Name: rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00
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这项工作由纽约州立大学研究基金会（奖 #： 71272）和布法罗大学影响奖（奖 #： 000077）资助。

注：本工具包中提供的分层克隆协议可分为三个主要步骤：1. 克隆部分质粒：2. 克隆转录单位（TUs）：3. 克隆多基因质粒（图1）。此协议从入门设计开始，以克隆多基因质粒的应用结束。
1. 克隆部分质粒（pYTK001） 的引金设计：
<ol><li>设计包含侧翼核苷酸 TTT 的前进和反向底漆，这是一个具有额外核苷酸 （CGTCTCN） 的 BsmBI 识别站点，一个 4 核苷酸 （nt...

Lee等人开发的基于MoClo的克隆试剂盒为快速将一到五个转录单元组装成多基因质粒，用于复制或整合到酵母基因组中提供了极好的资源。该试剂盒的使用消除了酵母中表达多个基因时效的克隆瓶颈。
我们用T4DNA韧带测试了金门克隆的消化/配结周期的五种不同条件。我们发现，30个周期的消化在37°C 5分钟和结块在16°C 5分钟，然后最后消化步骤在50°C 10分钟和蛋白质灭活步骤在80?...

合成生物学旨在设计具有对制药、农业和化学工业有用的新功能的生物系统。以高通量方式组装大量DNA片段是合成生物学的基础技术。这样一个复杂的过程可以分解成多个层次，降低复杂性，一个概念借用的基础工程科学1，2。在合成生物学中，DNA片段通常根据功能分层组装：（一） 部分级别："部分"是指具有特定功能的 DNA 片段，如发起人、编码序列、终结者、复制来源：（二） 转录单位（TU）水平：TU由发起人、编码序列和能够转录单个基因的终结者组成：（三） 多基因水平：多基因质粒包含多个 TUs，通常由整个代谢通路组成。这种由BioBrick社区开创的分层组装是合成生物学3中大型DNAs组装的基础概念。
在过去的十年里，金门克隆技术极大地促进了分层DNA组装2。许多其他多部分克隆方法，如吉布森克隆8，结扎独立克隆（SLIC）9，尿素切除为基础的克隆（用户）10，韧带循环反应（LCR）11，并在体内重组（DNA组装）12，13，也已开发至今。但金门克隆是一种理想的DNA组装方法，因为它独立于基因特异性序列，允许无疤痕、定向和模块化组装在单锅反应中。金门克隆利用IIS型限制酶，识别非单体序列，在识别站点2外产生交错悬垂。然后，一个韧带加入退化的DNA片段，以获得一个多部分的组装。将这种克隆策略应用于模块化克隆（MoClo）系统，使多达10个DNA片段得以组装，90%以上的转化器被筛选出含有正确组装的构造4。
MoClo 系统提供了巨大的优势，加速了合成生物学的设计构建测试周期。首先，可互换部件使组合克隆能够快速测试大量的参数空间。例如，优化代谢通路通常需要循环通过每个基因的许多促进器来平衡通路通量。MoClo 系统可以轻松地处理如此苛刻的克隆任务。其次，需要对部分质粒进行排序，但通常不是TU或多基因质粒。在大多数情况下，通过菌落 PCR 或限制消化进行筛查足以在 TU 和多基因质粒水平上进行验证。这是因为克隆部分质粒是唯一需要PCR的步骤，它经常引入突变。第三，MoClo系统是构建多基因复杂代谢通路的理想之选。最后，由于普遍悬垂，部分质粒可以重复使用，并与整个生物工程社区共享。目前，MoClo套件可用于植物14，15，5，16，17，真菌6，18，19，20，21，22，细菌7，23，24，25，26，27和动物28，29。一个多王国的MoClo平台也于最近30日推出。
对于糖精，李等人已经开发出一种多才多艺的MoClo工具包，这是酵母合成生物学界的极好资源。该套件采用方便的 96 井格式，定义了八种类型的可互换 DNA 部件，包括各种功能良好的促进剂、荧光蛋白、终结者、肽标签、选择标记、复制源和基因组编辑工具。此工具包允许将多达 5 个转录单元组装成多基因质粒。这些功能对于酵母代谢工程很有价值，在酵母代谢工程中，部分或整个途径被过度表达以产生有针对性的化学物质。利用这个工具包，研究人员优化了杰拉尼奥尔、利纳洛尔31、青霉素32、粘液酸33、蓝蓝34和酵母β35的生产。
在这里，我们提供详细的分步协议，以指导使用 MoClo 工具包生成表皮或基因组表达的多基因通路。通过广泛使用这个工具包，我们发现，DNA浓度的准确测量是确保金门反应中每个部分的等价分布的关键。我们还建议T4DNA韧带超过T7DNA韧带，因为前者更好地工作与更多的悬垂36。最后，BsmBI 和 BsaI 的任何内部识别站点必须在组装前删除或驯化。或者，可以考虑合成部件以删除多个内部站点，并实现同步的 codon 优化。我们演示了如何使用这个工具包，表达一个五基因通路，用于β胡萝卜素和番茄红素生产在 塞雷维西亚。 我们进一步展示如何使用本套件中的基因组编辑工具敲除 ADE2 轨迹。这些基于颜色的实验被选为易于可视化的实验。我们还演示了如何产生融合蛋白，并利用金门克隆产生氨基酸突变。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass beads</td>
			<td>RPI research products</td>
			<td>9831</td>
			<td>For lysing yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD&#38; Company</td>
			<td>211677</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI-HFv2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3733S</td>
			<td>a highly efficient version of BsaI restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>4800-94-6</td>
			<td>Antibiotic for screening at the transcription unit level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td>Antibiotic for screening at the entry vector level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His</td>
			<td>Sunrise Sciences</td>
			<td>1006-010</td>
			<td>Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>291940</td>
			<td>Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTPs for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esp3I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0734S</td>
			<td>a highly efficient isoschizomer of BsmBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T2001</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>For carotenoid extraction from yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>Antibiotic for screening at the multigene plasmid level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Lysogenic agar medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopene</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>NC1142173</td>
			<td>For lycopene quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoClo YTK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1000000061</td>
			<td>Depositing Lab: John Deuber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>For plasmid purification from E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000c</td>
			<td>For measuring accurate DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin Sulphate</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-100</td>
			<td>Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF reaction Buffer (5X)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td>Buffer for PCR using Phusion polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>High fidelity polymerase for all the PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLM494</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100539</td>
			<td>Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvette</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>10050801</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>Ligase for Golden Gate cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851148</td>
			<td>For performing all the PCR and cloning reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Model: BBX24</td>
			<td>For homogenization of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Genesys 150</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-carotene</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAH6010603</td>
			<td>For &#946;-carotene quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning

金门克隆法使多个基因在任何用户定义的排列中能够快速组装。它使用 IIS 型限制酶，这些酶在识别站点之外切开，并创建短悬架。此模块化克隆 （MoClo） 系统使用分层工作流，其中不同 DNA 部分（如发起器、编码序列 （CDS） 和终结者）首先被克隆到条目载体中。然后，多个入口载体组装成转录单元。几个转录单元然后连接到多基因质粒。金门克隆战略具有巨大的优势，因为它允许无疤痕、定向和模块化组装在一锅反应中。分层工作流通常能够对多种多基因构造进行传真克隆，无需在进入载体之外进行测序。荧光蛋白的使用使视觉筛查变得简单。这项工作提供了一个详细的，分步协议，使用酵母模块化克隆（MoClo）套件组装多基因质粒。我们展示了多基因质粒组装的最佳和次优结果，并为菌落的筛选提供了指南。这种克隆策略非常适用于酵母代谢工程和其他需要多基因质粒克隆的情况。

这里的结果是四个复制的多基因质粒为β胡萝卜素（黄色）和番茄红素（红色）生产。建造了一个用于破坏 ADE2 轨迹的综合多基因质粒，其殖民地是红色的。
将 CDS 克隆到输入载体 （pYTK001） ERG20从酵母基因组和三个类胡萝卜素基因crtE，crtYB，crtI从质粒plM49448放大到条形载体...

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Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

该协议的目标是提供一个详细的，分步指南，以组装多基因结构使用模块化克隆系统的基础上，金门克隆。它还根据我们的经验就确保最佳装配的关键步骤提出了建议。

使用模块化金门克隆的多基因结构快速组装

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

这是使用酵母 MoClo 套件组装多基因质粒的详细协议。这种方法使各种多基因同学的克隆方便。它是生成相关部件的大库的理想之选。首先建立金门反应组合。添加每个 PCR 产品和入口矢量的 20 个女性托盘、1 个 10X T4 升气缓冲器的微升、0.5 微升 Esp3I 和 0.5 微升 T4 连体。加入双蒸馏水，使总体积达到10微升。然后，运行克隆反应。通过热冲击将整个反应组合转化为DH5α菌株或等效的大肠杆菌化学能力细胞。将细胞分散在磅板上，每毫升氯霉素35微克。然后在37摄氏度的温度下连夜孵化盘子。16 至 18 小时后，将盘子从孵化器中取出，在摄氏 4 度下保留约 5 小时，让超级折叠绿色荧光蛋白或 sfGFP 形成更强烈的绿色。要筛选板，将其放置在紫外线或蓝光透光器上。含有菌落的sfGFP会在紫外线下荧光。绿色殖民地是负面的，因为它们含有未切割的部分质粒。白人殖民地可能是积极的。克隆是成功的，如果有30至100%的白色殖民地。用左连接器、sfGFP 辍学、右连接器、酵母选择标记、复制酵母源以及带有 mRFP1、大肠杆菌原产地和抗安培林基因的部分质粒组装中间载体。执行文本手稿中描述的克隆反应。将整个反应组合转换为DH5α菌株，然后以每毫升碳水化合物或安皮西林50微克的磅板上展开细胞。在37摄氏度的夜间孵化。16 至 18 小时后，将盘子从孵化器中取出。盘子里将同时包含淡红色和淡绿色的殖民地。将其保持在摄氏四度约五小时，让 mRFP1 和 sfGFP 成熟。使用紫外线或蓝光透光器识别包含潜在正确中间载体的绿色菌落。在磅卡苯甲酸酯板上划出绿色殖民地，并在37摄氏度的夜间孵化。第二天，在氯霉素板上再次划出它们，并在37摄氏度的夜间孵化。生长在氯霉素板上的菌落含有组装不当的质粒。中间向量成功组装后，继续组装转录单元。此四件式装配包含中间矢量、发起人、CDS 和决定因素。净化质粒，记录其浓度，并将每个质粒稀释到每微升20个女性DNA。执行克隆反应后，将整个克隆反应组合转换为DH5α或等效大肠杆菌称职细胞，并将其镀在LBN苯基林上。然后在37摄氏度的温度下连夜孵化盘子。16 至 18 小时后，将盘子从孵化器中取出，将其保持在摄氏 4 度左右，持续约 5 小时，让 sfGFP 成熟。使用紫外线或蓝光半透明灯来识别包含潜在正确转录单元的非荧光白色菌落。为文本手稿中描述的多基因质粒组装中间载体。然后将整个克隆反应混合物转换为DH5阿尔法细胞，用每毫升卡那霉素50微克将其镀在磅上。在37摄氏度的夜间孵化板。执行基于红色和绿色的筛选，然后在 lb kanamycin 板上条纹并生长绿色菌落，以筛选之前演示的误组装。接下来，通过设置文本手稿中描述的克隆反应来组装多基因质粒。将整个克隆反应混合物转换为DH5阿尔法细胞，并将它们镀在磅卡那霉素上。在37摄氏度的夜间孵化板。然后执行先前描述的绿色和白色筛选。此协议用于构建一个集成的多基因质粒，用于破坏ADE2轨迹。组装了四个复制和一个综合多基因质粒。中等向量克隆的潜在正确菌落比例为1.83%，中间质粒克隆后，从中间体组装多基因质粒的成功率为93.77%， 正白菌群数量微不足道，显示出多基因质粒的次优组装。在转化为酵母后，生产β-胡萝卜素和番茄红素的菌落在第三天生长。每个盘子里有四个菌落被划到新鲜的盘子上，再长两天。类胡萝卜素通过紫外线-维斯光谱光谱测量提取和量化。BTS1/ERG20 可使β-胡萝卜素的产量比仅 ERG20 的菌株高出 35 倍。同样，与ERG20相比，与BTS1/ERG20相比，番茄红素的产量大约高出16.5倍。多基因整合质粒用于破坏ADE2轨迹，无论是与gRNA和没有帮手DNA或与gRNA和多基因整合质粒作为帮助者DNA。三到四天后，在YPD板块上观察到带有努尔索西林的红色菌落，表明ADE2已被成功破坏。在尝试这种方法时，要记住的最重要的事情是在设置这种反应组合时仔细测量DNA浓度和移液器。这项技术使酵母代谢工程领域的研究人员能够调查大量的基因和促进者，以最大限度地提高产品产量。

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