitação de snRNPs por anti-Gal3 antisera10. Finalmente, o silenciamento de Gal3 em células HeLa altera padrões de emenda de numerosos genes11.
No NE pré-incubado para desmontar os spliceosomes pré-formados12, snRNPs são encontrados em múltiplos complexos sedimentando em gradientes de glicerol de 7S para maiores de 60S. Embora o fracionamento do gradiente de glicerol seja uma técnica comum para o isolamento de complexos e componentes spliceossômicos (ver referências13,14,15 por exemplo), ampliamos esse método caracterizando frações específicas usando imunoprecipitações de anticorpos. Um sedimento snRNP em 10S contém apenas u1 snRNA juntamente com Gal3. A imunoprecipitação da fração 10S com antisera específica para Gal3 ou U1 snRNP co-precipita tanto u1 quanto Gal3 indicando que algumas das mon partículas do U1 snRNP estão ligadas a Gal310. Como o U1 snRNP é o primeiro complexo que se liga ao pré-mRNP em conjuntos emendasomais1,5, esta etapa representa um potencial local de entrada para Gal3 na via de emenda. Com base nisso, mostramos que as monpartículas 10S Gal3-U1 snRNP ligadas à anti-Gal3 contendo contas restauradas para um NE esgotado U1 snRNP, estabelecendo este complexo como um mecanismo pelo qual Gal3 é recrutado para o caminho emendalomal16. Isso contrasta com as tentativas de isolar os emendas em estágios específicos na reação de emenda e catalogação dos fatores associados17,18. Em tais estudos, a presença de certos fatores em algum momento é apurada, mas não o mecanismo pelo qual foram carregados.
Havia descrito anteriormente em detalhes a preparação do NE, o substrato de emenda, a montagem da mistura de reação de emenda, e a análise de produtos em nossa documentação do papel das galectinas no splicing pré-mRNA19. Descrevemos agora os procedimentos experimentais para o fracionamento de extratos nucleares para obter uma fração enriquecida no complexo Gal3 - U1 snRNP e para a imuno-seleção deste último complexo para reconstituir a atividade de emenda em um extrato nuclear esgotado pelo U1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61990/61990fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático ilustrando a complementação da atividade de emenda em extrato nuclear esgotado de U1 snRNP por um complexo de snRNP Gal3-U1 em contas. (A) NE em Buffer C (NE(C)) é incubado com contas de proteína A-Sepharose covalentemente acopladas com anti-U1 snRNP (contas αU1). A fração desvinculada está esgotada de U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE em Buffer D (NE(D)) é fracionado sobre um gradiente de glicerol de 12%-32% por ultracentrifugação. Frações correspondentes à região 10S (frações 3-5) são combinadas e misturadas com contas covalentemente acopladas com anticorpos anti-Gal3 (contas αGal3). O material ligado às contas contém uma monopartícula de SnRNP Gal3-U1. (C) O complexo de snRNP Gal3-U1 da Parte (B) é misturado com U1ΔNE da Parte (A) em um ensaio de emenda usando substrato minx pré-mRNA com 32P e os intermediários e produtos da reação de emenda são analisados por eletroforese gel e autoradiografia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61990/61990fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-U1 snRNP</td>
			<td>The Binding Site</td>
			<td>Hu ENA-RNP #33471</td>
			<td>human autoimmune serum specific for U1 snRNP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottle top vacuum filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 431153 (0.22 &#956;m; PES 150 ml)</td>
			<td>for filtering solutions containing Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>International Equipment Company</td>
			<td>IEC Model PR-6</td>
			<td>for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-5G</td>
			<td>for treatment of water used in preparation of all solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylpimelimidate (DMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80490-5G</td>
			<td>for cross-linking antibody to Sepharose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis cell</td>
			<td>BioRad Laboratories, Inc</td>
			<td>Mini-Protean II</td>
			<td>for SDS-PAGE separation of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>411000-100ml</td>
			<td>for blocking after the cross-linking reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>HSI SE 500 Series</td>
			<td>for separating snRNAs by gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel slab dryer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Model 224</td>
			<td>for drying gel slabs for autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond ECL membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN3032D (0.2 &#956;m; 30 cm x 3 m)</td>
			<td>for immunoblotting of proteins on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer (12 x 100 &#956;l sample capacity)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Microdialyzer System 100</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer membranes (8K cutoff)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>66310</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Spartan Stores</td>
			<td>Spartan Instant Non-fat Dry Milk</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>for coupling antibody to beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2308-5mg</td>
			<td>for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td>for inhibiting ribonuclease activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker/rotator</td>
			<td>Lab Industries, Inc&#160;</td>
			<td>Labquake Shaker 400-110</td>
			<td>for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Solve</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>No. 111177</td>
			<td>scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation counter</td>
			<td>Beckman Instruments</td>
			<td>LS6000SC</td>
			<td>scintillation counter for determination of radioactivity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>speed vaccum concentrator</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SVC 100H</td>
			<td>for drying ethanol-precipitated RNA pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transphor electrophoresis unit</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>Hoefer TE Series Transphor</td>
			<td>for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads

Experimentos clássicos de esgotamento-reconstituição indicam que a galectina-3 é um fator de emenda necessário em extratos nucleares. O mecanismo de incorporação da galectina-3 na via de emenda é abordado neste artigo. A sedimentação de extratos nucleares de células HeLa em 12%-32% gradientes de glicerol produz frações enriquecidas em uma partícula endógena ~10S que contém galectina-3 e U1 snRNP. Descrevemos agora um protocolo para esgotar extratos nucleares do U1 snRNP com perda concomitante de atividade de emenda. A atividade de emenda no extrato empobrecido U1 pode ser reconstituída pela partícula de galectin-3 - U1 snRNP presa em contas de agarose covalentemente acopladas com anticorpos anti-galectina-3. Os resultados indicam que o complexo ternário pré-mRNA é um complexo E funcional que leva a intermediários e produtos da reação de emenda e que a galectina-3 entra no caminho de emenda através de sua associação com o U1 snRNP. O esquema de utilização de complexos de afinidade ou imuno-selecionados em contas para reconstituir a atividade de emenda em extratos esgotados de um fator de emenda específico pode ser geralmente aplicável a outros sistemas.

NE esgotado de U1 snRNP (U1ΔNE da Seção 2.2.6) e Gal3 - U1 snRNP complexos da região 10S do gradiente de glicerol imunoprecipitado por anti-Gal3 (passo 3.2.7) foram misturados em uma reação de emenda. Esta mistura de reação continha U1 snRNA (Figura 2A, pista 3), bem como a proteína específica U1, U1-70K (Figura 2B, pista 3). Como esperado, o anti-Gal3 precipitou Gal3 (Figura 2B, pista 3)....

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Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Este artigo descreve os procedimentos experimentais para (a) esgotamento do U1 snRNP a partir de extratos nucleares, com perda concomitante de atividade de emenda; e (b) reconstituição da atividade de emenda no extrato empobrecido U1 por partículas de galectina-3 - U1 snRNP ligadas a contas covalentemente acopladas a anticorpos anti-galectina-3.

Complementação da Atividade de Emenda por um Complexo Galectin-3 - U1 snRNP on Beads

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

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Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

A hidrólise de um Ni-base de Schiff complexa usando condies adequadas para a retenção dos grupos protectores ácido-lábil

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Cristalização e Determinação Estrutural de uma Enzima:Complexo de Substrato por Cristalografia Serial em um Chip Microfluido Versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

Medição da Composição do Complexo de Sinalização e Processamento de Indução de Morte CD95 de Procaspase-8 neste Complexo

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...