Name: rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר של אוניברסיטת מדינת ניו יורק (פרס #: 71272) ופרס IMPACT של האוניברסיטה בבאפלו (פרס #: 000077).

הערה: ניתן לחלק את פרוטוקול השיבוט ההירארכי המוצע בעורק כלים זה לשלושה שלבים עיקריים: 1. שיבוט פלסמידים של חלקים; 2. יחידות תעתיק שיבוט (TUs); 3. שיבוט פלסמידים מרובי גנים (איור 1). פרוטוקול זה מתחיל מעיצוב פריימר ומסתיים ביישומים של פלסמיד מרובה גנים משובטים.
1. עיצו...

ערכת השיבוט המבוססת על MoClo שפותחה על ידי Lee et al. מספקת משאב מצוין להרכבה מהירה של אחת עד חמש יחידות שעתוק לפלסמיד מרובה גנים או לשכפול או להשתלבות בגנום השמרים. השימוש בערכה זו מבטל את צוואר הבקבוק של שיבוט זמן רב שקיים לעתים קרובות להבעת גנים מרובים בשמרים.
בדקנו חמישה תנאים ?...

ביולוגיה סינתטית שואפת להנדס מערכות ביולוגיות עם פונקציות חדשות שימושיות לתעשיות פרמצבטיות, חקלאיות וכימיות. הרכבת מספר רב של שברי דנ"א באופן בעל תפוקה גבוהה היא טכנולוגיה בסיסית בביולוגיה סינתטית. תהליך מסובך כזה יכול להתפרק לרמות מרובות עם ירידה במורכבות, מושג המושאל ממדעי ההנדסה הבסיסית1,2. בביולוגיה סינתטית, שברי DNA בדרך כלל להרכיב באופן היררכי מבוסס על פונקציונליות: (i) רמת חלק: "חלקים" מתייחס שברי DNA עם פונקציה מסוימת, כגון מקדם, רצף קידוד, שליחות קטלנית, מקור של שכפול; (ii) רמת יחידות שעתוק (TU): TU מורכב ממקדם, רצף קידוד ומחסל המסוגל לתמלל גן יחיד; (iii) רמה מרובת גנים: פלסמיד מרובה גנים מכיל מספר TUs המורכב לעתים קרובות ממסלול מטבולי שלם. הרכבה היררכית זו חלוצה על ידי קהילת BioBrick היא מושג היסוד להרכבה של קבוצות גדולות של DNAs בביולוגיה סינתטית3.
בעשור האחרון4,5,6,7, טכניקת השיבוט שער הזהב אפשרה באופן משמעותי הרכבה DNA היררכית2. שיטות שיבוט מרובות חלקים רבים אחרים, כגון שיבוט גיבסון8, שיבוט עצמאי קשירה (SLIC)9, שיבוט מבוסס כריתת uracil (USER)10, תגובת רכיבה על אופניים ליגאז (LCR)11, ו ב vivo רקומבינציה (DNA Assembler)12,13, פותחו גם עד כה. אבל שיבוט שער הזהב הוא שיטת הרכבת DNA אידיאלית משום שהוא אינו תלוי ברצפים ספציפיים לגנים, ומאפשר הרכבה נטולת צלקת, כיוונית ומודולרית בתגובת סיר אחד. שיבוט שער הזהב מנצל אנזימי הגבלה מסוג IIS המזהים רצף לא פלינדרומי ליצירת מעליות מתנדנדות מחוץ לאתר הזיהוי2. לאחר מכן, ליגאז מצטרף לרסיסי הדנ"א ה Annealed כדי להשיג הרכבה מרובת חלקים. החלת אסטרטגיית שיבוט זו על מערכת שיבוט מודולרי (MoClo) אפשרה הרכבה של עד 10 שברי DNA עם מעל 90% transformants מוקרן המכיל את המבנה שהורכב כראוי4.
מערכת MoClo מציעה יתרונות עצומים שהאיצו את מחזור התכנון-מבחן של הביולוגיה הסינתטית. ראשית, החלקים הניתנים להחלפה מאפשרים שיבוט קומבינטורי כדי לבחון מרחב גדול של פרמטרים במהירות. לדוגמה, אופטימיזציה של מסלול מטבולי בדרך כלל דורש רכיבה על אופניים דרך מקדמים רבים עבור כל גן כדי לאזן את שטף המסלול. מערכת MoClo יכולה להתמודד בקלות עם משימות שיבוט תובעניות כאלה. שנית, יש לרצף את החלק פלסמיד אך בדרך כלל לא את ה- TU או את הפלסמידים מרובי הגנים. ברוב המקרים, הקרנה על ידי PCR המושבה או הגבלת העיכול מספיק לאימות ברמת TU ו פלסמיד רב גנים. הסיבה לכך היא שיבוט פלסמיד החלק הוא הצעד היחיד הדורש PCR, אשר לעתים קרובות מציג מוטציות. שלישית, מערכת MoClo אידיאלית לבניית מסלולים מטבוליים מורכבים מרובי גנים. לבסוף, בגלל ההסתבכויות האוניברסליות, ניתן לעשות שימוש חוזר בחלקים ולשתף אותם עם הקהילה הביו-הנדסהית כולה. נכון לעכשיו, ערכות MoClo זמינות עבורצמחים 14,15,5,16,17, פטריות6,18,19,20 ,21,22,חיידקים7,23,24,25,26,27, ובעליחיים 28,29. פלטפורמת MoClo רב ממלכות הוצגה גם לאחרונה30.
עבור Saccharomyces cerevisiae, Lee et al.6 פיתחו ערכת כלים רב-תכליתית MoClo, משאב מצוין לקהילת הביולוגיה הסינתטית שמרים. ערכה זו מגיעה במתכונת נוחה של 96 בארות ומגדירה שמונה סוגים של חלקי דנ"א הניתנים להחלפה עם אוסף מגוון של מקדמים מאופיינים היטב, חלבונים פלואורסצנטיים, מחסלים, תגי פפטיד, סמני בחירה, מקור השכפול וכלי עריכת הגנום. ערכת כלים זו מאפשרת הרכבה של עד חמש יחידות שעתוק לפלסמיד מרובה גנים. תכונות אלה הן בעלות ערך עבור הנדסה מטבולית שמרים, שבו מסלולים חלקיים או שלמים מבוטאים יתר על המידה כדי לייצר כימיקלים ממוקדים. באמצעות ערכה זו, החוקרים יש אופטימיזציה הייצור של geraniol, linalool31, פניצילין32, חומצה מוקונית33, אינדיגו34, ו betalain35 בשמרים.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד כדי להנחות את השימוש בערכת הכלים MoClo כדי ליצור מסלולים מרובי גנים עבור ביטוי אפיזומלי או גנומי. באמצעות שימוש נרחב בערכה זו, מצאנו כי המדידה המדויקת של ריכוזי DNA היא המפתח להבטחת התפלגות שווה השוויון של כל חלק בתגובת שער הזהב. אנו ממליצים גם על ליגאז DNA T4 על ליגאז DNA T7 כי לשעבר עובד טוב יותר עם מספר גדול יותר של overhangs36. לבסוף, יש להסיר או לביית אתרי זיהוי פנימיים של BsmBI ו- BsaI לפני ההרכבה. לחלופין, ניתן לשקול סינתזה של חלקים כדי להסיר אתרים פנימיים מרובים ולהשיג אופטימיזציה של קודון בו זמנית. אנו מדגימים כיצד להשתמש בערכת כלים זו על ידי הבעת מסלול של חמישה גנים לייצור β קרוטן וליקופן ב- S. cerevisiae. אנו מראים עוד כיצד לדפוק את לוקוס ADE2 באמצעות כלי עריכת הגנום מערכה זו. ניסויים מבוססי צבע אלה נבחרו להדמיה קלה. אנו גם מדגימים כיצד ליצור חלבוני היתוך וליצור מוטציות חומצות אמינו באמצעות שיבוט שער הזהב.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass beads</td>
			<td>RPI research products</td>
			<td>9831</td>
			<td>For lysing yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD&#38; Company</td>
			<td>211677</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI-HFv2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3733S</td>
			<td>a highly efficient version of BsaI restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>4800-94-6</td>
			<td>Antibiotic for screening at the transcription unit level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td>Antibiotic for screening at the entry vector level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His</td>
			<td>Sunrise Sciences</td>
			<td>1006-010</td>
			<td>Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>291940</td>
			<td>Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTPs for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esp3I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0734S</td>
			<td>a highly efficient isoschizomer of BsmBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T2001</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>For carotenoid extraction from yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>Antibiotic for screening at the multigene plasmid level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Lysogenic agar medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopene</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>NC1142173</td>
			<td>For lycopene quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoClo YTK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1000000061</td>
			<td>Depositing Lab: John Deuber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>For plasmid purification from E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000c</td>
			<td>For measuring accurate DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin Sulphate</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-100</td>
			<td>Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF reaction Buffer (5X)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td>Buffer for PCR using Phusion polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>High fidelity polymerase for all the PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLM494</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100539</td>
			<td>Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvette</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>10050801</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>Ligase for Golden Gate cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851148</td>
			<td>For performing all the PCR and cloning reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Model: BBX24</td>
			<td>For homogenization of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Genesys 150</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-carotene</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAH6010603</td>
			<td>For &#946;-carotene quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning

שיטת השיבוט שער הזהב מאפשרת הרכבה מהירה של גנים מרובים בכל סידור המוגדר על ידי המשתמש. היא משתמשת באנזימי הגבלת IIS מסוג שחותכים מחוץ לאתרי הזיהוי שלהם ויוצרים עקיפה קצרה. מערכת שיבוט מודולרית (MoClo) זו משתמשת בזרימת עבודה הירארכית שבה חלקי דנ"א שונים, כגון מקדמים, רצפי קידוד (CDS) ומחסלים, משוכפלים תחילה לווקטור כניסה. לאחר מכן, וקטורים מרובים של הזנה מתאספים ליחידות שעתוק. מספר יחידות שעתוק מתחברות לפלסמיד מרובה גנים. אסטרטגיית השיבוט של שער הזהב היא בעלת יתרון עצום משום שהיא מאפשרת הרכבה נטולת צלקת, כיוונית ומודולרית בתגובת סיר אחד. זרימת העבודה ההיררכית מאפשרת בדרך כלל שיבוט קל של מגוון רחב של מבנים מרובי גנים ללא צורך ברצף מעבר לווקטורים של כניסה. השימוש בנשירה של חלבונים פלואורסצנטיים מאפשר סינון חזותי קל. עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד להרכבת פלסמידים מרובי גנים באמצעות ערכת שיבוט מודולרי שמרים (MoClo). אנו מראים תוצאות אופטימליות ותת-אופטימליות של הרכבה מרובת גנים ומספקים מדריך להקרנה למושבות. אסטרטגיית שיבוט זו ישימה מאוד עבור הנדסה מטבולית שמרים ומצבים אחרים שבהם שיבוט פלסמיד רב גנים נדרש.

כאן התוצאות של ארבעה פלסמידים מרובי גנים משוכפלים לייצור β קרוטן (צהוב) וליקופן (אדום). פלסמיד רב-גנים אינטגרטיבי אחד לשיבוש מוקד ADE2 נבנה, שהמושבות שלו אדומות.
שכפול תקליטורים לווקטור הערך (pYTK001) ERG20 הוגבר מגנום השמרים ו...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning at JoVE.com

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

זהו פרוטוקול מפורט להרכבת פלסמידים מרובי גנים באמצעות ערכת שמרים MoClo. שיטה זו מאפשרת שיבוט נוח של מגוון חברים לכיתה מרובי גנים. הוא אידיאלי ליצירת ספרייה גדולה של חלקים קשורים.התחל על ידי הגדרת תערובת התגובה של שער הזהב. הוסף 20 femtomoles של כל מוצר PCR ואת וקטור הכניסה, microliter אחד של מאגר ליגאז 10X T4, 0.5 microliters של Esp3I, ו 0.5 microliters של ליגאז T4. הוסיפו מים מזוקקים כפולים כדי להביא את הנפח הכולל ל-10 מיקרוליטרים.לאחר מכן, הפעל את תגובת השיבוט. להפוך את תערובת התגובה כולה לתוך זן אלפא DH5 או שווה ערך Escherichia coli תאים כימיים מוסמכים על ידי הלם חום. מורחים את התאים על צלחת ליברות עם 35 מיקרוגרם למיליליטר כלוראמפניקול.ואז להדגיר את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר 16 עד 18 שעות, מוציאים את הצלחת מהחממה ומשאירים אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך כחמש שעות כדי לאפשר לחלבון הפלואורסצנטי הירוק או ל- sfGFP להתפתח לצבע ירוק אינטנסיבי יותר. כדי לסנן את הצלחת, הנח אותה על טרנסילומינטור אולטרה סגול או כחול.SfGFP המכיל מושבות יהיה פלואורסצנטי תחת אור UV. המושבות הירוקות שליליות משום שהן מכילות את החלק הלא מלוטש פלסמיד. המושבות הלבנות הן כנראה חיוביות.השיבוט יצליח אם יש 30 עד 100% מושבות לבנות. להרכיב וקטור ביניים עם המחבר השמאלי, נשירה sfGFP, המחבר הימני, סמן בחירת שמרים, מקור שמרים של שכפול, ואת החלק plasmid עם mRFP1, מקור E.coli, ואת הגן עמיד אמפילין. בצע את תגובת השיבוט כמתואר בכתב היד של הטקסט.להפוך את תערובת התגובה כולה לתוך זן אלפא DH5 ואז להפיץ את התאים על צלחת lb עם 50 מיקרוגרם לכל מיליליטר קרבניצילין או אמפיצילין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר 16 עד 18 שעות, מוציאים את הצלחת מהחממה.הצלחת תכיל מושבות אדומות חיוורות וירוקות חיוורות. שמור את זה על ארבע מעלות צלזיוס במשך כחמש שעות כדי לאפשר mRFP1 ו sfGFP להתבגר. השתמש טרנסילומינטור UV או אור כחול כדי לזהות את המושבות הירוקות המכילות וקטור ביניים פוטנציאל נכון.פסים את המושבות הירוקות על צלחת קרבניצילין lb והדגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, פס אותם שוב על צלחת כלוראמפניקול ודגר ב 37 מעלות צלזיוס לילה. המושבות הגדלות על לוחות כלוראמפניקול מכילות פלסמידים שהורמסו שלא כהלכה.לאחר שווקטור הביניים הורכב בהצלחה, המשך בהרכבת יחידות התמלול. הרכבה זו בת ארבעת החלקים מכילה את וקטור הביניים, מקדם, תקליטור ודטרקטור. לטהר את הפלסמידים, לתעד את הריכוזים שלהם, ולדלל כל פלסמיד ל 20 femtomoles של DNA לכל מיקרוליטר.לאחר ביצוע תגובת השיבוט, להפוך את כל תערובת תגובת שיבוט לתוך אלפא DH5 או שווה ערך E.coli תאים מוסמכים צלחת אותם על קרבניצילין LBN. ואז להדגיר את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר 16 עד 18 שעות, מוציאים את הצלחת מהחממה ושומרים אותה על ארבע מעלות צלזיוס למשך כחמש שעות כדי לאפשר ל- sfGFP להתבגר.השתמש UV או transilluminator אור כחול כדי לזהות את המושבות הלבנות שאינן פלואורסצנטיות המכילות את יחידות שעתוק פוטנציאל נכון. להרכיב וקטור ביניים עבור פלסמידים מרובי גנים כמתואר בכתב היד טקסט. לאחר מכן להפוך את כל תערובת תגובת שיבוט לתוך תאי אלפא DH5 צלחת אותם על lb עם 50 מיקרוגרם למיליליטר kanamycin.דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. בצע הקרנה מבוססת צבע אדום וירוק, ולאחר מכן פס ולהגדיל את המושבות הירוקות על צלחת kanamycin lb כדי למסך עבור הרכבות שגויות כפי שהוכח קודם לכן. לאחר מכן, להרכיב את פלסמיד רב גנים על ידי הגדרת תגובת שיבוט כמתואר בכתב היד טקסט.להפוך את כל תערובת תגובת שיבוט לתוך תאי אלפא DH5 צלחת אותם על lb kanamycin. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר מכן בצע את ההקרנה בירוק ולבן כפי שתואר קודם לכן.פרוטוקול זה שימש לבניית פלסמיד רב-גנים אינטגרטיבי אחד לשיבוש מוקד ADE2. ארבעה פלסמידים משוכפלים ואחד רב-גנים אינטגרטיבי הורכבו. היחס בין מושבות שעשויות להיות נכונות לשיבוט וקטור הביניים היה 1.83% לאחר שפלסמיד הביניים שוכפל, שיעור ההצלחה של הרכבת פלסמידים מרובי גנים מהבינוניים היה 93.77% המספרים הזניחים של מושבות לבנות חיוביות מדגימים הרכבה תת-אופטימלית של פלסמידים מרובי גנים.לאחר שהפכו לשמרים, מושבות המייצרות בטא קרוטן וליקופן גדלו ביום השלישי. ארבע מושבות מכל צלחת היו מפוספסות על צלחות טריות וגדלו במשך יומיים נוספים. הקרוטנואידים חולצו וכומתו על ידי ספקטרופוטומיית UV-Vis.BTS1/ERG20 מוביל לייצור גבוה פי 35 של בטא קרוטן בהשוואה למתח עם ERG20 בלבד. כמו כן, הייצור של ליקופן הוא כ 16.5 קיפול גבוה יותר בזן עם BTS1/ERG20 לעומת ERG20 לבד. הפלסמיד האינטגרטיבי הרב-גנים שימש לשיבוש מוקד ADE2, בין אם עם gRNA ובין אם ללא דנ"א עוזר או עם gRNA ופלסמיד אינטגרטיבי מרובה גנים כדנ"א עוזר.לאחר שלושה עד ארבעה ימים, מושבות אדומות נצפו על לוחית YPD עם Nourseothricin, המציין כי ADE2 שובש בהצלחה. בעת ניסיון שיטה זו, הדבר החשוב ביותר לזכור הוא למדוד את ריכוזי ה- DNA במדויק פיפטה בזהירות בעת הגדרת תערובת תגובה זו. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום ההנדסה המטבולית שמרים לסקר מספר רב של גנים ויחצנים עבור תפוקת מוצר מקסימלית.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

כדאיות של מבנים ניידים Bioprinted באמצעות מדפסת הקרטזיאני Dispenser שלוש

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized בונה בעזרת רקמות ספציפיות הידרוג&#39;ל Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

בונה אלגינט Layered: פלטפורמה עבור Co-תרבות של אוכלוסיות תאים הטרוגניות

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

טיפול של רצועות ליגמנט עם תרגיל ממוזג בסרום: רקמות תרגום הנדסה דגם

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

הייצור של מהונדסים אוגרים סוריים הזהב באמצעות הזרקת Pronuclear של המתחם CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...