Name: rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de Research Foundation for the State University of New York (Award #: 71272) en de IMPACT Award of University at Buffalo (Award #: 000077).

OPMERKING: Het hiërarchische kloonprotocol dat in deze toolkit wordt aangeboden, kan worden onderverdeeld in drie belangrijke stappen: 1. Het klonen van deelplasmiden; 2. Klonen van transcriptie-eenheden (TUs); 3. Klonen van multi-gen plasmiden (Figuur 1). Dit protocol begint bij het primerontwerp en eindigt met toepassingen van de gekloonde multi-gen plasmide.
1. Primer ontwerp voor het klonen van het onderdeel plasmide (pYTK001):
<ol><li>Ontwerp de voorwaarts...

De moclo gebaseerde kloonkit ontwikkeld door Lee et al. biedt een uitstekende bron voor snelle assemblage van één tot vijf transcriptie-eenheden in een multi-gen plasmide voor replicatie of integratie in het gistgenoom. Het gebruik van deze kit elimineert het tijdrovende kloonknelpunt dat vaak bestaat voor het uitdrukken van meerdere genen in gist.
We hebben vijf verschillende condities getest voor de spijsvertering/ligatie cycli van Golden Gate klonen met T4 DNA ligase. We ontdekten dat 30 ...

Synthetische biologie is gericht op het ontwikkelen van biologische systemen met nieuwe functionaliteiten die nuttig zijn voor de farmaceutische, agrarische en chemische industrie. Het assembleren van grote aantallen DNA-fragmenten op een high-throughput manier is een fundamentele technologie in de synthetische biologie. Een dergelijk ingewikkeld proces kan worden opgesplitst in meerdere niveaus met afnemende complexiteit , een concept dat is ontleend aan fundamentele ingenieurswetenschappen1,2. In de synthetische biologie assembleren DNA-fragmenten meestal hiërarchisch op basis van functionaliteit: (i) Deelniveau: "delen" verwijst naar DNA-fragmenten met een specifieke functie, zoals een promotor, een coderingssequentie, een terminator, een oorsprong van replicatie; ii) Transcriptie-eenheden (TU)-niveau: een TU bestaat uit een promotor, een coderingssequentie en een terminator die in staat is een enkel gen te transcriberen; iii) Multigenniveau: een multigen plasmide bevat meerdere TU's die vaak bestaan uit een volledige metabolische route. Deze hiërarchische assemblage die door de BioBrick-gemeenschap wordt geïntroduceerd, is het basisconcept voor de assemblage van grote sets DSA's in synthetische biologie3.
In het afgelopen decennium4,5,6,7, heeft de Golden Gate-kloontechniek de hiërarchische DNA-assemblage aanzienlijk vergemakkelijkt2. Veel andere meerdelige kloonmethoden, zoals Gibson klonen8, ligatie-onafhankelijk klonen (SLIC)9, uracil excisie-gebaseerd klonen (USER)10, de ligase cycling reaction (LCR)11, en in vivo recombinatie (DNA Assembler)12,13, zijn ook ontwikkeld tot nu toe. Maar Golden Gate klonen is een ideale DNA-assemblagemethode omdat het onafhankelijk is van genspecifieke sequenties, waardoor littekenloze, directionele en modulaire assemblage in een one-pot-reactie mogelijk is. Golden Gate klonen maakt gebruik van type IIS restrictie enzymen die een niet-palindromische sequentie herkennen om verspringende uitsteeksels buiten de herkenningsplaats te creëren2. Een ligase voegt zich vervolgens bij de gegloeide DNA-fragmenten om een meerdelige assemblage te verkrijgen. Het toepassen van deze kloonstrategie op het modulaire kloonsysteem (MoClo) heeft het mogelijk gemaakt om maximaal 10 DNA-fragmenten samen te stellen met meer dan 90% transformanten gescreend met de correct geassembleerde constructie4.
Het MoClo-systeem biedt enorme voordelen die de ontwerp-bouw-testcyclus van synthetische biologie hebben versneld. Ten eerste stellen de verwisselbare onderdelen combinatorisch klonen in staat om een grote ruimte van parameters snel te testen. Bijvoorbeeld, het optimaliseren van een metabolische route vereist meestal fietsen door vele promotors voor elk gen om de route flux in evenwicht te brengen. Het MoClo-systeem kan dergelijke veeleisende kloontaken gemakkelijk aan. Ten tweede moet men het deel plasmide sequencen, maar meestal niet de TU of de multi-gen plasmiden. In de meeste gevallen is screening op kolonie-PCR of restrictievertering voldoende voor verificatie op TU- en multi-gen plasmideniveau. Dit komt omdat het klonen van het onderdeel plasmide de enige stap is die PCR vereist, die vaak mutaties introduceert. Ten derde is het MoClo-systeem ideaal voor het bouwen van multi-gen complexe metabolische routes. Ten slotte kan het deel plasmiden vanwege de universele uitsteeksels worden hergebruikt en gedeeld met de hele bio-engineeringgemeenschap. Momenteel zijn MoClo kits beschikbaar voor planten14,15,5,16,17,schimmels6,18,19,20,21,22,bacteriën7,23,24,25,26,27en dieren28,29. Een multi-koninkrijk MoClo platform is onlangs ook geïntroduceerd30.
Voor Saccharomyces cerevisiaehebben Lee et al.6 een veelzijdige MoClo toolkit ontwikkeld, een uitstekende bron voor de gist synthetische biologie gemeenschap. Deze kit wordt geleverd in een handig 96-well-formaat en definieert acht soorten verwisselbare DNA-onderdelen met een gevarieerde verzameling goed gekarakteriseerde promotors, fluorescerende eiwitten, terminators, peptidetags, selectiemarkers, oorsprong van replicatie en genoombewerkingstools. Deze toolkit maakt de assemblage van maximaal vijf transcriptie-eenheden in een multi-gen plasmide mogelijk. Deze kenmerken zijn waardevol voor gist metabolische engineering, waarin gedeeltelijke of volledige paden worden over-uitgedrukt om gerichte chemicaliën te produceren. Met behulp van deze kit hebben onderzoekers de productie van geraniol, linalool31,penicilline32,muconic acid33,indigo34en betalain35 in gist geoptimaliseerd.
Hier bieden we een gedetailleerd, stapsgewijs protocol om het gebruik van de MoClo-toolkit te begeleiden om multigen-paden te genereren voor episomale of genomische expressie. Door uitgebreid gebruik van deze kit hebben we ontdekt dat het nauwkeurig meten van DNA-concentraties de sleutel is tot het waarborgen van de equimolar verdeling van elk onderdeel in de Golden Gate-reactie. We raden ook de T4 DNA-ligase over de T7 DNA-ligase aan omdat de eerste beter werkt met grotere aantallen uitsteeksels36. Ten slotte moeten alle interne herkenningslocaties van BsmBI en BsaI vóór de montage worden verwijderd of gedomesticeerd. Als alternatief kan men overwegen om onderdelen te synthetiseren om meerdere interne sites te verwijderen en om gelijktijdige codonoptimalisatie te bereiken. We laten zien hoe we deze toolkit kunnen gebruiken door een vijf-gen traject uit te drukken voor β-caroteen en lycopeen productie in S. cerevisiae. We laten verder zien hoe je de ADE2-locus kunt uitschakelen met behulp van de genoombewerkingstools uit deze kit. Deze op kleuren gebaseerde experimenten werden geselecteerd voor eenvoudige visualisatie. We laten ook zien hoe je fusie-eiwitten kunt genereren en aminozuurmutaties kunt maken met behulp van Golden Gate-klonen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass beads</td>
			<td>RPI research products</td>
			<td>9831</td>
			<td>For lysing yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD&#38; Company</td>
			<td>211677</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI-HFv2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3733S</td>
			<td>a highly efficient version of BsaI restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>4800-94-6</td>
			<td>Antibiotic for screening at the transcription unit level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td>Antibiotic for screening at the entry vector level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His</td>
			<td>Sunrise Sciences</td>
			<td>1006-010</td>
			<td>Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>291940</td>
			<td>Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTPs for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esp3I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0734S</td>
			<td>a highly efficient isoschizomer of BsmBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T2001</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>For carotenoid extraction from yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>Antibiotic for screening at the multigene plasmid level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Lysogenic agar medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopene</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>NC1142173</td>
			<td>For lycopene quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoClo YTK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1000000061</td>
			<td>Depositing Lab: John Deuber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>For plasmid purification from E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000c</td>
			<td>For measuring accurate DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin Sulphate</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-100</td>
			<td>Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF reaction Buffer (5X)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td>Buffer for PCR using Phusion polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>High fidelity polymerase for all the PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLM494</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100539</td>
			<td>Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvette</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>10050801</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>Ligase for Golden Gate cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851148</td>
			<td>For performing all the PCR and cloning reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Model: BBX24</td>
			<td>For homogenization of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Genesys 150</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-carotene</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAH6010603</td>
			<td>For &#946;-carotene quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning

De Golden Gate-kloonmethode maakt een snelle assemblage van meerdere genen in elke door de gebruiker gedefinieerde opstelling mogelijk. Het maakt gebruik van type IIS beperking enzymen die snijden buiten hun herkenning sites en creëren een korte overhang. Dit modulaire kloonsysteem (MoClo) maakt gebruik van een hiërarchische workflow waarin verschillende DNA-onderdelen, zoals promotors, coderingssequenties (CDS) en terminators, eerst worden gekloond tot een invoervector. Meerdere invoervectoren worden vervolgens samengevoegd tot transcriptie-eenheden. Verschillende transcriptie-eenheden verbinden vervolgens met een multi-gen plasmide. De Golden Gate-kloonstrategie is van enorm voordeel omdat het littekenloze, directionele en modulaire assemblage in een one-pot-reactie mogelijk maakt. De hiërarchische workflow maakt het meestal mogelijk om een grote verscheidenheid aan multi-genconstructies te klonen zonder dat er een sequencing nodig is die verder gaat dan invoervectoren. Het gebruik van fluorescerende eiwituitval maakt een eenvoudige visuele screening mogelijk. Dit werk biedt een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor het assembleren van multi-gen plasmiden met behulp van de gist modulair klonen (MoClo) kit. We tonen optimale en suboptimale resultaten van multi-gen plasmide assemblage en bieden een gids voor screening op kolonies. Deze kloonstrategie is zeer toepasbaar voor gist metabole engineering en andere situaties waarin multi-gen plasmide klonen vereist is.

Hier de resultaten van vier replicerende multi-gen plasmiden voor β-caroteen (geel) en lycopeen (rood) productie. Een integratieve multi-gen plasmide voor het verstoren van de ADE2 locus werd gebouwd, waarvan de kolonies rood zijn.
CDSs klonen in de invoervector (pYTK001) ERG20 werd versterkt uit het gistgenoom en de drie carotenoïde genen crtE, crtYB, crtI van d...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning at JoVE.com

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde, stapsgewijze handleiding te bieden voor het assembleren van multi-gen constructies met behulp van het modulaire kloonsysteem op basis van Golden Gate klonen. Het geeft ook aanbevelingen over kritieke stappen om een optimale montage te garanderen op basis van onze ervaringen.

Snelle assemblage van multigenconstructies met behulp van modulair klonen van golden gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Dit is een gedetailleerd protocol voor het assembleren van multi-gen plasmiden met behulp van de Yeast MoClo kit. Deze methode maakt het gemakkelijk klonen van een verscheidenheid aan multi-gen klasgenoten mogelijk. Het is ideaal voor het genereren van een grote bibliotheek met gerelateerde onderdelen.Begin met het opzetten van de Golden Gate reactiemix. Voeg 20 femtomoles toe van elk PCR-product en de entryvector, één microliter van 10X T4 Ligase buffer, 0,5 microliter Esp3I en 0,5 microliter T4 ligase. Voeg dubbel gedestilleerd water toe om het totale volume op 10 microliter te brengen.Voer vervolgens de kloonreactie uit. Transformeer de gehele reactiemix in de DH5 alfastam of gelijkwaardige Escherichia coli chemisch competente cellen door hitteschok. Verdeel de cellen over een lb-plaat met 35 microgram per milliliter chlooramfenicol.Incubeer het bord vervolgens 's nachts op 37 graden Celsius. Haal na 16 tot 18 uur het bord uit de incubator en laat het ongeveer vijf uur op vier graden Celsius staan om het superfoldergroene fluorescerende eiwit of sfGFP te laten ontwikkelen voor een intensere groene kleur. Om de plaat te screenen, plaatst u deze op een ultra-violette of blauwe lichttransilluminator.De sfGFP die kolonies bevat, fluoresceert onder het UV-licht. De groene kolonies zijn negatief omdat ze het ongesneden deel plasmide bevatten. De witte kolonies zijn waarschijnlijk positief.Het klonen is succesvol als er 30 tot 100% witte kolonies zijn. Monteer een tussenvector met de linker connector, de sfGFP dropout, de rechter connector, een gist selectie marker, een gist oorsprong van replicatie, en het deel plasmide met een mRFP1, een E.coli oorsprong, en het ampicilline resistente gen. Voer de kloonreactie uit zoals beschreven in het teksthandschrift.Zet de hele reactiemix om in de DH5-alfastam en verdeel de cellen vervolgens over een lb-plaat met 50 microgram per milliliter carbenicilline of ampicilline. Incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Haal na 16 tot 18 uur de plaat uit de incubator.De plaat bevat zowel lichtrode als lichtgroene kolonies. Houd het ongeveer vijf uur op vier graden Celsius om de mRFP1 en sfGFP te laten rijpen. Gebruik een UV- of blauwlichttransilluminator om de groene kolonies te identificeren die de potentieel correcte tussenvector bevatten.Streep de groene kolonies uit op een lb carbenicillineplaat en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. Streep ze de volgende dag weer uit op een chlooramfenicolplaat en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius. De kolonies die groeien op chlooramfenicolplaten bevatten verkeerd samengestelde plasmiden.Zodra de tussenvector met succes is geassembleerd, gaat u verder met het assembleren van de transcriptie-eenheden. Deze vierdelige assemblage bevat de tussenliggende vector, een promotor, een CDS en determinator. Zuiver de plasmiden, noteer hun concentraties en verdun elke plasmide tot 20 femtomoles DNA per microliter.Na het uitvoeren van de kloonreactie, transformeer de volledige kloonreactiemix in de DH5 alfa of gelijkwaardige E.coli competente cellen en plate ze op LBN carbenicillin. Incubeer het bord vervolgens 's nachts op 37 graden Celsius. Haal na 16 tot 18 uur de plaat uit de incubator en houd deze ongeveer vijf uur op vier graden Celsius om de sfGFP te laten rijpen.Gebruik een UV- of blauwlichttransilluminator om de niet-fluorescerende witte kolonies te identificeren die de mogelijk correcte transcriptie-eenheden bevatten. Stel een tussenvector samen voor de multi-gen plasmiden zoals beschreven in het teksthandschrift. Transformeer vervolgens de hele kloonreactiemix in DH5-alfacellen en leg ze op lb met 50 microgram per milliliter kanamycine.Incubeer de plaat 's nachts op 37 graden Celsius. Voer rode en groene kleurgebaseerde screening uit, streep en kweek de groene kolonies op een lb kanamycine-plaat om te screenen op misassemblages zoals eerder aangetoond. Verzamel vervolgens de multi-gen plasmide door een kloonreactie op te zetten zoals beschreven in het teksthandschrift.Transformeer de hele kloonreactiemix in DH5-alfacellen en leg ze op lb kanamycine. Incubeer de plaat 's nachts op 37 graden Celsius. Voer vervolgens de groen-witte screening uit zoals eerder beschreven.Dit protocol werd gebruikt om één integratieve multi-gen plasmide te construeren voor het verstoren van de ADE2 locus. Vier replicerende en één integratieve multi-gen plasmiden werden geassembleerd. De verhouding van potentieel correcte kolonies voor het tussenliggende vector klonen was 1,83%Zodra de intermediaire plasmide was gekloond, was het slagingspercentage van het assembleren van multi-gen plasmiden uit het intermediair 93,77%Het verwaarloosbare aantal positieve witte kolonies toont een suboptimale assemblage van multi-gen plasmiden aan.Na omzetting in gist groeiden kolonies die bètacaroteen en lycopeen produceerden op dag drie. Vier kolonies van elke plaat werden op verse borden uitgestreept en nog twee dagen gekweekt. De carotenoïden werden geëxtraheerd en gekwantificeerd door UV-Vis spectrofotometrie.BTS1/ERG20 leidt tot een 35-voudig hogere productie van bètacaroteen in vergelijking met de stam met ALLEEN ERG20. Evenzo is de productie van lycopeen ongeveer 16,5 keer hoger in de stam met BTS1/ERG20 in vergelijking met ERG20 alleen. De multi-gen integratieve plasmide werd gebruikt voor de verstoring van de ADE2 locus, hetzij met een gRNA en geen helper DNA of met gRNA en een multi-gen integratieve plasmide als helper DNA.Na drie tot vier dagen werden rode kolonies waargenomen op de YPD-plaat met Nourseothricin, wat aangeeft dat ADE2 met succes was verstoord. Tijdens het proberen van deze methode is het belangrijkste om te onthouden om de DNA-concentraties nauwkeurig te meten en zorgvuldig te pipetten tijdens het opzetten van deze reactiemix. Deze techniek stelt onderzoekers op het gebied van Yeast Metabolic Engineering in staat om een groot aantal genen en promotors te onderzoeken voor een maximale productopbrengst.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

ECM Eiwit nanovezels en nanostructuren Engineered behulp-Surface geïnitieerde Vergadering

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Construeert met een tissue-specifieke Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Gelaagde Alginaat Constructen: Een platform voor Co-cultuur van heterogene celpopulaties

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning en montage van 3D microvaten

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Behandeling van ligamentconstructen met uitoefening geconditioneerd serum: een translatie weefsel techniek model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Productie van genetisch gemanipuleerde gouden Syrische Hamsters door Pronuclear injectie van het Complex van de CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Snelle, schaalbare montage en laden van bioactieve eiwitten en Immunostimulants in verschillende synthetische Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...