Name: complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads
Uploaded: 2020-12-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Национального научного фонда MCB-0092919 и грантом Мичиганского государственного университета 09-CDFP-2001 (для RJP) и грантом Национальных институтов здравоохранения GM-38740 и Мичиганским agBioResearch Project MICL02455 (для JLW).
Субстрат MINX пре-мРНК, используемый в анализах сплайсинга, был добрым подарком от доктора Сьюзан Бергет (Медицинский колледж Бейлора, Хьюстон, Техас, США).

1. Примечания по общим процедурам
<ol><li>Убедитесь, что все химические вещества (буферные компоненты, ферменты и т. д.) не содержат рибонуклеазы (РНКазы). Изолируйте все коммерчески приобретенные бутылки с реагентами от общего лабораторного использования. Надевайте перчатки на все этапы э...

<ol>
	<li>Hoskins, A. A., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spliceosome:+a+flexible,+reversible+macromolecular+machine.">The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine.</a> Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).</li><li>Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoproteins:+role+in+RNA+splicing.">Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing.</a> Science. 231, 1534-1539 (1986).</li><li>Lerner, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snurps+and+scyrps.">Snurps and scyrps.</a> Cell. 25, 298-300 (1981).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+in+pre-mRNA+splicing.">The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing.</a> Nature. 325, 673-678 (1987).</li><li>Hoskins, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+and+dynamic+assembly+of+single+spliceosomes.">Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes.</a> Science. 331, 1289-1295 (2011).</li><li>Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+life-cycle+in+cancer:+emerging+role+of+conventional+and+non-conventional+RNA-binding+proteins.">Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).</li><li>Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+galectin-3+as+a+factor+in+pre-mRNA+splicing.">Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).</li><li>Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+for+galectin-1+in+pre-mRNA+splicing.">Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).</li><li>Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+spliceosomal+RNAs+by+antisera+to+galectin-1+and+galectin-3.">Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3.</a> Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+incorporation+of+galectin-3+into+the+spliceosome+through+its+association+with+U1+snRNP.">A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP.</a> Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).</li><li>Fritsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+interacts+with+components+of+the+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex.</a> BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).</li><li>Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+splicing+factors+are+released+from+endogenous+complexes+during+in+vitro+pre-mRNA+splicing.">Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).</li><li>Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+glycerol+gradient+isolation+of+yeast+spliceosomes+containing+transcribed+or+synthetic+U6+snRNA.">Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA.</a> Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).</li><li>Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+post-splicing+lariat-intron+complexes.">Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes.</a> Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).</li><li>Malca, H., Shomron, N., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U1+snRNP+base+pairs+with+the+5'+splice+site+within+a+penta-snRNP+complex.">The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10S+galectin-3+-+snRNP+complex+assembles+into+active+spliceosomes.">A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes.</a> Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).</li><li>Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+proteomic+analysis+of+the+human+spliceosome.">Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome.</a> Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).</li><li>Jurica, M. S., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+splicing+complexes+to+study+structure+and+mechanism.">Capturing splicing complexes to study structure and mechanism.</a> Methods. 28, 336-345 (2002).</li><li>Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+role+of+galectins+in+pre-mRNA+splicing.">Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate-binding+protein+35.+I.+Properties+of+the+recombinant+polypeptide+and+the+individuality+of+the+domains.">Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).</li><li>Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+electrophoretic+isolation+of+splicing+complexes+containing+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles.">Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).</li><li>Barondes, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectins:+a+family+of+animal+&#946;-galactoside-binding+proteins.">Galectins: a family of animal &#946;-galactoside-binding proteins.</a> Cell. 76, 597-598 (1994).</li><li>Laing, J. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+carbohydrate+binding+protein+35+in+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex.</a> Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).</li><li>Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+nuclear+localization+study+of+galectin-1+with+other+splicing+components.">A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components.</a> Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).</li><li>Michaud, S., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATP-independent+complex+commits+pre-mRNA+to+the+mammalian+spliceosome+assembly+pathway.">An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway.</a> Genes &amp; Development. 5, 2534-2546 (1991).</li><li>Chiu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cwc25+is+a+novel+splicing+factor+required+after+Prp2+and+Yju2+to+facilitate+the+first+catalytic+reaction.">Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+Brownian+ratcheting+leads+to+pre-mRNA+remodeling+and+capture+prior+to+first-step+splicing.">Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).</li><li>Gray, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+on+splicing+of+two+monoclonal+antibodies+directed+against+the+amino-terminal+domain+of+galectin-3.">Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).</li></ol>

В этом отчете представлены экспериментальные детали, которые документируют комплекс Gal3 - U1 snRNP, захваченный на бусинах, покрытых анти-Gal3, может связываться с субстратом пре-мРНК, и этот троичный комплекс может восстанавливать активность сплайсинга к обедненному U1 snRNP NE. Gal3 является одни?...

Производство большинства эукариотических мессенджерных РНК (мРНК) включает удаление интронов и лигирование экзонов в ядерном процессе, называемом сплайсингом премрнК1. Два класса РНК-белковых комплексов (RNP) направляют обработку пре-мессенджерной РНК в зрелую мРНК через сплайсеосомальные комплексы. Один класс, зарождающиеся предмаршированные RNP, образуется котранскрипционно путем связывания гетерогенных ядерных белков RNP и других РНК-связывающих белков, включая некоторых членов семейства SR, давая комплексы hnRNP2. Второй класс, богатый урацилом малые ядерные RNP (U snRNP с U1, U2, U4, U5 и U6 snRNAs) связан с U-специфическими и основными белками3,4. U snRNP взаимодействуют упорядоченным образом с определенными областями предмарш-мессенджерных RNP в динамическом пути ремоделирования, поскольку интроны иссекаются, а экзоны лигируются для получения зрелых mRNPs5. Многие дополнительные ядерные белки участвуют в этих событиях обработки6.
Галектин-1 (Gal1) и галектин-3 (Gal3) являются двумя белками, которые являются необходимыми факторами в пути сплайсинга, как показано исследованиями истощения-восстановления7,8. Удаление обоих галектинов из сращивания компетентных ядерных экстрактов (NE) отменяет сплайсеосомную сборку и сплайсинговую деятельность на ранней стадии. Добавление любого галектина к такому вдвойне истощенному NE восстанавливает обе активности. Gal1 и Gal3 являются компонентами активных сплайсеосом, о чем свидетельствует специфическая иммунопреципитация пре-мРНК, сплайсинговых промежуточных продуктов и зрелой мРНК антисывороткой, специфичной для Gal1 или Gal39. Важно отметить, что Gal3 ассоциируется с эндогенной U snRNA, содержащей частицы в NE вне пути сплайсинга, как показано осаждением snRNP анти-Gal3 antisera10. Наконец, глушение Gal3 в клетках HeLa изменяет паттерны сплайсинга многочисленных генов11.
В NE, предварительно инкубированном для разборки предварительно сформированных сплайсеосом12, snRNP обнаруживаются в нескольких комплексах, осажденных в градиентах глицерина от 7S до более 60S. Хотя фракционирование градиента глицерина является распространенным методом выделения сплайсеосомальных комплексов и компонентов (см., например, ссылки13,14,15), мы расширили этот метод, охарактеризовав специфические фракции с использованием иммунопреципитаций антител. SnRNP осадок при 10S содержит только U1 snRNA вместе с Gal3. Иммунопреципитация фракции 10S с антисыворотки, специфичной для Gal3 или U1 snRNP, осаждает как U1, так и Gal3, указывая на то, что некоторые из моночастиц U1 snRNP связаны с Gal310. Поскольку U1 snRNP является первым комплексом, который связывается с pre-mRNP в сплайсеосомальной сборке1,5, этот шаг представляет собой потенциальный входной участок для Gal3 в путь сплайсинга. На этой основе мы показали, что моночастицы 10S Gal3-U1 snRNP, связанные с бусинами, содержащими анти-Gal3, восстанавливают активность сплайсинга к U1 snRNP истощенной NE, устанавливая этот комплекс как один механизм, с помощью которого Gal3 набирается в сплайсеосомальный путь16. Это контрастирует с попытками выделения сплайсеосом на определенных этапах реакции сплайсинга и каталогизации связанных с ними факторов17,18. В таких исследованиях констатируется наличие определенных факторов в какой-то момент времени, но не механизм, с помощью которого они были загружены.
Ранее мы подробно описали подготовку NE, сплайсинговую подложку, сборку реакционной смеси сплайсинга и анализ продуктов в нашей документации о роли галектинов в сплайсинге премрнК19. Теперь описаны экспериментальные процедуры фракционирования ядерных экстрактов для получения фракции, обогащенной комплексом SnRNP Gal3 - U1, и иммуноотбора последнего комплекса для восстановления сплайсинговой активности в ядерном экстракте, обедненном U1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61990/61990fig01.jpg"> Рисунок 1: Принципиальная диаграмма, иллюстрирующая дополнение сплайсинговой активности в ядерном экстракте, обедненном U1 snRNP комплексом Gal3-U1 snRNP на шариках. (A) NE в буфере C (NE(C)) инкубируют с белком A-Sepharose бусинами, ковалентно связанными с анти-U1 snRNP (бусины αU1). Несвязанная фракция обедняется U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE в буфере D (NE(D)) фракционируют по 12%-32% градиенту глицерина путем ультрацентрифугирования. Фракции, соответствующие области 10S (фракции 3-5), объединяют и смешивают с бусинами, ковалентно связанными с антителами против Gal3 (шарики αGal3). Материал, связанный с шариками, содержит моночастицу Gal3-U1 snRNP. (C) Комплекс SnRNP Gal3-U1 из части (B) смешивают с U1ΔNE из части (A) в сплайсинговом анализе с использованием 32P-меченого субстрата MINX pre-mRNA, а промежуточные продукты и продукты реакции сплайсинга анализируют с помощью гелевого электрофореза и ауторадиографии. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61990/61990fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-U1 snRNP</td>
			<td>The Binding Site</td>
			<td>Hu ENA-RNP #33471</td>
			<td>human autoimmune serum specific for U1 snRNP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottle top vacuum filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 431153 (0.22 &#956;m; PES 150 ml)</td>
			<td>for filtering solutions containing Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>International Equipment Company</td>
			<td>IEC Model PR-6</td>
			<td>for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-5G</td>
			<td>for treatment of water used in preparation of all solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylpimelimidate (DMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80490-5G</td>
			<td>for cross-linking antibody to Sepharose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis cell</td>
			<td>BioRad Laboratories, Inc</td>
			<td>Mini-Protean II</td>
			<td>for SDS-PAGE separation of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>411000-100ml</td>
			<td>for blocking after the cross-linking reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>HSI SE 500 Series</td>
			<td>for separating snRNAs by gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel slab dryer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Model 224</td>
			<td>for drying gel slabs for autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond ECL membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN3032D (0.2 &#956;m; 30 cm x 3 m)</td>
			<td>for immunoblotting of proteins on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer (12 x 100 &#956;l sample capacity)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Microdialyzer System 100</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer membranes (8K cutoff)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>66310</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Spartan Stores</td>
			<td>Spartan Instant Non-fat Dry Milk</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>for coupling antibody to beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2308-5mg</td>
			<td>for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td>for inhibiting ribonuclease activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker/rotator</td>
			<td>Lab Industries, Inc&#160;</td>
			<td>Labquake Shaker 400-110</td>
			<td>for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Solve</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>No. 111177</td>
			<td>scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation counter</td>
			<td>Beckman Instruments</td>
			<td>LS6000SC</td>
			<td>scintillation counter for determination of radioactivity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>speed vaccum concentrator</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SVC 100H</td>
			<td>for drying ethanol-precipitated RNA pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transphor electrophoresis unit</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>Hoefer TE Series Transphor</td>
			<td>for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads

Классические эксперименты по истощению-восстановлению показывают, что галектин-3 является обязательным фактором сплайсинга в ядерных экстрактах. Механизм включения галектина-3 в сплайсинговый путь рассматривается в данной работе. Осаждение клеточных ядерных экстрактов HeLa на 12%-32% градиентах глицерина дает фракции, обогащенные эндогенной частицей ~10S, содержащей галектин-3 и U1 snRNP. Теперь мы описываем протокол для истощения ядерных экстрактов U1 snRNP с сопутствующей потерей сплайсинговой активности. Сплайсинговая активность в U1-истощенном экстракте может быть восстановлена частицей snRNP галектина-3 - U1, захваченной на бусинах агарозы, ковалентно связанной с антителами против галектина-3. Результаты показывают, что троичный комплекс галектин-3 - U1 snRNP - пре-мРНК является функциональным комплексом Е, приводящим к промежуточным продуктам и продуктам реакции сплайсинга, и что галектин-3 попадает в путь сплайсинга через его ассоциацию с U1 snRNP. Схема использования комплексов аффинно- или иммуно-, выбранных на шариках, для восстановления сплайсинговой активности в экстрактах, обедненных специфическим фактором сплайсинга, может быть в целом применима к другим системам.

NE, обедненные комплексами U1 snRNP (U1ΔNE из раздела 2.2.6) и Gal3 - U1 snRNP из области 10S градиента глицерина, иммунопреципитированного анти-Gal3 (стадия 3.2.7), смешивали в реакции сплайсинга. Эта реакционная смесь содержала u1 snRNA (рисунок 2A, полоса 3), а также U1-специфичес?...

Watch this Scientific Journal Video about Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads at JoVE.com

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

В данной статье описаны экспериментальные процедуры для (а) истощения U1 snRNP из ядерных экстрактов с сопутствующей потерей сплайсинговой активности; и (b) восстановление сплайсинговой активности в U1-обедненном экстракте частицами snRNP галектина-3-U1, связанными с ковалентно связанными с анти-галектин-3 антителами.

Комплементация сплайсинговой активности комплексом Галектин-3 - U1 snRNP на бусинах

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Получение гигантских пузырьках Encapsulating микросферы Центрифугирование эмульсии вода-в-масле

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Гидролиз Ni-Шифф-Base комплекс Использование Условия Пригодные для удержания кислотно-лабильных защитных групп

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Модифицированная дрожжевая гибридная система для исследований комплексных ДНК-гетерогенных белков

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting анализ перевода инициации комплекс формирования на Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Кристаллизация и структурное определение фермента: Субстратный комплекс по серийной кристаллографии в универсальном микрофлюидной чипе

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

Измерение состава CD95 Индуцирующего Смерть Сигнального Комплекса и Обработка Прокаспазы-8 в этом Комплексе

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...