Name: rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث لجامعة ولاية نيويورك (الجائزة رقم: 71272) وجائزة IMPACT للجامعة في بافالو (الجائزة رقم: 000077).

ملاحظة: يمكن تقسيم بروتوكول الاستنساخ الهرمي المعروض في مجموعة الأدوات هذه إلى ثلاث خطوات رئيسية: 1. استنساخ جزء البلازميدات؛ 2. 2. استنساخ وحدات النسخ (TUs)؛ 3. استنساخ البلازميدات متعددة الجينات (الشكل 1). يبدأ هذا البروتوكول من تصميم التمهيدي وينتهي بتطبيقات البلازميد المستن...

توفر مجموعة الاستنساخ القائمة على MoClo التي طورها Lee et al. موردا ممتازا للتجميع السريع لوحدات النسخ من واحد إلى خمسة في بلازميد متعدد الجينات إما للتكرار أو الاندماج في جينوم الخميرة. استخدام هذه المجموعة يلغي اختناق الاستنساخ المستهلكة للوقت التي توجد في كثير من الأحيان للتعبير عن جينات مت?...

تهدف البيولوجيا التركيبية إلى هندسة النظم البيولوجية مع وظائف جديدة مفيدة للصناعات الصيدلانية والزراعية والكيميائية. تجميع أعداد كبيرة من شظايا الحمض النووي بطريقة عالية الإنتاجية هو تقنية أساسية في البيولوجيا الاصطناعية. مثل هذه العملية المعقدة يمكن أن تنهار إلى مستويات متعددة مع انخفاض التعقيد ، وهو مفهوم مستعار من العلوم الهندسية الأساسية1،2. في البيولوجيا التركيبية، عادة ما تتجمع شظايا الحمض النووي بشكل هرمي استنادا إلى الوظيفة: '1' مستوى الجزء: تشير "الأجزاء" إلى شظايا الحمض النووي ذات وظيفة محددة، مثل المروج، وتسلسل الترميز، والمنهي، وأصل النسخ المتماثل؛ و'2' العوامل التي يمكن أن تكون ذات طبيعة مختلفة. '2' مستوى وحدات النسخ: تتكون الوحدة من مروج وتسلسل ترميز ومنهي قادر على نسخ جين واحد؛ '3' المستوى المتعدد الجينات: يحتوي البلازميد المتعدد الجينات على عدة وحدات ثلاثية المستويات تتألف في كثير من الأحيان من مسار استقلابي كامل. هذا التجمع الهرمي رائدة من قبل المجتمع BioBrick هو المفهوم التأسيسي لتجميع مجموعات كبيرة من DNAs في البيولوجيا الاصطناعية3.
في العقد الماضي4،5،6،7، وقد سهلت تقنية استنساخ البوابة الذهبية بشكل كبير تجميع الحمض النووي الهرمي2. كما تم تطوير العديد من أساليب الاستنساخ متعددة الجزأة الأخرى ، مثل استنساخ جيبسون8، الاستنساخ المستقل عن الربط (SLIC)9، والاستنساخ القائم على الختان (USER)10، ورد فعل الدراجات ليغان (LCR)11، وفي إعادة دمج الجسم الحي (DNA Assembler)12،13، حتى الآن. ولكن استنساخ البوابة الذهبية هو طريقة مثالية لتجميع الحمض النووي لأنه مستقل عن التسلسلات الخاصة بالجينات ، مما يسمح بتجميع ندبة واتجاهية ووحدات في رد فعل وعاء واحد. يستفيد استنساخ البوابة الذهبية من إنزيمات تقييد IIS من النوع التي تتعرف على تسلسل غير باليندروميك لإنشاء تراكمات متداخلة خارج موقع التعرف2. ثم ينضم الليغاز إلى شظايا الحمض النووي الملدن للحصول على تجميع متعدد الأجزاء. وقد مكن تطبيق استراتيجية الاستنساخ هذه على نظام الاستنساخ المعياري (MoClo) من تجميع ما يصل إلى 10 شظايا الحمض النووي مع أكثر من 90٪ من المحولات التي تم فحصها والتي تحتوي على البناء المجمع بشكل صحيح4.
يوفر نظام MoClo مزايا هائلة عجلت بدورة التصميم والبناء والاختبار للبيولوجيا التركيبية. أولا، تمكن الأجزاء القابلة للتبديل الاستنساخ الجمعي من اختبار مساحة كبيرة من المعلمات بسرعة. على سبيل المثال، يتطلب تحسين المسار الأيضي عادة ركوب الدراجات من خلال العديد من المروجين لكل جين لتحقيق التوازن بين تدفق المسار. يمكن لنظام MoClo التعامل بسهولة مع مهام الاستنساخ المطلوبة. ثانيا، يحتاج المرء إلى تسلسل الجزء البلازميد ولكن عادة ليس TU أو البلازميدات متعددة الجينات. في معظم الحالات، الفحص عن طريق PCR مستعمرة أو تقييد الهضم كافية للتحقق على مستوى TU ومتعددة الجينات البلازميد. وذلك لأن استنساخ جزء البلازميد هو الخطوة الوحيدة التي تتطلب PCR، الذي يدخل في كثير من الأحيان الطفرات. ثالثا، نظام موكلو مثالي لبناء مسارات التمثيل الغذائي المعقدة متعددة الجينات. وأخيرا، بسبب التراكمات العالمية، يمكن إعادة استخدام الجزء البلازميدات ومشاركتها مع مجتمع الهندسة الحيوية بأكمله. حاليا، مجموعات موكلو متوفرة للنباتات14،15،5،16،17، الفطريات6،18،19،20،21،22، البكتيريا7،23،24،25،26،27، والحيوانات28،29. كما تم تقديم منصة MoClo متعددة المملكة مؤخرا30.
لSaccharomyces cerevisiae, وقد وضعت لي وآخرون6 مجموعة أدوات موكلو تنوعا, مورد ممتاز للمجتمع البيولوجيا الاصطناعية الخميرة. تأتي هذه المجموعة في شكل مريح من 96 بئرا وتحدد ثمانية أنواع من أجزاء الحمض النووي القابلة للتبديل مع مجموعة متنوعة من المروجين المميزين ، والبروتينات الفلورية ، والمنهيين ، وعلامات الببتيد ، وعلامات الاختيار ، وأصل النسخ المتماثل ، وأدوات تحرير الجينوم. تسمح مجموعة الأدوات هذه بتجميع ما يصل إلى خمس وحدات نسخ في بلازميد متعدد الجينات. هذه الميزات هي قيمة لهندسة التمثيل الغذائي الخميرة، التي يتم التعبير عن مسارات جزئية أو كاملة لإنتاج المواد الكيميائية المستهدفة. باستخدام هذه المجموعة، وقد الأمثل الباحثين إنتاج geraniol، linalool31،البنسلين32،حمض موكونيك33،النيلي34،وبيتالين35 في الخميرة.
هنا نقدم مفصلة، خطوة بخطوة بروتوكول لتوجيه استخدام مجموعة أدوات موكلو لتوليد مسارات متعددة الجينات للتعبير إما الظهارية أو الجينومية. من خلال الاستخدام المكثف لهذه المجموعة ، وجدنا أن القياس الدقيق لتركيزات الحمض النووي هو المفتاح لضمان توزيع الاعتدال لكل جزء في رد فعل البوابة الذهبية. ونحن نوصي أيضا ليغان الحمض النووي T4 على ليغاس الحمض النووي T7 لأن الأول يعمل بشكل أفضل مع أعداد أكبر من يتدلى36. وأخيرا، يجب إزالة أي مواقع اعتراف داخلية من BsmBI و BsaI أو تدجينها قبل التجميع. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن ينظر في تجميع أجزاء لإزالة مواقع داخلية متعددة وتحقيق الأمثل codon في وقت واحد. نحن نظهر كيفية استخدام مجموعة الأدوات هذه من خلال التعبير عن مسار من خمسة جينات لإنتاج β كاروتين والليكوبين في S. cerevisiae. نعرض كذلك كيفية ضرب موقع ADE2 باستخدام أدوات تحرير الجينوم من هذه المجموعة. تم اختيار هذه التجارب القائمة على الألوان لسهولة التصور. كما أننا نبين كيفية توليد بروتينات الاندماج وخلق طفرات الأحماض الأمينية باستخدام استنساخ البوابة الذهبية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass beads</td>
			<td>RPI research products</td>
			<td>9831</td>
			<td>For lysing yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD&#38; Company</td>
			<td>211677</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI-HFv2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3733S</td>
			<td>a highly efficient version of BsaI restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>4800-94-6</td>
			<td>Antibiotic for screening at the transcription unit level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td>Antibiotic for screening at the entry vector level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His</td>
			<td>Sunrise Sciences</td>
			<td>1006-010</td>
			<td>Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>291940</td>
			<td>Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTPs for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esp3I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0734S</td>
			<td>a highly efficient isoschizomer of BsmBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T2001</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>For carotenoid extraction from yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>Antibiotic for screening at the multigene plasmid level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Lysogenic agar medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopene</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>NC1142173</td>
			<td>For lycopene quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoClo YTK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1000000061</td>
			<td>Depositing Lab: John Deuber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>For plasmid purification from E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000c</td>
			<td>For measuring accurate DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin Sulphate</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-100</td>
			<td>Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF reaction Buffer (5X)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td>Buffer for PCR using Phusion polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>High fidelity polymerase for all the PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLM494</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100539</td>
			<td>Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvette</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>10050801</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>Ligase for Golden Gate cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851148</td>
			<td>For performing all the PCR and cloning reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Model: BBX24</td>
			<td>For homogenization of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Genesys 150</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-carotene</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAH6010603</td>
			<td>For &#946;-carotene quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning

تمكن طريقة استنساخ البوابة الذهبية من التجميع السريع لجينات متعددة في أي ترتيب يحدده المستخدم. ويستخدم نوع IIS تقييد الإنزيمات التي تقطع خارج مواقع الاعتراف بها وخلق تراكم قصيرة. يستخدم نظام الاستنساخ المعياري هذا (MoClo) سير عمل هرمي يتم فيه استنساخ أجزاء الحمض النووي المختلفة ، مثل المروجين وتسلسلات الترميز (CDS) والمنهيين ، لأول مرة في متجه إدخال. ناقلات دخول متعددة ثم تجميع في وحدات النسخ. ثم تتصل عدة وحدات نسخ ببللازميد متعدد الجينات. استراتيجية الاستنساخ البوابة الذهبية هي ميزة هائلة لأنها تسمح ندبة أقل، والاتجاه، والتجمع وحدات في رد فعل وعاء واحد. ويمكن سير العمل الهرمي عادة من الاستنساخ السهل لمجموعة كبيرة ومتنوعة من البنى المتعددة الجينات دون الحاجة إلى التسلسل خارج ناقلات الدخول. يتيح استخدام التسرب من البروتين الفلوري الفحص البصري السهل. يوفر هذا العمل بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتجميع البلازميدات متعددة الجينات باستخدام مجموعة الاستنساخ المعياري للخمائر (MoClo). نعرض النتائج المثلى ودون المستوى الأمثل لتجميع البلازميد متعدد الجينات ونقدم دليلا لفحص المستعمرات. وتنطبق استراتيجية الاستنساخ هذه إلى حد كبير على هندسة التمثيل الغذائي للخمائر وغيرها من الحالات التي يلزم فيها استنساخ البلازميد المتعدد الجينات.

هنا نتائج أربعة plasmids متعددة الجينات المستنسخة لإنتاج β كاروتين (الأصفر) والليكوبين (الأحمر). تم بناء بلازميد متعدد الجينات التكاملي لتعطيل موقع ADE2 ، والمستعمرات منها حمراء.
استنساخ CDSs في متجه الإدخال (pYTK001) تم تضخيم ERG20...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning at JoVE.com

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

والهدف من هذا البروتوكول هو توفير دليل مفصل خطوة بخطوة لتجميع البنى متعددة الجينات باستخدام نظام الاستنساخ المعياري القائم على استنساخ البوابة الذهبية. كما يقدم توصيات بشأن الخطوات الحاسمة لضمان التجميع الأمثل استنادا إلى خبراتنا.

التجميع السريع للبنى متعددة الجينات باستخدام استنساخ البوابة الذهبية المعيارية

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

هذا بروتوكول مفصل لتجميع البلازميدات متعددة الجينات باستخدام مجموعة Yeast MoClo. تمكن هذه الطريقة من الاستنساخ المريح لمجموعة متنوعة من زملاء الدراسة متعددي الجينات. وهي مثالية لتوليد مكتبة كبيرة من الأجزاء ذات الصلة.ابدأ بإعداد مزيج رد فعل البوابة الذهبية. إضافة 20 femtomoles من كل منتج PCR وناقل الدخول، ميكرولتر واحد من 10X T4 ليغاز العازلة، 0.5 ميكرولتر من Esp3I، و 0.5 ميكرولتر من T4 ligase. أضف الماء المقطر المزدوج ليصل إجمالي الحجم إلى 10 ميكرولترات.ثم، تشغيل رد فعل الاستنساخ. تحويل مزيج التفاعل بأكمله إلى سلالة ألفا DH5 أو ما يعادلها Escherichia القولونية الخلايا المختصة كيميائيا عن طريق الصدمة الحرارية. نشر الخلايا على لوحة رطل مع 35 ميكروغرام لكل ملليلتر الكلورامفينيكول.ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد 16 إلى 18 ساعة، أخرج اللوحة من الحاضنة واتركها عند أربع درجات مئوية لمدة خمس ساعات تقريبا للسماح للبروتين الفلوري الأخضر فائق المجلد أو sfGFP بالتطور للحصول على لون أخضر أكثر كثافة. لفحص اللوحة، ضعها على محول ترانزيوم ضوئي فوق بنفسجي أو أزرق.وsfGFP التي تحتوي على المستعمرات فلوريس تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. المستعمرات الخضراء سلبية لأنها تحتوي على الجزء غير المصقول من البلازميد. المستعمرات البيضاء إيجابية على الأرجح.الاستنساخ ناجح إذا كان هناك 30 إلى 100٪ مستعمرات بيضاء. تجميع ناقلات وسيطة مع الموصل الأيسر، والتسرب sfGFP، والموصل الأيمن، علامة اختيار الخميرة، أصل الخميرة من النسخ المتماثل، وplasmid جزء مع mRFP1، أصل E.coli، والجين مقاومة الأمبيسلين. إجراء رد فعل الاستنساخ كما هو موضح في المخطوطة النصية.تحويل مزيج رد الفعل بأكمله إلى سلالة ألفا DH5 ثم نشر الخلايا على لوحة رطل مع 50 ميكروغرام لكل كاربينسيلين ملليلتر أو الأمبيسلين. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد 16 إلى 18 ساعة، أخرج الطبق من الحاضنة.ستحتوي اللوحة على مستعمرات حمراء شاحبة وخضراء شاحبة. يبقيه في أربع درجات مئوية لمدة خمس ساعات للسماح ل mRFP1 وsfGFP ناضجة. استخدام الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق transilluminator لتحديد المستعمرات الخضراء التي تحتوي على ناقلات المتوسطة الصحيحة المحتملة.المتتالية من المستعمرات الخضراء على لوحة كاربينسيلين رطل واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، خط بها مرة أخرى على لوحة الكلورامفينيكول واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تحتوي المستعمرات التي تنمو على لوحات الكلورامفينيكول على بلازميدات مجمعة بشكل خاطئ.بمجرد أن يتم تجميع المتجه الوسيط بنجاح ، تابع تجميع وحدات النسخ. يحتوي هذا التجميع من أربع قطع على المتجه الوسيط، والمروج، وCDS، والمتحديد. تنقية البلازميدات، وتسجيل تركيزاتها، وتمييع كل بلازميد إلى 20 femtomoles من الحمض النووي لكل ميكرولتر.بعد إجراء رد فعل الاستنساخ، قم بتحويل مزيج تفاعل الاستنساخ بأكمله إلى خلايا DH5 alpha أو ما يعادلها من خلايا E.coli المختصة ولوحها على كاربينسيلين LBN. ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد 16 إلى 18 ساعة، أخرج الطبق من الحاضنة وابقه عند أربع درجات مئوية لمدة خمس ساعات تقريبا للسماح ل sfGFP بالنضج.استخدم الأشعة فوق البنفسجية أو محول الضوء الأزرق لتحديد المستعمرات البيضاء غير الفلورية التي تحتوي على وحدات النسخ الصحيحة المحتملة. تجميع ناقل وسيط للأوبلازميدات متعددة الجينات كما هو موضح في مخطوطة النص. ثم تحويل مزيج رد فعل الاستنساخ بأكمله إلى خلايا ألفا DH5 ولوحة لهم على رطل مع 50 ميكروغرام لكل kanamycin ملليلتر.احتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. إجراء فحص اللون الأحمر والأخضر القائم، ثم خط وتنمو المستعمرات الخضراء على لوحة كاناميسين رطل لفحص misassemblies كما هو موضح سابقا. بعد ذلك، قم بتجميع البلازميد متعدد الجينات عن طريق إعداد رد فعل الاستنساخ كما هو موضح في المخطوطة النصية.تحويل مزيج رد فعل الاستنساخ بأكمله إلى خلايا ألفا DH5 ولوحة لهم على كاناميسين رطل. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ثم إجراء الفحص الأخضر والأبيض كما هو موضح سابقا.تم استخدام هذا البروتوكول لبناء بلازميد متكامل متعدد الجينات لتعطيل موقع ADE2. وتم تجميع أربعة بلازميدات متعددة الجينات متماثلة وواحدة متكاملة. وكانت نسبة المستعمرات الصحيحة المحتملة لاستنساخ ناقلات وسيطة 1.83٪ بمجرد استنساخ البلازميد المتوسط، وكان معدل نجاح تجميع البلازميدات متعددة الجينات من وسيطة 93.77٪الأعداد الضئيلة من المستعمرات البيضاء الإيجابية تثبت تجميع دون المستوى الأمثل من البلازميدات متعددة الجينات.بعد التحول إلى الخميرة، نمت المستعمرات المنتجة بيتا كاروتين والليكوبين في اليوم الثالث. أربع مستعمرات من كل لوحة كانت ملطخة على لوحات جديدة ونمت لمدة يومين آخرين. تم استخراج الكاروتينات وقياسها كميا عن طريق قياس الطيف بالأشعة فوق البنفسجية.BTS1/ERG20 يؤدي إلى 35 أضعاف إنتاج بيتا كاروتين مقارنة مع سلالة ERG20 وحدها. وبالمثل، فإن إنتاج الليكوبين هو ما يقرب من 16.5 أضعاف أعلى في سلالة مع BTS1/ERG20 بالمقارنة مع ERG20 وحدها. تم استخدام البلازميد التكاملي متعدد الجينات لتعطيل موضع ADE2 ، إما مع الحمض النووي الريبي وليس الحمض النووي المساعد أو مع الحمض النووي الريبي وplasmid التكاملي متعدد الجينات كحمض نووي مساعد.بعد ثلاثة إلى أربعة أيام ، لوحظت المستعمرات الحمراء على لوحة YPD مع Nourseothricin ، مما يشير إلى أن ADE2 قد تعطلت بنجاح. أثناء محاولة هذه الطريقة ، فإن أهم شيء يجب تذكره هو قياس تركيزات الحمض النووي بدقة وماصة بعناية أثناء إعداد مزيج التفاعل هذا. تسمح هذه التقنية للباحثين في مجال هندسة التمثيل الغذائي الخميرة لمسح عدد كبير من الجينات والمروجين لزيادة غلة المنتج.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

ألياف النانو البروتين ECM والنانو المهندسة طريق الجمعية بمبادرة السطحية

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

جدوى Bioprinted الخلوية التركيبات باستخدام طابعة ثلاثة الديكارتية موزع

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

بناء وحدات صفائح هيدروجيل لتحجيم الكلي Micropatterned 3D الخلوية العمارة

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized التركيبات باستخدام الأنسجة محددة هيدروجيل Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

الطبقات الجيني التركيبات: منصة لالمشارك ثقافة بالسكان خلية غير المتجانسة

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning وجمعية Microvessels 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

الآلي الجمعية معالجة السائل الروبوتية أجهزة وحدات الحمض النووي

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

علاج الرباط ينشأ مع مصل مكيفة مكيفة: نموذج هندسة الأنسجة الانتقالية

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

إنتاج الهامستر السوري الذهبي المهندسة وراثيا عن طريق الحقن برونوكلير من مجمع كريسبر/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

الجمعية السريع، وقابلة للتطوير والتحميل من البروتينات النشطة بيولوجيا، وإيمونوستيمولانتس إلى نانوكاريرس الاصطناعية المتنوعة عبر نانوبريسيبيتيشن فلاش

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...