Name: complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads
Uploaded: 2020-12-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads at JoVE.com

Bu çalışma National Science Foundation Grant MCB-0092919 ve Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (RJP'ye) ve National Institutes of Health Grant GM-38740 ve Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (JLW'ye) tarafından desteklenmiştir.
Birleştirme testlerinde kullanılan MINX pre-mRNA substratı, Dr. Susan Berget'in (Baylor College of Medicine, Houston, TX, ABD) nazik bir hediyesiydi.

1. Genel prosedürlerle ilgili notlar
<ol><li>Tüm kimyasalların (tampon bileşenleri, enzimler vb.) ribonikülazdan (RNaz) arındırılmış olduğundan emin olun. Sequester, genel laboratuvar kullanımından ticari olarak satın alınan reaktif şişelerin tümü. Deneysel prosedürün tüm adımları için eldiven giyin. Yalnızca pişirilmiş cam eşyalar ve mutfak eşyaları kullanın (aşağıdaki adım 1.2'ye bakın) ve önceden işlenmiş çözümleri kullanın (aşağıdaki adım 1.3'e bakın).</li>
	<li>Tüm...

<ol>
	<li>Hoskins, A. A., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spliceosome:+a+flexible,+reversible+macromolecular+machine.">The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine.</a> Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).</li><li>Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+nuclear+ribonucleoproteins:+role+in+RNA+splicing.">Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing.</a> Science. 231, 1534-1539 (1986).</li><li>Lerner, M., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snurps+and+scyrps.">Snurps and scyrps.</a> Cell. 25, 298-300 (1981).</li><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles+in+pre-mRNA+splicing.">The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing.</a> Nature. 325, 673-678 (1987).</li><li>Hoskins, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordered+and+dynamic+assembly+of+single+spliceosomes.">Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes.</a> Science. 331, 1289-1295 (2011).</li><li>Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+life-cycle+in+cancer:+emerging+role+of+conventional+and+non-conventional+RNA-binding+proteins.">Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).</li><li>Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+galectin-3+as+a+factor+in+pre-mRNA+splicing.">Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).</li><li>Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+role+for+galectin-1+in+pre-mRNA+splicing.">Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).</li><li>Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoprecipitation+of+spliceosomal+RNAs+by+antisera+to+galectin-1+and+galectin-3.">Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3.</a> Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+incorporation+of+galectin-3+into+the+spliceosome+through+its+association+with+U1+snRNP.">A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP.</a> Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).</li><li>Fritsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectin-3+interacts+with+components+of+the+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex.</a> BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).</li><li>Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+splicing+factors+are+released+from+endogenous+complexes+during+in+vitro+pre-mRNA+splicing.">Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing.</a> Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).</li><li>Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+glycerol+gradient+isolation+of+yeast+spliceosomes+containing+transcribed+or+synthetic+U6+snRNA.">Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA.</a> Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).</li><li>Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+post-splicing+lariat-intron+complexes.">Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes.</a> Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).</li><li>Malca, H., Shomron, N., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U1+snRNP+base+pairs+with+the+5'+splice+site+within+a+penta-snRNP+complex.">The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).</li><li>Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+10S+galectin-3+-+snRNP+complex+assembles+into+active+spliceosomes.">A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes.</a> Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).</li><li>Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+proteomic+analysis+of+the+human+spliceosome.">Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome.</a> Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).</li><li>Jurica, M. S., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+splicing+complexes+to+study+structure+and+mechanism.">Capturing splicing complexes to study structure and mechanism.</a> Methods. 28, 336-345 (2002).</li><li>Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+the+role+of+galectins+in+pre-mRNA+splicing.">Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing.</a> Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate-binding+protein+35.+I.+Properties+of+the+recombinant+polypeptide+and+the+individuality+of+the+domains.">Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).</li><li>Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+electrophoretic+isolation+of+splicing+complexes+containing+U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+particles.">Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).</li><li>Barondes, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galectins:+a+family+of+animal+&#946;-galactoside-binding+proteins.">Galectins: a family of animal &#946;-galactoside-binding proteins.</a> Cell. 76, 597-598 (1994).</li><li>Laing, J. G., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+carbohydrate+binding+protein+35+in+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+complex.">Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex.</a> Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).</li><li>Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+nuclear+localization+study+of+galectin-1+with+other+splicing+components.">A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components.</a> Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).</li><li>Michaud, S., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATP-independent+complex+commits+pre-mRNA+to+the+mammalian+spliceosome+assembly+pathway.">An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway.</a> Genes &amp; Development. 5, 2534-2546 (1991).</li><li>Chiu, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cwc25+is+a+novel+splicing+factor+required+after+Prp2+and+Yju2+to+facilitate+the+first+catalytic+reaction.">Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).</li><li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+Brownian+ratcheting+leads+to+pre-mRNA+remodeling+and+capture+prior+to+first-step+splicing.">Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).</li><li>Gray, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+on+splicing+of+two+monoclonal+antibodies+directed+against+the+amino-terminal+domain+of+galectin-3.">Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).</li></ol>

Bu rapor, Anti-Gal3 kaplı boncuklara sıkışmış bir Gal3 - U1 snRNP kompleksinin mRNA öncesi substrata bağlanabileceğini ve bu üçlü kompleksin bir U1 snRNP tükenmiş NE'ye birleştirme aktivitesini geri getirebileceğini belgeleyen deneysel ayrıntıları sağlar. Gal3, başlangıçta galaktoza özgü karbonhidrat bağlayıcı aktivitesine dayanarak izole edilmiş bir protein ailesinin bir üyesidir23 . Erken immünoresans ve hücre altı fraksiyonasyon çalışmaları Gal3'ün birleşt...

Çoğu ökaryotik haberci RNA'larının (mRNA' lar) üretimi, mRNA öncesi birleştirme1 olarak adlandırdığı nükleer bir süreçte intronların kaldırılmasını ve eksonların ligasyonunu içerir. İki sınıf RNA-protein kompleksi (RNP), haberci öncesi RNA'nın işlenmesini spliceosomal kompleksler aracılığıyla olgun mRNA'ya yönlendiriyor. Bir sınıf, nascent pre-messenger RNPs, heterojen nükleer RNP proteinlerinin ve SR ailesinin bazı üyeleri de dahil olmak üzere diğer RNA bağlayıcı proteinlerin bağlanmasıyla eş transkripsiyonal olarak oluşturulur ve hnRNP kompleksleri verir2. İkinci sınıf, urasil bakımından zengin küçük nükleer RNP'ler (U1, U2, U4, U5 ve U6 snRNA'ları olan U snRNP'ler) U spesifik ve çekirdek proteinlerle ilişkilidir3,4. U snRNP'ler, intronlar eksize edildikçe ve exonlar olgun mRNPs5 üretmek için bağlandıkça dinamik bir yeniden şekillendirme yolunda haberci öncesi RNP'lerin belirli bölgeleriyle düzenli bir şekilde etkileşime girer. Bu işleme etkinliklerine birçok ek nükleer protein katılır6.
Galectin-1 (Gal1) ve galectin-3 (Gal3), tükenme-rekonsepsiyon çalışmalarında gösterildiği gibi birleştirme yolunda gerekli faktörler olan iki proteindir7,8. Her iki galektin de yetkin nükleer özlerin (NE) bir araya getirilmesi, spliceosome montajını ve birleştirme aktivitesini erken bir adımda ortadan kaldırır. Böyle iki kat tükenmiş bir NE'ye galektin eklenmesi her iki aktiviteyi de geri yükler. Gal1 ve Gal3, gal1 veya Gal39'a özgü antiserum tarafından pre-mRNA, birleştirme araları ve olgun mRNA'nın spesifik immün önkupitasyonu ile kanıtlanan aktif spliceosomes bileşenleridir. Daha da önemlisi, Gal3 anti-Gal3 antisera10 tarafından snRNP'lerin çökeltme gösterdiği gibi, birleştirme yolunun dışındaki NE'de parçacıklar içeren endojen U snRNA ile ilişkilidir. Son olarak, Gal3'ün HeLa hücrelerinde susturrulma, çok sayıda genin birleştirme kalıplarını değiştirir11.
Önceden biçimlendirilmiş spliceosomes12'yi sökmek için önceden inkübe edilen NE'de, snRNP'ler 7S'ten 60S'den büyük gliserol gradyanlarında çökelen birden fazla komplekste bulunur. Gliserol gradyan fraksiyonasyonu spliceosomal komplekslerin ve bileşenlerin izolasyonu için yaygın bir teknik olmasına rağmen (örneğin referanslar13,14,15), antikor immün önkupektasyonları kullanarak belirli fraksiyonları karakterize ederek bu yöntemi genişlettik. 10S'te çökeltici bir snRNP, Gal3 ile birlikte yalnızca U1 snRNA içerir. Gal3 veya U1 snRNP'ye özgü antisera ile 10S fraksiyonunun immünopipitasyonu, U1 SnRNP monopartiküllerinin bazılarının Gal310'a bağlı olduğunu gösteren hem U1 hem de Gal3'ü hızlandırır. U1 snRNP, spliceosomal derleme1,5'te mRNP öncesine bağlanan ilk kompleks olduğundan, bu adım Gal3 için birleştirme yoluna olası bir giriş alanını temsil eder. Bu temelde, boncuk içeren anti-Gal3'e bağlı 10S Gal3-U1 snRNP monopartiküllerinin, bir U1 snRNP tükenmiş NE'ye birleştirme aktivitesini geri yüklediğini ve bu kompleksi Gal3'ün spliceosomal yola alındığı bir mekanizma olarak kurduğunu gösterdik16. Bu, spliceosomes'ı birleştirme reaksiyonunda belirli aşamalarda izole etme ve ilişkili faktörleri kataloglama girişimleriyle tezat oluşturur17,18. Bu tür çalışmalarda, belirli faktörlerin bir zaman noktasında varlığı tespit edilir, ancak yüklendikleri mekanizma tespit edilir.
Daha önce NE'nin hazırlanmasını, birleştirme alt tabakasını, birleştirme reaksiyon karışımının montajını ve galektinlerin mRNA öncesi birleştirmedeki rolünü belgelememizde ürünlerin analizini ayrıntılı olarak anlatmıştık19. Gal3 - U1 snRNP kompleksinde zenginleştirilmiş bir fraksiyon elde etmek ve U1 tükenmiş bir nükleer özünde birleştirme aktivitesini yeniden inşa etmek için ikinci kompleksin immün seçimi için nükleer özlerin fraksiyonasyonu için deneysel prosedürleri açıklıyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61990/61990fig01.jpg"> Şekil 1: U1 snRNP'nin yontma nükleer ekstresindeki birleştirme aktivitesinin boncuklar üzerinde bir Gal3-U1 snRNP kompleksi tarafından tamamlanacağını gösteren şematik diyagram. (A) Tampon C'deki NE (NE(C)), protein A-Sepharose boncukları ile kovalent olarak anti-U1 snRNP (αU1 boncuklar) ile birleştirilmiş olarak inkübe edilir. İlişkisiz kesir U1 snRNP (U1ΔNE) tükendi. (B) Tampon D'deki NE (NE(D)), ultrasantrifüjleme ile %12-%32 gliserol gradyanı üzerinden kesirlenmiştir. 10S bölgesine karşılık gelen fraksiyonlar (fraksiyonlar 3-5) birleştirilir ve anti-Gal3 antikorları (αGal3 boncuklar) ile birlikte yaygın olarak boncuklarla karıştırılır. Boncuklara bağlı malzeme bir Gal3-U1 snRNP monopartikül içerir. (C) Parça (B)'den Gal3-U1 snRNP kompleksi, 32P etiketli MINX pre-mRNA substratı kullanılarak bir birleştirme testinde Parçadan (A) U1ΔNE ile karıştırılır ve birleştirme reaksiyonunun ara maddeleri ve ürünleri jel elektroforezi ve otoradyografi ile analiz edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61990/61990fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-U1 snRNP</td>
			<td>The Binding Site</td>
			<td>Hu ENA-RNP #33471</td>
			<td>human autoimmune serum specific for U1 snRNP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottle top vacuum filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning 431153 (0.22 &#956;m; PES 150 ml)</td>
			<td>for filtering solutions containing Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>International Equipment Company</td>
			<td>IEC Model PR-6</td>
			<td>for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>159220-5G</td>
			<td>for treatment of water used in preparation of all solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethylpimelimidate (DMP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>80490-5G</td>
			<td>for cross-linking antibody to Sepharose beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis cell</td>
			<td>BioRad Laboratories, Inc</td>
			<td>Mini-Protean II</td>
			<td>for SDS-PAGE separation of proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>411000-100ml</td>
			<td>for blocking after the cross-linking reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>HSI SE 500 Series</td>
			<td>for separating snRNAs by gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gel slab dryer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Model 224</td>
			<td>for drying gel slabs for autoradiography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond ECL membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN3032D (0.2 &#956;m; 30 cm x 3 m)</td>
			<td>for immunoblotting of proteins on membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer (12 x 100 &#956;l sample capacity)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Microdialyzer System 100</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microdialyzer membranes (8K cutoff)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>66310</td>
			<td>for exchanging the buffer of nuclear extract&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-fat dry milk</td>
			<td>Spartan Stores</td>
			<td>Spartan Instant Non-fat Dry Milk</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>for coupling antibody to beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P2308-5mg</td>
			<td>for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td>for inhibiting ribonuclease activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker/rotator</td>
			<td>Lab Industries, Inc&#160;</td>
			<td>Labquake Shaker 400-110</td>
			<td>for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Solve</td>
			<td>Research Products International Corp.</td>
			<td>No. 111177</td>
			<td>scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scintillation counter</td>
			<td>Beckman Instruments</td>
			<td>LS6000SC</td>
			<td>scintillation counter for determination of radioactivity&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>speed vaccum concentrator</td>
			<td>Savant</td>
			<td>SVC 100H</td>
			<td>for drying ethanol-precipitated RNA pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transphor electrophoresis unit</td>
			<td>Hoefer, Inc</td>
			<td>Hoefer TE Series Transphor</td>
			<td>for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

complementation of splicing activity by a galectin-3 - u1 snrnp complex on beads

Klasik tükenme-rekonsyon deneyleri galectin-3'ün nükleer özlerde gerekli bir birleştirme faktörü olduğunu göstermektedir. Galectin-3'ün birleştirme yoluna dahil etme mekanizması bu makalede ele alınmıştır. HeLa hücreli nükleer özlerin %12-%32 gliserol gradyanları üzerindeki tortulasyonu, galektin-3 ve U1 snRNP içeren endojen ~10S parçacıkta zenginleştirilmiş fraksiyonlar verir. Şimdi U1 snRNP'nin nükleer özlerini birlikte birleştirme aktivitesi kaybıyla tükenmek için bir protokol açıklıyoruz. U1-tükenmiş ekstrakttaki birleştirme aktivitesi, anti-galektin-3 antikorları ile kovalent olarak birleştirilen agarose boncuklar üzerinde sıkışmış galectin-3 - U1 snRNP parçacığı tarafından yeniden inşa edilebilir. Sonuçlar, galectin-3 - U1 snRNP - pre-mRNA üçlü kompleksinin ara ürünlere ve birleştirme reaksiyonu ürünlerine yol açan işlevsel bir E kompleksi olduğunu ve galectin-3'ün U1 snRNP ile ilişkisi boyunca birleştirme yoluna girdiğini göstermektedir. Belirli bir birleştirme faktörünün tükendiğini ayıklayan özlerde birleştirme aktivitesini yeniden inşa etmek için boncuklar üzerinde seçilen kompleks benzeşimi veya immün olarak seçilen şema genellikle diğer sistemler için geçerli olabilir.

Ne U1 snRNP (Bölüm 2.2.6'dan U1ΔNE) ve Gal3 - Gal3 - U1 snRNP kompleksleri anti-Gal3 (adım 3.2.7) tarafından immünprecipited gliserol gradyan 10S bölgesinden bir birleştirme reaksiyonu karıştırıldı. Bu reaksiyon karışımı U1 snRNA (Şekil 2A, şerit 3) ve U1'e özgü protein U1-70K (Şekil 2B, şerit 3) içeriyordu. Beklendiği gibi, Anti-Gal3 Gal3 çökelme (Şekil 2B, şerit 3). Bu...

Watch this Scientific Journal Video about Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads at JoVE.com

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Bu makalede, (a) U1 snRNP'nin nükleer özlerden tükenmesi ve eşlik eden birleştirme aktivitesi kaybı ile ilgili deneysel prosedürler açıklanmaktadır; ve (b) U1-tükenmiş ekstrakttaki birleştirme aktivitesinin galektin-3 - Boncuklara bağlı U1 snRNP parçacıklarının anti-galektin-3 antikorları ile kovalent olarak birleştiğinde yeniden kavrar.

Boncuklar Üzerinde Galectin-3 - U1 snRNP Kompleksi ile Birleştirme Etkinliğinin Tamamlayıcısı

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Koruma Grupları aside dayanıksız Saklanmasına için uygun bir Ni-Schiff-Base hidrolizi Kompleksi kullanma Koşullar

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

CD95 Ölüme Neden Olan SinyalIzasyon Kompleksinin Bileşiminin Ölçülmesi ve Procaspase-8'in Bu Komplekste İşleniş

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...