Name: rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00
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इस काम को रिसर्च फाउंडेशन फॉर स्टेट यूनिवर्सिटी ऑफ न्यूयॉर्क (अवार्ड #: 71272) और यूनिवर्सिटी एट बफेलो (अवार्ड #: 000077) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

नोट: इस टूलकिट में पेश किए गए पदानुक्रमित क्लोनिंग प्रोटोकॉल को तीन प्रमुख चरणों में विभाजित किया जा सकता है: 1. क्लोनिंग भाग प्लाज्मिड; 2. क्लोनिंग ट्रांसक्रिप्शन इकाइयां (TUs); 3. मल्टी-जीन प्लाज्मिड्स की क...

ली एट अल द्वारा विकसित MoClo आधारित क्लोनिंग किट एक से पांच प्रतिलेखन इकाइयों की त्वरित असेंबली के लिए एक बहु-जीन प्लाज्मिड में या तो खमीर जीनोम में प्रतिकृति या एकीकरण के लिए एक उत्कृष्ट संसाधन प्रदान कर...

सिंथेटिक जीव विज्ञान का उद्देश्य दवा, कृषि और रासायनिक उद्योगों के लिए उपयोगी नई कार्यक्षमताओं के साथ जैविक प्रणालियों को इंजीनियर करना है। एक उच्च थ्रूपुट तरीके से डीएनए के टुकड़ों की बड़ी संख्या कोडांतरण सिंथेटिक जीव विज्ञान में एक मूलभूत प्रौद्योगिकी है । इस तरह की जटिल प्रक्रिया जटिलता को कम करने के साथ कई स्तरों में टूट सकती है, बुनियादी इंजीनियरिंग विज्ञान1,2से उधार ली गई अवधारणा। सिंथेटिक जीव विज्ञान में, डीएनए टुकड़े आमतौर पर कार्यक्षमता के आधार पर पदानुक्रम से इकट्ठा होते हैं: (i) भाग स्तर: "भाग" एक विशिष्ट कार्य के साथ डीएनए टुकड़ों को संदर्भित करता है, जैसे कि प्रमोटर, एक कोडिंग अनुक्रम, एक टर्मिनेटर, प्रतिकृति की उत्पत्ति; (ii) ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों (टीयू) स्तर: एक टीयू में एक प्रमोटर, एक कोडिंग अनुक्रम और एक एकल जीन को पार करने में सक्षम टर्मिनेटर होता है; (iii) बहु-जीन स्तर एक बहु-जीन प्लाज्मिड में कई टीयू होते हैं जिनमें अक्सर एक संपूर्ण मेटाबोलिक मार्ग शामिल होता है । बायोब्रिक समुदाय द्वारा बीड़ा उठाया गया यह पदानुक्रमित असेंबली सिंथेटिक जीव विज्ञान3में डीएनए के बड़े सेटों की असेंबली के लिए मूलभूत अवधारणा है।
पिछले4, 5,6,7दशक में गोल्डन गेट क्लोनिंग तकनीक ने पदानुक्रमित डीएनए असेंबली2को काफी सुविधा प्रदान की है . गिब्सन क्लोनिंग8,लिगेशन-इंडिपेंडेंट क्लोनिंग (एससीआईएल)9,यूरासिल एक्सिशन-बेस्ड क्लोनिंग (यूजर)10,लिगास साइक्लिंग रिएक्शन (एलसीआर) 11 और वीवो रिकॉम्बिनेशन (डीएनए असेंबलर)12,13जैसे कई अन्य मल्टी-पार्ट क्लोनिंग तरीके भी अब तक विकसित किए गए हैं । लेकिन गोल्डन गेट क्लोनिंग एक आदर्श डीएनए विधानसभा विधि है क्योंकि यह जीन विशिष्ट दृश्यों से स्वतंत्र है, एक बर्तन प्रतिक्रिया में निशान कम, दिशात्मक, और मॉड्यूलर विधानसभा की अनुमति । गोल्डन गेट क्लोनिंग प्रकार IIS प्रतिबंध एंजाइमों का लाभ लेता है जो मान्यता साइट2के बाहर कंपित ओवरहैंग बनाने के लिए एक गैर-पैलिंड्रोमिक अनुक्रम को पहचानते हैं। एक ligase तो एक बहु भाग विधानसभा प्राप्त करने के लिए annealed डीएनए टुकड़े में मिलती है । मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) प्रणाली के लिए इस क्लोनिंग रणनीति लागू करने के लिए 90% से अधिक परिवर्तनकर्ताओं सही ढंग से इकट्ठे निर्माण4युक्त जांच के साथ 10 डीएनए टुकड़े करने के लिए इकट्ठा सक्षम है।
MoClo प्रणाली जबरदस्त लाभ है कि सिंथेटिक जीव विज्ञान के डिजाइन निर्माण परीक्षण चक्र में तेजी आई है प्रदान करता है । सबसे पहले, इंटरचेंजेबल हिस्से तेजी से मापदंडों की एक बड़ी जगह का परीक्षण करने के लिए संयोजन क्लोनिंग को सक्षम करते हैं। उदाहरण के लिए, मेटाबोलिक मार्ग का अनुकूलन आमतौर पर मार्ग प्रवाह को संतुलित करने के लिए प्रत्येक जीन के लिए कई प्रमोटरों के माध्यम से साइकिल चालन की आवश्यकता होती है। MoClo प्रणाली आसानी से इस तरह की मांग क्लोनिंग कार्यों को संभाल कर सकते हैं । दूसरे, एक भाग प्लाज्मिड अनुक्रम की जरूरत है, लेकिन आम तौर पर नहीं टीयू या बहु जीन प्लाज्मिड । ज्यादातर मामलों में, कॉलोनी पीसीआर द्वारा स्क्रीनिंग या प्रतिबंध पाचन टीयू और बहु-जीन प्लाज्मिड स्तर पर सत्यापन के लिए पर्याप्त है। इसका कारण यह है कि भाग प्लाज्मिड क्लोनिंग पीसीआर की आवश्यकता होती है, जो अक्सर म्यूटेशन का परिचय देता है। तीसरा, MoClo प्रणाली बहु जीन जटिल मेटाबोलिक रास्ते के निर्माण के लिए आदर्श है । अंत में, सार्वभौमिक ओवरहैंग के कारण, भाग प्लाज्मिड को पूरे बायोइंजीनियरिंग समुदाय के साथ पुन: इस् तेमित और साझा किया जा सकता है। वर्तमान में, 14 ,15, 5,16,17,कवक 6,18, 19,20,21,22,बैक्टीरिया 7 ,23,24, 25,26,27,और जानवरों केलिए 28,29पौधों के लिए MoClo किट उपलब्ध हैं। हाल ही में30को एक मल्टी-किंगडम मोक्लो प्लेटफॉर्म भी पेश किया गया है ।
सैकरोमाइसेस सेरेविसिया केलिए, ली एट अल6 ने एक बहुमुखी मोक्लो टूलकिट विकसित किया है, जो खमीर सिंथेटिक जीव विज्ञान समुदाय के लिए एक उत्कृष्ट संसाधन है। यह किट एक सुविधाजनक 96-अच्छी तरह से प्रारूप में आती है और अच्छी तरह से विशेषता वाले प्रमोटरों, फ्लोरोसेंट प्रोटीन, टर्मिनेटर, पेप्टाइड टैग, चयन मार्कर, प्रतिकृति की उत्पत्ति और जीनोम संपादन उपकरणों के विविध संग्रह के साथ आठ प्रकार के विनिमेय डीएनए भागों को परिभाषित करती है। यह टूलकिट एक बहु-जीन प्लाज्मिड में पांच ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों की असेंबली की अनुमति देता है। ये विशेषताएं खमीर मेटाबोलिक इंजीनियरिंग के लिए मूल्यवान हैं, जिसमें लक्षित रसायनों का उत्पादन करने के लिए आंशिक या पूरे रास्ते अधिक व्यक्त किए जाते हैं। इस किट का उपयोग करते हुए, शोधकर्ताओं ने खमीर में जेरनियाल, लिनालूल31,पेनिसिलिन32,म्यूकोनिक एसिड33,इंडिगो34और बेतालिन35 के उत्पादन को अनुकूलित किया है।
यहां हम या तो एपिसोमल या जीनोमिक अभिव्यक्ति के लिए बहु-जीन रास्ते उत्पन्न करने के लिए MoClo टूलकिट के उपयोग का मार्गदर्शन करने के लिए एक विस्तृत, कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस किट के व्यापक उपयोग के माध्यम से, हमने पाया है कि डीएनए सांद्रता का सटीक माप गोल्डन गेट प्रतिक्रिया में प्रत्येक भाग के सममोलीय वितरण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम टी 7 डीएनए लिगाज़ पर टी 4 डीएनए लिगाज़ की भी सलाह देते हैं क्योंकि पूर्व में अधिक संख्या में ओवरहैंग्स36के साथ बेहतर काम करता है। अंत में, बीएसएमबीआई और बीएसएआई के किसी भी आंतरिक मान्यता स्थलों को विधानसभा से पहले हटाया जाना चाहिए या पालतू होना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, कोई भी कई आंतरिक साइटों को हटाने और एक साथ कोडन अनुकूलन प्राप्त करने के लिए भागों को संश्लेषित करने पर विचार कर सकता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि एस सेरेविसिया में β-कैरोटीन और लाइकोपीन उत्पादन के लिए पांच जीन मार्ग व्यक्त करके इस टूलकिट का उपयोग कैसे करें। हम आगे दिखाते हैं कि इस किट से जीनोम-संपादन उपकरणों का उपयोग करके ADE2 लोकस को कैसे खटखटाया जाए। इन रंग आधारित प्रयोगों को आसान दृश्य के लिए चुना गया था। हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि फ्यूजन प्रोटीन कैसे उत्पन्न करें और गोल्डन गेट क्लोनिंग का उपयोग करके अमीनो एसिड म्यूटेशन बनाएं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass beads</td>
			<td>RPI research products</td>
			<td>9831</td>
			<td>For lysing yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD&#38; Company</td>
			<td>211677</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI-HFv2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3733S</td>
			<td>a highly efficient version of BsaI restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>4800-94-6</td>
			<td>Antibiotic for screening at the transcription unit level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td>Antibiotic for screening at the entry vector level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His</td>
			<td>Sunrise Sciences</td>
			<td>1006-010</td>
			<td>Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>291940</td>
			<td>Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTPs for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esp3I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0734S</td>
			<td>a highly efficient isoschizomer of BsmBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T2001</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>For carotenoid extraction from yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>Antibiotic for screening at the multigene plasmid level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Lysogenic agar medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopene</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>NC1142173</td>
			<td>For lycopene quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoClo YTK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1000000061</td>
			<td>Depositing Lab: John Deuber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>For plasmid purification from E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000c</td>
			<td>For measuring accurate DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin Sulphate</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-100</td>
			<td>Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF reaction Buffer (5X)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td>Buffer for PCR using Phusion polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>High fidelity polymerase for all the PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLM494</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100539</td>
			<td>Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvette</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>10050801</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>Ligase for Golden Gate cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851148</td>
			<td>For performing all the PCR and cloning reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Model: BBX24</td>
			<td>For homogenization of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Genesys 150</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-carotene</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAH6010603</td>
			<td>For &#946;-carotene quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning

गोल्डन गेट क्लोनिंग विधि किसी भी उपयोगकर्ता परिभाषित व्यवस्था में कई जीन की तेजी से विधानसभा सक्षम बनाता है । यह प्रकार IIS प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करता है जो उनकी मान्यता साइटों के बाहर काटते हैं और एक छोटी अधिकता बनाते हैं। यह मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) प्रणाली एक पदानुक्रमित कार्यप्रवाह का उपयोग करती है जिसमें विभिन्न डीएनए भागों, जैसे प्रमोटर, कोडिंग दृश्य (सीडीएस), और टर्मिनेटर, पहले एक प्रवेश वेक्टर में क्लोन किए जाते हैं। कई प्रवेश वैक्टर तो प्रतिलेखन इकाइयों में इकट्ठा। कई ट्रांसक्रिप्शन इकाइयां फिर एक बहु-जीन प्लाज्मिड में कनेक्ट होती हैं। गोल्डन गेट क्लोनिंग रणनीति जबरदस्त लाभ की है क्योंकि यह एक बर्तन प्रतिक्रिया में निशान कम, दिशात्मक, और मॉड्यूलर विधानसभा की अनुमति देता है । पदानुक्रमित कार्यप्रवाह आम तौर पर प्रवेश वैक्टर से परे अनुक्रमण की कोई आवश्यकता नहीं के साथ बहु-जीन निर्माण की एक बड़ी विविधता की फेसियल क्लोनिंग को सक्षम बनाता है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन ड्रॉपआउट का उपयोग आसान दृश्य स्क्रीनिंग को सक्षम बनाता है। यह काम खमीर मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) किट का उपयोग कर बहु जीन प्लाज्मिड कोडांतरण के लिए एक विस्तृत, कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है । हम बहु-जीन प्लाज्मिड असेंबली के इष्टतम और उप-इष्टतम परिणाम दिखाते हैं और कॉलोनियों के लिए स्क्रीनिंग के लिए एक गाइड प्रदान करते हैं। यह क्लोनिंग रणनीति खमीर मेटाबोलिक इंजीनियरिंग और अन्य स्थितियों के लिए अत्यधिक लागू होती है जिसमें बहु-जीन प्लाज्मिड क्लोनिंग की आवश्यकता होती है।

यहां β कैरोटीन (पीला) और लाइकोपीन (लाल) उत्पादन के लिए चार प्रतिकृति बहु-जीन प्लाज्मिड के परिणाम । ADE2 लोकस को बाधित करने के लिए एक एकीकृत बहु-जीन प्लाज्मिड का निर्माण किया गया था, जिनमें से ?...

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Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य गोल्डन गेट क्लोनिंग के आधार पर मॉड्यूलर क्लोनिंग प्रणाली का उपयोग करके बहु-जीन निर्माण कोडांतरण के लिए एक विस्तृत, कदम-दर-कदम गाइड प्रदान करना है। यह हमारे अनुभवों के आधार पर इष्टतम असेंबली सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदमों पर सिफारिशें भी देता है।

मॉड्यूलर गोल्डन गेट क्लोनिंग का उपयोग करके मल्टी-जीन निर्माण की रैपिड असेंबली

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

यह खमीर MoClo किट का उपयोग कर बहु जीन प्लाज्मिड कोडांतरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है । यह विधि विभिन्न बहु-जीन सहपाठियों की सुविधाजनक क्लोनिंग को सक्षम बनाती है। यह संबंधित भागों की एक बड़ी लाइब्रेरी पैदा करने के लिए आदर्श है।गोल्डन गेट रिएक्शन मिक्स सेट करके शुरू करें। प्रत्येक पीसीआर उत्पाद के 20 फेमोमोइल और एंट्री वेक्टर, 10X T4 लीगासे बफर का एक माइक्रोलीटर, Esp3I के 0.5 माइक्रोलीटर और टी 4 लिगाज़ के 0.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। कुल मात्रा को 10 माइक्रोलीटर तक लाने के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी जोड़ें।इसके बाद क्लोनिंग रिएक्शन चलाएं। हीट शॉक द्वारा डीएच 5 अल्फा स्ट्रेन या समकक्ष एस्चेरिचिया कोलाई रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं में पूरी प्रतिक्रिया मिश्रण को बदल दें। कोशिकाओं को 35 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर क्लोरम्फेनीकोल के साथ एक एलबी प्लेट पर फैलाएं।इसके बाद रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली को इनक्यूबेट करें। 16 से 18 घंटे के बाद, प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और इसे लगभग पांच घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें ताकि सुपरफोल्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन या एसएफजीएफपी अधिक तीव्र हरे रंग के लिए विकसित हो सके। प्लेट को स्क्रीन करने के लिए, इसे अल्ट्रा-वायलेट या नीली लाइट ट्रांसिलुमिनेटर पर रखें।कॉलोनियों से युक्त एसएफजीएफपी यूवी लाइट के नीचे फ्लोरोरेस होगा। हरी उपनिवेश नकारात्मक हैं क्योंकि उनमें अनकट भाग प्लाज्मिड होता है। सफेद कॉलोनियों की संभावना सकारात्मक है ।30 से 100% सफेद कॉलोनियां हों तो क्लोनिंग सफल होती है। बाएं कनेक्टर, एसएफजीएफपी ड्रॉपआउट, सही कनेक्टर, एक खमीर चयन मार्कर, प्रतिकृति के खमीर मूल, और एक mRFP1, एक ई कोलाई मूल, और एम्पीसिलिन प्रतिरोधी जीन के साथ भाग प्लाज्मिड के साथ एक मध्यवर्ती वेक्टर इकट्ठा। पाठ पांडुलिपि में वर्णित क्लोनिंग प्रतिक्रिया करें।डीएच5 अल्फा स्ट्रेन में पूरे रिएक्शन मिक्स को बदलें फिर 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर कार्बेनिकिन या एम्पिसिलिन के साथ एक एलबी प्लेट पर कोशिकाओं को फैलाएं। रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। 16 से 18 घंटे के बाद प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकाल लें।इस थाली में पीला लाल और पीला हरा दोनों कॉलोनियां होंगी । mRFP1 और sfGFP परिपक्व होने देने के लिए इसे लगभग पांच घंटे तक चार डिग्री सेल्सियस पर रखें। हरे रंग की कॉलोनियों की पहचान करने के लिए यूवी या ब्लू लाइट ट्रांसिल्यूमिनेटर का उपयोग करें जिसमें संभावित रूप से सही मध्यवर्ती वेक्टर होते हैं।एक पौंड कार्बेनिकिन प्लेट पर हरी कालोनियों बाहर लकीर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट । अगले दिन, उन्हें फिर से क्लोरम्फेनिकोल प्लेट पर बाहर लकीर और रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । क्लोरम्फेनिकोल प्लेटों पर उगने वाली कॉलोनियों में गलत असेंबल किए गए प्लाज्मिड होते हैं ।एक बार मध्यवर्ती वेक्टर को सफलतापूर्वक इकट्ठा किया गया है, ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों को कोडांतरण के साथ आगे बढ़ें। इस चार टुकड़े विधानसभा मध्यवर्ती वेक्टर, एक प्रमोटर, एक सीडीएस, और निर्धारक शामिल हैं । प्लाज्मिड को शुद्ध करें, उनकी सांद्रता रिकॉर्ड करें, और प्रत्येक प्लाज्मिड को माइक्रोलीटर प्रति डीएनए के 20 फेमोमल्स तक पतला करें।क्लोनिंग प्रतिक्रिया प्रदर्शन करने के बाद, पूरे क्लोनिंग प्रतिक्रिया मिश्रण को डीएच 5 अल्फा या समकक्ष ई.कोलाई सक्षम कोशिकाओं में बदल दें और उन्हें एलबीएन कार्बेनेसिलिन पर प्लेट करें। इसके बाद रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली को इनक्यूबेट करें। 16 से 18 घंटे के बाद प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालकर करीब पांच घंटे तक चार डिग्री सेल्सियस पर रखकर एसएफजीएफपी को परिपक्व होने दें।गैर-फ्लोरोसेंट सफेद उपनिवेशों की पहचान करने के लिए यूवी या नीली रोशनी वाले ट्रांसिल्यूमिनेटर का उपयोग करें जिसमें संभावित रूप से सही ट्रांसक्रिप्शन इकाइयां होती हैं। पाठ पांडुलिपि में वर्णित बहु-जीन प्लाज्मिड के लिए एक मध्यवर्ती वेक्टर को इकट्ठा करें। फिर पूरे क्लोनिंग प्रतिक्रिया मिश्रण को डीएच5 अल्फा कोशिकाओं में बदल दें और उन्हें 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर कानमाइसिन के साथ पौंड पर प्लेट करें।रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेट। लाल और हरे रंग आधारित स्क्रीनिंग प्रदर्शन करते हैं, तो लकीर और एक पौंड kanamycin प्लेट पर हरी कालोनियों बढ़ने के लिए गलत संयोजन के लिए स्क्रीन के रूप में पहले का प्रदर्शन किया । इसके बाद, पाठ पांडुलिपि में वर्णित क्लोनिंग प्रतिक्रिया स्थापित करके बहु-जीन प्लाज्मिड को इकट्ठा करें।पूरे क्लोनिंग प्रतिक्रिया मिश्रण को डीएच 5 अल्फा कोशिकाओं में बदल दें और उन्हें एलबी कानमाइसिन पर प्लेट करें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेट। फिर पहले वर्णित हरे और सफेद स्क्रीनिंग प्रदर्शन करते हैं।इस प्रोटोकॉल का उपयोग ADE2 लोकस को बाधित करने के लिए एक एकीकृत बहु-जीन प्लाज्मिड का निर्माण करने के लिए किया गया था। चार प्रतिकृति और एक एकीकृत बहु-जीन प्लाज्मिड इकट्ठे किए गए थे। मध्यवर्ती वेक्टर क्लोनिंग के लिए संभावित सही कालोनियों का अनुपात 1.83% था एक बार मध्यवर्ती प्लाज्मिड क्लोन किया गया था, मध्यवर्ती से बहु-जीन प्लाज्मिड कोडांतरण की सफलता दर 93.77% थी सकारात्मक सफेद उपनिवेशों की नगण्य संख्या बहु-जीन प्लाज्मिड की एक उप-गुणीय असेंबली प्रदर्शित करती है।खमीर में बदलने के बाद, बीटा कैरोटीन और लाइकोपीन का उत्पादन करने वाली कॉलोनियां तीन दिन बढ़ी । प्रत्येक प्लेट से चार कालोनियों ताजा प्लेटों पर बाहर लकीर और दो दिनों के लिए हो गए थे । कैरोटेनॉइड को यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा निकाला और मात्रा निर्धारित किया गया था।BTS1/ERG20 अकेले ERG20 के साथ तनाव की तुलना में बीटा कैरोटीन के ३५ गुना अधिक उत्पादन की ओर जाता है । इसी तरह, लाइकोपीन का उत्पादन अकेले ERG20 की तुलना में BTS1/ERG20 के साथ तनाव में लगभग १६.५ गुना अधिक है । बहु-जीन इंटीग्रेटिव प्लाज्मिड का उपयोग ADE2 लोकस के व्यवधान के लिए किया गया था, या तो एक gRNA और कोई सहायक डीएनए के साथ या gRNA के साथ और सहायक डीएनए के रूप में एक बहु-जीन एकीकृत प्लाज्मिड।तीन से चार दिनों के बाद, Nourseothricin के साथ YPD प्लेट पर लाल कालोनियों मनाया गया, यह दर्शाता है कि ADE2 सफलतापूर्वक बाधित किया गया था । इस विधि का प्रयास करते समय, याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रतिक्रिया मिश्रण को स्थापित करते समय डीएनए सांद्रता को सही ढंग से मापना और ध्यान से पिपेट करना है। यह तकनीक खमीर मेटाबोलिक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में शोधकर्ताओं को अधिकतम उत्पाद उपज के लिए बड़ी संख्या में जीन और प्रमोटरों का सर्वेक्षण करने की अनुमति देती है।

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