Name: rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning at JoVE.com

Ces travaux ont été financés par la Research Foundation de l’Université d’État de New York (Prix #: 71272) et le Prix IMPACT de l’Université à Buffalo (Prix #: 000077).

REMARQUE : Le protocole hiérarchique de clonage offert dans cette boîte à outils peut être divisé en trois étapes principales : 1. Clonage des plasmides de la partie; 2. Unités de transcription du clonage (ET); 3. Clonage de plasmides multigéniques (Figure 1). Ce protocole commence à partir de la conception de l’amorce et se termine par des applications du plasmide multigénique cloné.
1. Conception d’amorce pour clonage de la partie plasmide (pYTK001)...

Le kit de clonage moclo développé par Lee et coll. fournit une excellente ressource pour l’assemblage rapide d’une à cinq unités de transcription dans un plasmide multigénique, soit pour la réplication ou l’intégration dans le génome de la levure. L’utilisation de ce kit élimine le goulot d’étranglement de clonage qui prend beaucoup de temps qui existe fréquemment pour exprimer plusieurs gènes dans la levure.
Nous avons testé cinq conditions différentes pour les cycles ...

La biologie synthétique vise à concevoir des systèmes biologiques avec de nouvelles fonctionnalités utiles pour les industries pharmaceutiques, agricoles et chimiques. L’assemblage d’un grand nombre de fragments d’ADN d’une manière à haut débit est une technologie fondamentale en biologie synthétique. Un processus aussi compliqué peut se décomposer en plusieurs niveaux avec une complexité décroissante, un concept emprunté aux sciences fondamentales del’ingénierie 1,2. En biologie synthétique, les fragments d’ADN s’assemblent généralement hiérarchiquement en fonction de la fonctionnalité : (i) Niveau de partie : les « parties » désignent les fragments d’ADN ayant une fonction spécifique, comme un promoteur, une séquence de codage, un terminateur, une origine de réplication; (ii) Niveau des unités de transcription (TU) : un TU se compose d’un promoteur, d’une séquence de codage et d’un terminateur capable de transcrire un seul gène; (iii) Niveau multigénique : un plasmide multigénique contient plusieurs OV souvent constitués d’une voie métabolique entière. Cet assemblage hiérarchique lancé par la communauté BioBrick est le concept fondamental pour l’assemblage de grands ensembles d’ADN en biologie synthétique3.
Au cours de la dernièredécennie 4,5,6,7, la technique de clonage Golden Gate a considérablement facilité l’assemblage hiérarchique de l’ADN2. Beaucoup d’autres méthodes de clonage en plusieurs parties, telles que le clonage Gibson8, le clonage indépendant de ligature (SLIC)9, le clonage à base d’excision uracil (USER)10, la réaction du cycle ligase (LCR)11, et la recombinaison in vivo (Assembleur d’ADN)12,13, ont également été développés jusqu’à présent. Mais le clonage Golden Gate est une méthode idéale d’assemblage de l’ADN parce qu’il est indépendant des séquences spécifiques aux gènes, permettant un assemblage sans cicatrice, directionnel et modulaire dans une réaction d’un pot. Le clonage golden gate tire parti des enzymes de restriction de type IIS qui reconnaissent une séquence non palindromic pour créer des surplombs décalés à l’extérieur du site de reconnaissance2. Un ligase rejoint alors les fragments d’ADN annelés pour obtenir un assemblage en plusieurs parties. L’application de cette stratégie de clonage au système modulaire de clonage (MoClo) a permis l’assemblage de jusqu’à 10 fragments d’ADN avec plus de 90% de transformateurs filtrés contenant la construction correctement assemblée4.
Le système MoClo offre d’énormes avantages qui ont accéléré le cycle de conception-construction-test de la biologie synthétique. Tout d’abord, les parties interchangeables permettent au clonage combinatoire de tester rapidement un grand espace de paramètres. Par exemple, l’optimisation d’une voie métabolique nécessite généralement le vélo à travers de nombreux promoteurs pour chaque gène pour équilibrer le flux de la voie. Le système MoClo peut facilement gérer des tâches de clonage aussi exigeantes. Deuxièmement, il faut séquencer la partie plasmide, mais généralement pas la TU ou les plasmides multigéniques. Dans la plupart des cas, le criblage par PCR de colonie ou digestion de restriction est suffisant pour la vérification au niveau de TU et de plasmide multi-gène. C’est parce que le clonage de la partie plasmide est la seule étape nécessitant pcr, qui introduit fréquemment des mutations. Troisièmement, le système MoClo est idéal pour la construction de voies métaboliques complexes multigéniques. Enfin, en raison des surplombs universels, la partie plasmide peut être réutilisée et partagée avec l’ensemble de la communauté de la bioingénierie. Actuellement, moclo kits sont disponibles pour les plantes14,15,5,16,17, champignons6,18,19,20,21,22, bactéries7,23,24,25,26,27, et les animaux28,29. Une plate-forme MoClo multi-royaume a également été introduit récemment30.
Pour Saccharomyces cerevisiae, Lee et coll.6 ont développé une boîte à outils MoClo polyvalente, une excellente ressource pour la communauté de la biologie synthétique de la levure. Ce kit est livré dans un format pratique de 96 puits et définit huit types de pièces d’ADN interchangeables avec une collection diversifiée de promoteurs bien caractérisés, protéines fluorescentes, terminators, étiquettes peptidiques, marqueurs de sélection, l’origine de la réplication, et les outils d’édition du génome. Cette boîte à outils permet l’assemblage d’un jusqu’à cinq unités de transcription dans un plasmide multigénique. Ces caractéristiques sont précieuses pour l’ingénierie métabolique de levure, dans laquelle les voies partielles ou entières sont sur-exprimées pour produire des produits chimiques ciblés. À l’aide de ce kit, les chercheurs ont optimisé la production de géraniol, linalool31, pénicilline32, acide muconique33, indigo34, et betalain35 dans la levure.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé, étape par étape pour guider l’utilisation de la boîte à outils MoClo pour générer des voies multigéniques pour l’expression épisomale ou génomique. Grâce à l’utilisation intensive de ce kit, nous avons constaté que la mesure précise des concentrations d’ADN est essentielle pour assurer la distribution équimolaire de chaque partie de la réaction du Golden Gate. Nous recommandons également la ligase D’ADN T4 sur la ligase d’ADN T7 parce que le premier fonctionne mieux avec un plus grand nombre de surplombs36. Enfin, tous les sites de reconnaissance interne de BsmBI et BsaI doivent être supprimés ou domestiqués avant l’assemblage. Alternativement, on peut envisager de synthétiser les pièces pour supprimer plusieurs sites internes et d’atteindre l’optimisation simultanée du codon. Nous démontrons comment utiliser cette boîte à outils en exprimant une voie à cinq gènes pour la production de β-carotène et de lycopène dans S. cerevisiae. Nous montrons en outre comment assommer le locus ADE2 à l’aide des outils d’édition du génome de ce kit. Ces expériences basées sur les couleurs ont été sélectionnées pour une visualisation facile. Nous démontrons également comment générer des protéines de fusion et créer des mutations d’acides aminés utilisant le clonage golden gate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass beads</td>
			<td>RPI research products</td>
			<td>9831</td>
			<td>For lysing yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD&#38; Company</td>
			<td>211677</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI-HFv2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3733S</td>
			<td>a highly efficient version of BsaI restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>4800-94-6</td>
			<td>Antibiotic for screening at the transcription unit level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td>Antibiotic for screening at the entry vector level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His</td>
			<td>Sunrise Sciences</td>
			<td>1006-010</td>
			<td>Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>291940</td>
			<td>Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTPs for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esp3I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0734S</td>
			<td>a highly efficient isoschizomer of BsmBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T2001</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>For carotenoid extraction from yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>Antibiotic for screening at the multigene plasmid level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Lysogenic agar medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopene</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>NC1142173</td>
			<td>For lycopene quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoClo YTK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1000000061</td>
			<td>Depositing Lab: John Deuber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>For plasmid purification from E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000c</td>
			<td>For measuring accurate DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin Sulphate</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-100</td>
			<td>Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF reaction Buffer (5X)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td>Buffer for PCR using Phusion polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>High fidelity polymerase for all the PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLM494</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100539</td>
			<td>Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvette</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>10050801</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>Ligase for Golden Gate cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851148</td>
			<td>For performing all the PCR and cloning reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Model: BBX24</td>
			<td>For homogenization of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Genesys 150</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-carotene</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAH6010603</td>
			<td>For &#946;-carotene quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning

La méthode de clonage golden gate permet l’assemblage rapide de plusieurs gènes dans n’importe quel arrangement défini par l’utilisateur. Il utilise des enzymes de restriction de type IIS qui coupent en dehors de leurs sites de reconnaissance et créent un court surplomb. Ce système modulaire de clonage (MoClo) utilise un flux de travail hiérarchique dans lequel différentes parties de l’ADN, telles que les promoteurs, les séquences de codage (CDS) et les terminateurs, sont d’abord clonées dans un vecteur d’entrée. Les vecteurs à entrées multiples se rassemblent ensuite en unités de transcription. Plusieurs unités de transcription se connectent alors à un plasmide multigénique. La stratégie de clonage golden gate est d’un énorme avantage car elle permet un assemblage sans cicatrice, directionnel et modulaire dans une réaction d’un pot. Le flux de travail hiérarchique permet généralement le clonage facile d’une grande variété de constructions multigéniques sans avoir besoin de séquençage au-delà des vecteurs d’entrée. L’utilisation d’abandons de protéines fluorescentes permet un dépistage visuel facile. Ces travaux fournissent un protocole détaillé, étape par étape pour l’assemblage de plasmides multigéniques à l’aide du kit modulaire de clonage de levures (MoClo). Nous montrons des résultats optimaux et sous-optimaux de l’assemblage de plasmides multigéniques et fournissons un guide pour le dépistage des colonies. Cette stratégie de clonage est très applicable pour l’ingénierie métabolique de levure et d’autres situations dans lesquelles le clonage plasmide multigénique est exigé.

Voici les résultats de quatre plasmides multigéniques réplicateurs pour la production de β-carotène (jaune) et de lycopène (rouge). Un plasmide multigénique intégratif pour perturber le locus ADE2 a été construit, dont les colonies sont rouges.
Clonage des CDS dans le vecteur d’entrée (pYTK001) ERG20 a été amplifié à partir du génome de levure et les trois gènes caroténo?...

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Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

L’objectif de ce protocole est de fournir un guide détaillé, étape par étape, pour l’assemblage de constructions multigéniques à l’aide du système modulaire de clonage basé sur le clonage Golden Gate. Il formule également des recommandations sur les étapes critiques pour assurer un assemblage optimal en fonction de nos expériences.

Assemblage rapide de constructions multigéniques à l’aide du clonage modulaire golden gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Il s’agit d’un protocole détaillé pour l’assemblage de plasmides multigéniques à l’aide du kit Yeast MoClo. Cette méthode permet le clonage pratique d’une variété de camarades de classe multi-gènes. Il est idéal pour générer une grande bibliothèque de pièces connexes.Commencez par mettre en place le mélange de réaction Golden Gate. Ajoutez 20 femtomoles de chaque produit PCR et le vecteur d’entrée, un microlitre de tampon Ligase 10X T4, 0,5 microlitres d’Esp3I et 0,5 microlitre de ligase T4. Ajouter de l’eau à double distillation pour porter le volume total à 10 microlitres.Ensuite, exécuter la réaction de clonage. Transformez l’ensemble du mélange de réaction en souche alpha DH5 ou en cellules escherichia coli équivalentes chimiquement compétentes par choc thermique. Étendre les cellules sur une plaque de lb avec 35 microgrammes par chloramphénicol millilitre.Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après 16 à 18 heures, sortez la plaque de l’incubateur et laissez-la à quatre degrés Celsius pendant environ cinq heures pour laisser la protéine fluorescente verte superfolder ou sfGFP se développer pour une couleur verte plus intense. Pour filtrer la plaque, placez-la sur un transilluminateur ultra-violet ou bleu clair.Le sfGFP contenant des colonies fluore sous la lumière UV. Les colonies vertes sont négatives parce qu’elles contiennent la partie non coupée plasmide. Les colonies blanches sont probablement positives.Le clonage est réussi s’il y a des colonies 30 à 100% blanches. Assembler un vecteur intermédiaire avec le connecteur gauche, le décrochage sfGFP, le connecteur droit, un marqueur de sélection de levure, une origine de levure de réplication, et la partie plasmide avec un mRFP1, une origine E.coli, et le gène résistant à l’ampicilline. Effectuez la réaction de clonage telle que décrite dans le manuscrit du texte.Transformez l’ensemble du mélange de réaction en souche ALPHA DH5 puis étalez les cellules sur une plaque de lb avec 50 microgrammes par carbenicilline millilitre ou ampicilline. Incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après 16 à 18 heures, sortir la plaque de l’incubateur.La plaque contiendra à la fois des colonies rouge pâle et vert pâle. Gardez-le à quatre degrés Celsius pendant environ cinq heures pour laisser le mRFP1 et sfGFP mûrir. Utilisez un transilluminateur uv ou bleu clair pour identifier les colonies vertes qui contiennent le vecteur intermédiaire potentiellement correct.Strié les colonies vertes sur une plaque de carbenicilline lb et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, stries à nouveau sur une plaque de chloramphéniphénol et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Les colonies qui poussent sur des plaques de chloramphénicol contiennent des plasmides mal assemblés.Une fois que le vecteur intermédiaire a été assemblé avec succès, procéder à l’assemblage des unités de transcription. Cet assemblage de quatre pièces contient le vecteur intermédiaire, un promoteur, un CDS et un déterminateur. Purifier les plasmides, enregistrer leurs concentrations, et diluer chaque plasmide à 20 femtomoles d’ADN par microlitre.Après avoir effectué la réaction de clonage, transformer l’ensemble du mélange de réaction de clonage en cellules compétentes DH5 alpha ou équivalent e.coli et les plaquer sur la carbenicilline LBN. Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après 16 à 18 heures, sortez la plaque de l’incubateur et gardez-la à quatre degrés Celsius pendant environ cinq heures pour laisser le fpSG mûrir.Utilisez un uv ou un transilluminateur de lumière bleue pour identifier les colonies blanches non fluorescentes qui contiennent les unités de transcription potentiellement correctes. Assembler un vecteur intermédiaire pour les plasmides multigéniques tel que décrit dans le manuscrit du texte. Transformez ensuite l’ensemble du mélange de réaction de clonage en cellules alpha DH5 et plaquez-les sur lb avec 50 microgrammes par kanamycine millilitre.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Effectuez le criblage rouge et vert basé sur la couleur, puis striez et cultivez les colonies vertes sur une plaque de kanamycine de lb pour dépister les erreurs d’assemblage comme démontré précédemment. Ensuite, assemblez le plasmide multigénique en mettant en place une réaction de clonage telle que décrite dans le manuscrit du texte.Transformez l’ensemble du mélange de réaction de clonage en cellules alpha DH5 et plaquez-les sur de la lb kanamycine. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Effectuez ensuite le criblage vert et blanc tel qu’il a été décrit précédemment.Ce protocole a été utilisé pour construire un plasmide multigénique intégratif pour perturber le locus ADE2. Quatre plasmides multigéniques réplicateurs et un integrative ont été assemblés. Le rapport des colonies potentiellement correctes pour le clonage vectoriel intermédiaire était de 1,83 %Une fois que le plasmide intermédiaire a été cloné, le taux de réussite de l’assemblage de plasmides multigéniques de l’intermédiaire était de 93,77 %Les nombres négligeables de colonies blanches positives démontrent un assemblage sous-optimal de plasmides multigéniques.Après s’être transformées en levure, les colonies produisant du bêta-carotène et du lycopène ont grandi le troisième jour. Quatre colonies de chaque assiette ont été striées sur des assiettes fraîches et cultivées pendant deux jours de plus. Les caroténoïdes ont été extraits et quantifiés par spectrophotométrie UV-Vis.BTS1/ERG20 conduit à une production 35 fois plus élevée de bêta-carotène par rapport à la souche avec ERG20 seul. De même, la production de lycopène est environ 16,5 fois plus élevée dans la souche BTS1/ERG20 que dans le seul ERG20. Le plasmide intégrateur multigénique a été utilisé pour la perturbation du locus ADE2, soit avec un ADN gRNA et sans ADN d’aide ou avec l’ARN et un plasmide intégrateur multigénique comme ADN d’aide.Après trois à quatre jours, des colonies rouges ont été observées sur la plaque de YPD avec nourseothricin, indiquant qu’ADE2 avait été avec succès perturbé. Tout en essayant cette méthode, la chose la plus importante à retenir est de mesurer les concentrations d’ADN avec précision et pipette soigneusement tout en mettant en place ce mélange de réaction. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de l’ingénierie métabolique de levure d’arpenter un grand nombre de gènes et de promoteurs pour maximiser le rendement du produit.

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