Name: rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Research Foundation for the State University of New York (Preis Nr. 71272) und dem IMPACT Award der University at Buffalo (Preis Nr.: 000077) finanziert.

HINWEIS: Das hierarchische Klonprotokoll, das in diesem Toolkit angeboten wird, kann in drei Hauptschritte unterteilt werden: 1. Klonen von Teilplasmiden; 2. Klontranskriptionseinheiten (TUs); 3. Klonen von Multigenplasmiden (Abbildung 1). Dieses Protokoll beginnt mit dem Primer-Design und endet mit Anwendungen des geklonten Multi-Gen-Plasmids.
1. Primer-Design zum Klonen des Teilplasmids (pYTK001):
<ol><li>Entwerfen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung...

Das von Lee et al. entwickelte MoClo-basierte Klonkit bietet eine hervorragende Ressource für die schnelle Montage von ein bis fünf Transkriptionseinheiten in ein Multi-Gen-Plasmid, entweder für die Replikation oder Integration in das Hefegenom. Die Verwendung dieses Kits eliminiert den zeitaufwändigen Klonengpass, der häufig für die Exklamierung mehrerer Gene in Hefe besteht.
Wir haben fünf verschiedene Bedingungen für die Verdauungs-/Ligationszyklen des Golden Gate Klonens mit T4 DNA...

Synthetische Biologie zielt darauf ab, biologische Systeme mit neuen Funktionalitäten zu entwickeln, die für die pharmazeutische, landwirtschaftliche und chemische Industrie nützlich sind. Die Zusammenstellung einer großen Anzahl von DNA-Fragmenten auf hochdurchsatzweise ist eine grundlegende Technologie in der synthetischen Biologie. Solch ein komplizierter Prozess kann in mehrere Ebenen mit abnehmender Komplexität zerbrechen, ein Konzept, das aus den grundlegenden Ingenieurwissenschaftenentlehntist 1,2. In der synthetischen Biologie fügen sich DNA-Fragmente in der Regel hierarchisch auf der Grundlage der Funktionalität zusammen: (i) Bauteilebene: "Teile" bezieht sich auf DNA-Fragmente mit einer bestimmten Funktion, wie z. B. einem Promotor, einer Codierungssequenz, einem Terminator, einem Ursprung der Replikation; ii) Transkriptionseinheiten (TU) Ebene: eine TU besteht aus einem Promotor, einer Kodierungssequenz und einem Terminator, der in der Lage ist, ein einzelnes Gen zu transkribieren; (iii) Multigen-Niveau: Ein Multigen-Plasmid enthält mehrere TUs, die häufig aus einem gesamten Stoffwechselweg bestehen. Diese hierarchische Montage, die von der BioBrick-Community entwickelt wurde, ist das grundlegende Konzept für die Montage großer DNAs-Sets in der Synthetischen Biologie3.
In den letzten zehn Jahren4,5,6,7, hat die Golden Gate Klontechnik die hierarchische DNA-Montage erheblich erleichtert2. Viele andere mehrteilige Klonverfahren, wie Gibson Klonen8, ligationsunabhängiges Klonen (SLIC)9, uracil Exzision-basiertes Klonen (USER)10, die Ligase-Cycling-Reaktion (LCR)11und die in vivo-Rekombination (DNA Assembler)12,13, wurden bisher entwickelt. Aber Golden Gate Klonen ist eine ideale DNA-Montagemethode, da es unabhängig von genspezifischen Sequenzen ist und eine narbenlose, gerichtete und modulare Montage in einer Ein-Topf-Reaktion ermöglicht. Golden Gate Klonen nutzt Typ IIS-Restriktionsenzyme, die eine nicht-palindromische Sequenz erkennen, um gestaffelte Überhänge außerhalb der Erkennungsstelle2zu erzeugen. Ein Ligase schließt sich dann den geglühten DNA-Fragmenten an, um eine mehrteilige Baugruppe zu erhalten. Die Anwendung dieser Klonstrategie auf das modulare Klonsystem (MoClo) hat die Zusammenstellung von bis zu 10 DNA-Fragmenten mit über 90% transformierten Transformationsmitteln ermöglicht, die das richtig montierte Konstrukt4enthalten.
Das MoClo-System bietet enorme Vorteile, die den Design-Build-Test-Zyklus der synthetischen Biologie beschleunigt haben. Erstens ermöglichen die austauschbaren Teile das kombinatorische Klonen, um einen großen Parameterraum schnell zu testen. Zum Beispiel erfordert die Optimierung eines Stoffwechselwegs in der Regel radfahren durch viele Promotoren für jedes Gen, um den Pfadfluss auszugleichen. Das MoClo-System kann solche anspruchsvollen Klonaufgaben problemlos bewältigen. Zweitens muss man das Teilplasmid sequenzieren, aber in der Regel nicht die TU oder die Multi-Gen-Plasmide. In den meisten Fällen reicht ein Screening nach Kolonie-PCR oder Restriktionsverdauung für die Überprüfung auf TU- und Multigen-Plasmid-Ebene aus. Dies liegt daran, dass das Klonen des Teilplasmids der einzige Schritt ist, der PCR erfordert, was häufig Mutationen einführt. Drittens ist das MoClo-System ideal für den Aufbau von multigenkomplexen Stoffwechselwegen. Schließlich können die Teilplasmide aufgrund der universellen Überhänge wiederverwendet und mit der gesamten Bioengineering-Community geteilt werden. Derzeit sind MoClo Kits für Pflanzen14,15,5,16,17, Pilze6,18,19,20,21,22, Bakterien7,23,24,25,26,27, und Tiere28,29. Eine Multi-Königreich MoClo Plattform wurde auch vor kurzemeingeführt 30.
Für Saccharomyces cerevisiaehaben Lee et al.6 ein vielseitiges MoClo Toolkit entwickelt, eine ausgezeichnete Ressource für die Gemeinschaft der synthetischen Hefebiologie. Dieses Kit ist in einem praktischen 96-Well-Format erhältlich und definiert acht Arten austauschbarer DNA-Teile mit einer vielfältigen Sammlung von gut charakterisierten Promotoren, fluoreszierenden Proteinen, Terminatoren, Peptid-Tags, Selektionsmarkern, Herkunft der Replikation und Genombearbeitungswerkzeugen. Dieses Toolkit ermöglicht die Zusammenstellung von bis zu fünf Transkriptionseinheiten in ein Multi-Gen-Plasmid. Diese Eigenschaften sind wertvoll für Hefe-Stoffwechsel-Engineering, in dem teilweise oder ganze Wege überexprimiert werden, um gezielte Chemikalien zu produzieren. Mit diesem Kit, Forscher haben die Produktion von Geraniol optimiert, Linalool31, Penicillin32, Muconic Säure33, Indigo34, und Betalain35 in Hefe.
Hier stellen wir ein detailliertes, Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Verfügung, das die Verwendung des MoClo-Toolkits zur Erzeugung von Multigen-Signalpfaden für episomale oder genomische Expressionen leitet. Durch den umfangreichen Einsatz dieses Kits haben wir festgestellt, dass die genaue Messung von DNA-Konzentrationen der Schlüssel ist, um die Äquimolarverteilung jedes Teils in der Golden Gate-Reaktion sicherzustellen. Wir empfehlen auch die T4 DNA Ligase über die T7 DNA Ligase, weil erstere besser funktioniert mit einer größeren Anzahl von Überhängen36. Schließlich müssen alle internen Erkennungsstellen von BsmBI und BsaI vor der Montage entfernt oder domestiziert werden. Alternativ kann man erwägen, Teile zu synthetisieren, um mehrere interne Sites zu entfernen und gleichzeitige Codon-Optimierung zu erreichen. Wir zeigen, wie dieses Toolkit verwendet wird, indem wir einen Fünf-Gen-Weg für die β-Carotin- und Lycopinproduktion in S. cerevisiae exemiten. Wir zeigen weiter, wie man den ADE2-Lokus mit den Genom-Editing-Tools aus diesem Kit ausschaltet. Diese farbbasierten Experimente wurden für eine einfache Visualisierung ausgewählt. Wir zeigen auch, wie Fusionsproteine erzeugt und Aminosäuremutationen mit Golden Gate Klonen erzeugt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass beads</td>
			<td>RPI research products</td>
			<td>9831</td>
			<td>For lysing yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD&#38; Company</td>
			<td>211677</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI-HFv2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3733S</td>
			<td>a highly efficient version of BsaI restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>4800-94-6</td>
			<td>Antibiotic for screening at the transcription unit level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td>Antibiotic for screening at the entry vector level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His</td>
			<td>Sunrise Sciences</td>
			<td>1006-010</td>
			<td>Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>291940</td>
			<td>Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTPs for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esp3I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0734S</td>
			<td>a highly efficient isoschizomer of BsmBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T2001</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>For carotenoid extraction from yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>Antibiotic for screening at the multigene plasmid level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Lysogenic agar medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopene</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>NC1142173</td>
			<td>For lycopene quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoClo YTK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1000000061</td>
			<td>Depositing Lab: John Deuber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>For plasmid purification from E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000c</td>
			<td>For measuring accurate DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin Sulphate</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-100</td>
			<td>Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF reaction Buffer (5X)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td>Buffer for PCR using Phusion polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>High fidelity polymerase for all the PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLM494</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100539</td>
			<td>Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvette</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>10050801</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>Ligase for Golden Gate cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851148</td>
			<td>For performing all the PCR and cloning reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Model: BBX24</td>
			<td>For homogenization of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Genesys 150</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-carotene</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAH6010603</td>
			<td>For &#946;-carotene quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning

Die Golden Gate Klonmethode ermöglicht die schnelle Montage mehrerer Gene in jeder benutzerdefinierten Anordnung. Es verwendet Typ IIS-Restriktionsenzyme, die außerhalb ihrer Erkennungsstellen schneiden und einen kurzen Überhang erzeugen. Dieses modulare Klonsystem (MoClo) verwendet einen hierarchischen Workflow, in dem verschiedene DNA-Teile wie Promotoren, Codierungssequenzen (CDS) und Terminatoren zunächst in einen Eintragsvektor geklont werden. Mehrere Eintragsvektoren werden dann zu Transkriptionseinheiten zusammengesetzt. Mehrere Transkriptionseinheiten verbinden sich dann mit einem Multigen-Plasmid. Die Golden Gate Klonstrategie ist von enormem Vorteil, da sie eine narbenlose, richtungsweisende und modulare Montage in einer Ein-Topf-Reaktion ermöglicht. Der hierarchische Workflow ermöglicht in der Regel das einfache Klonen einer Vielzahl von Multigenkonstrukten, ohne dass eine Sequenzierung über Eingabevektoren hinaus erforderlich ist. Die Verwendung von fluoreszierenden Proteinaussetzern ermöglicht ein einfaches visuelles Screening. Diese Arbeit bietet ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die Zusammenstellung von Multi-Gen-Plasmiden mit dem Hefe-Modul-Klonen (MoClo) Kit. Wir zeigen optimale und suboptimale Ergebnisse der Multi-Gen-Plasmid-Montage und bieten eine Anleitung für das Screening auf Kolonien. Diese Klonstrategie ist hochanwendbar für Hefestoffwechseltechnik und andere Situationen, in denen Multi-Gen-Plasmid-Klonen erforderlich ist.

Hier die Ergebnisse von vier replizierenden Multigenplasmiden zur β-Carotin (gelb) und Lycopin (rot). Es wurde ein integratives Multigen-Plasmid zur Störung des ADE2-Lokus konstruiert, dessen Kolonien rot sind.
Klonen von CDS in den Eintragsvektor (pYTK001) ERG20 wurde aus dem Hefegenom und den drei Carotinoidgenen crtE, crtYB, crtI aus dem Plasmid pLM494<sup cla...

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Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine detaillierte, schrittweise Anleitung für die Montage von Multi-Gen-Konstrukten mit dem modularen Klonsystem auf Basis des Golden Gate Klonens bereitzustellen. Es gibt auch Empfehlungen zu kritischen Schritten, um eine optimale Montage auf der Grundlage unserer Erfahrungen zu gewährleisten.

Schnelle Montage von Multi-Gen-Konstrukten mit modularem Golden Gate Klonen

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Dies ist ein detailliertes Protokoll zur Zusammenstellung von Multi-Gen-Plasmiden mit dem Yeast MoClo Kit. Diese Methode ermöglicht das bequeme Klonen einer Vielzahl von Multigen-Klassenkameraden. Es ist ideal für die Erzeugung einer großen Bibliothek von verwandten Teilen.Beginnen Sie mit dem Einrichten des Golden Gate-Reaktionsmixes. Fügen Sie 20 Femtomole jedes PCR-Produkts und den Eintragsvektor, einen Mikroliter 10X T4 Ligase Puffer, 0,5 Mikroliter Esp3I und 0,5 Mikroliter T4 Ligase hinzu. Fügen Sie doppelt destilliertes Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Mikroliter zu bringen.Führen Sie dann die Klonreaktion aus. Verwandeln Sie den gesamten Reaktionsmix durch Hitzeschock in den DH5-Alphastamm oder gleichwertige escherichia coli chemisch kompetente Zellen. Verteilen Sie die Zellen auf einer lb Platte mit 35 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol.Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach 16 bis 18 Stunden nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie sie bei vier Grad Celsius für etwa fünf Stunden, um das superfolder grüne fluoreszierende Protein oder sfGFP für eine intensivere grüne Farbe entwickeln zu lassen. Um die Platte zu abschirmen, legen Sie sie auf einen ultravioletten oder blauen Lichttransilluminator.Die sfGFP enthält Kolonien wird unter dem UV-Licht fluoreszieren. Die grünen Kolonien sind negativ, weil sie das ungeschnittene Teilplasmid enthalten. Die weißen Kolonien sind wahrscheinlich positiv.Das Klonen ist erfolgreich, wenn es 30 bis 100% weiße Kolonien gibt. Montieren Sie einen Zwischenvektor mit dem linken Verbinder, dem sfGFP-Aussetzer, dem rechten Stecker, einem Hefeauswahlmarker, einem Hefeursprung der Replikation und dem Teilplasmid mit einem mRFP1, einem E.coli-Ursprung und dem Ampicillin-resistenten Gen. Führen Sie die Klonreaktion aus, wie im Textmanuskript beschrieben.Verwandeln Sie den gesamten Reaktionsmix in den DH5-Alpha-Stamm und verteilen Sie dann die Zellen auf einer lb-Platte mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Carbenicillin oder Ampicillin. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach 16 bis 18 Stunden die Platte aus dem Brutkasten nehmen.Die Platte wird sowohl blassrote als auch hellgrüne Kolonien enthalten. Halten Sie es bei vier Grad Celsius für etwa fünf Stunden, um die mRFP1 und sfGFP reifen zu lassen. Verwenden Sie einen UV- oder Blaulichttransilluminator, um die grünen Kolonien zu identifizieren, die den potenziell korrekten Zwischenvektor enthalten.Streifen Sie die grünen Kolonien auf einer lb Carbenicillin Platte und inkubieren bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag, streifen Sie sie wieder auf einer Chloramphenicol-Platte und inkubieren bei 37 Grad Celsius über Nacht. Die Kolonien, die auf Chloramphenicolplatten wachsen, enthalten falsch zusammengesetzte Plasmide.Nachdem der Zwischenvektor erfolgreich montiert wurde, fahren Sie mit der Montage der Transkriptionseinheiten fort. Diese vierteilige Baugruppe enthält den Zwischenvektor, einen Promotor, ein CDS und einen Determinator. Reinigen Sie die Plasmide, erfassen Sie ihre Konzentrationen und verdünnen Sie jedes Plasmid auf 20 Femtomole DNA pro Mikroliter.Nach der Durchführung der Klonreaktion, transformieren Sie den gesamten Klon-Reaktionsmix in die DH5 alpha oder gleichwertige E.coli-fähige Zellen und verplatten sie auf LBN-Carbenicillin. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach 16 bis 18 Stunden die Platte aus dem Brutkasten nehmen und bei vier Grad Celsius für etwa fünf Stunden aufbewahren, um die sfGFP reifen zu lassen.Verwenden Sie einen UV- oder einen Blaulichttransilluminator, um die nicht fluoreszierenden weißen Kolonien zu identifizieren, die die potenziell korrekten Transkriptionseinheiten enthalten. Stellen Sie einen Zwischenvektor für die Multigenplasmide zusammen, wie im Textmanuskript beschrieben. Dann transformieren Sie den gesamten Klonreaktionsmix in DH5-Alphazellen und verzieren Sie sie mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin auf lb.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius über Nacht. Führen Sie rote und grüne farbbasierte Screening, dann Streifen und wachsen die grünen Kolonien auf einer lb Kanamycin-Platte auf Fehlbaugruppen zu überprüfen, wie zuvor gezeigt. Als nächstes montieren Sie das Multi-Gen-Plasmid, indem Sie eine Klonreaktion einrichten, wie im Textmanuskript beschrieben.Verwandeln Sie den gesamten Klon-Reaktionsmix in DH5-Alpha-Zellen und platten Sie sie auf lb Kanamycin. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius über Nacht. Führen Sie dann das Grün-Weiß-Screening wie zuvor beschrieben durch.Dieses Protokoll wurde verwendet, um ein integratives Multi-Gen-Plasmid zu konstruieren, um den ADE2-Lokus zu stören. Vier reproduzierte und ein integratives Multigenplasmide wurden zusammengesetzt. Das Verhältnis der potenziell korrekten Kolonien für das Intermediär-Vektorklonen betrug 1,83%Sobald das Zwischenplasmid geklont wurde, betrug die Erfolgsrate der Zusammenstellung von Multigenplasmiden aus dem Zwischenprodukt 93,77%Die vernachlässigbare Anzahl positiver weißer Kolonien zeigt eine suboptimale Zusammensetzung von Multigenplasmiden.Nach der Umwandlung in Hefe wuchsen die Kolonien, die Beta-Carotin und Lycopin produzierten, am dritten Tag. Vier Kolonien von jedem Teller wurden auf frische Teller gestreift und für zwei weitere Tage angebaut. Die Carotinoide wurden durch UV-Vis-Spektrophotometrie extrahiert und quantifiziert.BTS1/ERG20 führt allein mit ERG20 zu einer 35-fach höheren Beta-Carotin-Produktion. Ebenso ist die Produktion von Lycopin mit BTS1/ERG20 etwa 16,5-fach höher als bei ERG20 allein. Das multigene integrative Plasmid wurde zur Störung des ADE2-Lokus verwendet, entweder mit einer gRNA und ohne Helfer-DNA oder mit gRNA und einem multigenintegrativen Plasmid als Helfer-DNA.Nach drei bis vier Tagen wurden rote Kolonien auf der YPD-Platte mit Nourseothricin beobachtet, was darauf hindeutet, dass ADE2 erfolgreich gestört wurde. Beim Versuch dieser Methode ist das Wichtigste, sich daran zu erinnern, die DNA-Konzentrationen genau zu messen und Pipette sorgfältig zu messen, während dieser Reaktionsmix eingerichtet wird. Diese Technik ermöglicht es Forschern auf dem Gebiet der Hefe Metabolic Engineering, eine große Anzahl von Genen und Promotern für maximale Produktausbeute zu vermessen.

Research

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