Name: rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dalla Research Foundation per la State University of New York (Premio #: 71272) e dall'IMPACT Award of University at Buffalo (Premio #: 000077).

NOTA: Il protocollo di clonazione gerarchica offerto in questo toolkit può essere diviso in tre passaggi principali: 1. Clonazione di plasmidi di parte; 2. Unità di trascrizione della clonazione (TA); 3. Clonazione di plasmidi multi-genici(figura 1). Questo protocollo parte dal design del primer e termina con le applicazioni del plasmide multi-gene clonato.
1. Design primer per la clonazione della parte plasmide (pYTK001):
<ol><li>Progettare i primer avanti e ...

Il kit di clonazione basato su MoClo sviluppato da Lee et al. L'uso di questo kit elimina il collo di bottiglia di clonazione che richiede tempo che spesso esiste per esprimere più geni nel lievito.
Abbiamo testato cinque diverse condizioni per i cicli di digestione / legatura della clonazione del Golden Gate con T4 DNA ligasi. Abbiamo scoperto che 30 cicli di digestione a 37 °C per 5 minuti e legatura a 16 °C per 5 minuti seguiti da una fase finale di digestione a 50 °C per 10 minuti e un...

La biologia sintetica mira a progettare sistemi biologici con nuove funzionalità utili per l'industria farmaceutica, agricola e chimica. Assemblare un gran numero di frammenti di DNA in modo ad alta produttività è una tecnologia fondamentale nella biologia sintetica. Un processo così complicato può scomporsi in più livelli con complessità decrescente, un concetto preso in prestito dalle scienzeingegneristiche di base 1,2. In biologia sintetica, i frammenti di DNA di solito si assemblano gerarchicamente in base alla funzionalità: (i) Livello di parte: "parti" si riferisce a frammenti di DNA con una funzione specifica, come un promotore, una sequenza di codifica, un terminatore, un'origine della replicazione; (ii) Livello di unità di trascrizione (TU): un TU è costituito da un promotore, una sequenza di codifica e un terminatore in grado di trascrivere un singolo gene; ( iii) Livello multi-genico: un plasmide multi-gene contiene più UD spesso composte da un'intera via metabolica. Questo assemblaggio gerarchico introdotto dalla comunità BioBrick è il concetto fondamentale per l'assemblaggio di grandi serie di DNA in biologia sintetica3.
Nell'ultimo decennio4,5,6,7 , la tecnica diclonazionedel Golden Gate ha facilitato significativamente l'assemblaggio gerarchico del DNA2. Molti altri metodi di clonazione in più parti, come Gibsoncloning 8, ligation-independent cloning (SLIC)9, uracil excision-based cloning (USER)10, ligase cycling reaction (LCR)11e in vivo recombination (DNA Assembler)12,13, sono stati sviluppati finora. Ma la clonazione del Golden Gate è un metodo ideale di assemblaggio del DNA perché è indipendente dalle sequenze specifiche del gene, consentendo l'assemblaggio senza cicatrici, direzionali e modulari in una reazione a un vaso. La clonazione di Golden Gate sfrutta enzimi di restrizione di tipo IIS che riconoscono una sequenza non palindromica per creare sporgenze scaglionate al di fuori del sito diriconoscimento 2. Una ligasi si unisce quindi ai frammenti di DNA ricotto per ottenere un assemblaggio in più parti. L'applicazione di questa strategia di clonazione al sistema modulare di clonazione (MoClo) ha permesso l'assemblaggio di un massimo di 10 frammenti di DNA con oltre il 90% di trasformatori schermati contenenti il costruttocorrettamente assemblato 4.
Il sistema MoClo offre enormi vantaggi che hanno accelerato il ciclo di progettazione-costruzione-test della biologia sintetica. In primo luogo, le parti intercambiabili consentono alla clonazione combinatoria di testare rapidamente un ampio spazio di parametri. Ad esempio, l'ottimizzazione di un percorso metabolico di solito richiede di pedalare attraverso molti promotori per ogni gene per bilanciare il flusso del percorso. Il sistema MoClo è in grado di gestire facilmente attività di clonazione così impegnative. In secondo luogo, è necessario sequenziare la parte plasmide ma tipicamente non il TU o i plasmidi multi-genici. Nella maggior parte dei casi, lo screening per colonia PCR o la digestione delle restrizioni è sufficiente per la verifica a livello di TU e plasmide multi-gene. Questo perché la clonazione della parte plasmide è l'unico passo che richiede PCR, che spesso introduce mutazioni. In terzo luogo, il sistema MoClo è ideale per la costruzione di percorsi metabolici complessi multi-genico. Infine, a causa degli strapiombi universali, i plasmidi della parte possono essere riutilizzati e condivisi con l'intera comunità della bioingegneria. Attualmente, i kit MoClo sono disponibili per piante14,15,5,16,17,funghi6,18,19,20,21,22,batteri7,23,24,25,26,27e animali28,29. Recentemente è stata introdotta anche una piattaforma MoClo multi-regno30.
Per Saccharomyces cerevisiae,Lee etal. Questo kit è disponibile in un comodo formato da 96 po 'e definisce otto tipi di parti di DNA intercambiabili con una vasta collezione di promotori ben caratterizzati, proteine fluorescenti, terminatori, tag peptidici, marcatori di selezione, origine della replicazione e strumenti di editing del genoma. Questo toolkit permette l'assemblaggio di un massimo di cinque unità di trascrizione in un plasmide multi-gene. Queste caratteristiche sono preziose per l'ingegneria metabolica del lievito, in cui percorsi parziali o interi sono sovrascritti per produrre sostanze chimiche mirate. Utilizzando questo kit, i ricercatori hanno ottimizzato la produzione di geraniolo, linaloolo31,penicillina32,acido muconico33,indaco34e betalain35 nel lievito.
Qui forniamo un protocollo dettagliato passo-passo per guidare l'uso del toolkit MoClo per generare percorsi multi-genici per l'espressione episomica o genomica. Attraverso l'uso esorato di questo kit, abbiamo scoperto che la misurazione accurata delle concentrazioni di DNA è fondamentale per garantire la distribuzione equimolare di ogni parte nella reazione del Golden Gate. Consigliamo anche la legasi del DNA T4 sulla ligasi del DNA T7 perché la prima funziona meglio con un numero maggiore di strapiombi36. Infine, tutti i siti di riconoscimento interno di BsmBI e BsaI devono essere rimossi o addomesticati prima dell'assemblaggio. In alternativa, si può prendere in considerazione la sintesi di parti per rimuovere più siti interni e ottenere l'ottimizzazione simultanea del codone. Dimostriamo come utilizzare questo toolkit esprimendo una via a cinque geni per la produzione di β-carotene e licopene in S. cerevisiae. Mostriamo inoltre come eliminare il locus ADE2 utilizzando gli strumenti di modifica del genoma di questo kit. Questi esperimenti basati sul colore sono stati selezionati per una facile visualizzazione. Dimostriamo anche come generare proteine di fusione e creare mutazioni di amminoacidi usando la clonazione del Golden Gate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass beads</td>
			<td>RPI research products</td>
			<td>9831</td>
			<td>For lysing yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD&#38; Company</td>
			<td>211677</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI-HFv2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3733S</td>
			<td>a highly efficient version of BsaI restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>4800-94-6</td>
			<td>Antibiotic for screening at the transcription unit level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td>Antibiotic for screening at the entry vector level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His</td>
			<td>Sunrise Sciences</td>
			<td>1006-010</td>
			<td>Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>291940</td>
			<td>Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTPs for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esp3I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0734S</td>
			<td>a highly efficient isoschizomer of BsmBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T2001</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>For carotenoid extraction from yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>Antibiotic for screening at the multigene plasmid level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Lysogenic agar medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopene</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>NC1142173</td>
			<td>For lycopene quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoClo YTK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1000000061</td>
			<td>Depositing Lab: John Deuber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>For plasmid purification from E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000c</td>
			<td>For measuring accurate DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin Sulphate</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-100</td>
			<td>Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF reaction Buffer (5X)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td>Buffer for PCR using Phusion polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>High fidelity polymerase for all the PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLM494</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100539</td>
			<td>Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvette</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>10050801</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>Ligase for Golden Gate cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851148</td>
			<td>For performing all the PCR and cloning reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Model: BBX24</td>
			<td>For homogenization of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Genesys 150</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-carotene</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAH6010603</td>
			<td>For &#946;-carotene quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning

Il metodo di clonazione golden gate consente il rapido assemblaggio di più geni in qualsiasi disposizione definita dall'utente. Utilizza enzimi di restrizione di tipo IIS che tagliano al di fuori dei loro siti di riconoscimento e creano una breve sporgenza. Questo sistema di clonazione modulare (MoClo) utilizza un flusso di lavoro gerarchico in cui diverse parti del DNA, come promotori, sequenze di codifica (CDS) e terminatori, vengono prima clonate in un vettore di ingresso. Più vettori di ingresso si assemblano quindi in unità di trascrizione. Diverse unità di trascrizione si connettono quindi in un plasmide multi-gene. La strategia di clonazione del Golden Gate è di enorme vantaggio perché consente un assemblaggio senza cicatrici, direzionale e modulare in una reazione a un vaso. Il flusso di lavoro gerarchico consente in genere la facile clonazione di una grande varietà di costrutti multi-gene senza bisogno di sequenziamento oltre i vettori di ingresso. L'uso di abbandoni proteici fluorescenti consente un facile screening visivo. Questo lavoro fornisce un protocollo dettagliato e dettagliato per l'assemblaggio di plasmidi multi-genico utilizzando il kit di clonazione modulare del lievito (MoClo). Mostriamo risultati ottimali e non ottimali dell'assemblaggio plasmide multi-genico e forniamo una guida per lo screening per le colonie. Questa strategia di clonazione è altamente applicabile per l'ingegneria metabolica del lievito e altre situazioni in cui è richiesta la clonazione plasmide multi-genica.

Qui i risultati di quattro plasmidi multi-genico replicativi per β-carotene (giallo) e licopene (rosso). È stato costruito un plasmide multi-gene integrativo per interrompere il locus ADE2, le cui colonie sono rosse.
Clonazione di CDS nel vettore di ingresso (pYTK001) ERG20 è stato amplificato dal genoma del lievito e dai tre geni carotenoidi crtE, crtYB, crtI d...

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Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

L'obiettivo di questo protocollo è fornire una guida dettagliata e dettagliata per assemblare costrutti multi-genico utilizzando il sistema di clonazione modulare basato sulla clonazione di Golden Gate. Fornisce anche raccomandazioni sui passaggi critici per garantire un assemblaggio ottimale in base alle nostre esperienze.

Assemblaggio rapido di costrutti multi-gene utilizzando la clonazione modulare del Golden Gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Questo è un protocollo dettagliato per assemblare plasmidi multi-genico utilizzando il kit Yeast MoClo. Questo metodo consente la comoda clonazione di una varietà di compagni di classe multi-gene. È ideale per generare una grande libreria di parti correlate.Inizia impostando il mix di reazione del Golden Gate. Aggiungere 20 femtomoli di ogni prodotto PCR e il vettore di ingresso, un microlitro di tampone Ligasi 10X T4, 0,5 microlitri di Esp3I e 0,5 microlitri di T4 ligasi. Aggiungere acqua a doppia distillazione per portare il volume totale a 10 microlitri.Quindi, esegui la reazione di clonazione. Trasformare l'intero mix di reazione nel ceppo alfa DH5 o nelle cellule equivalenti di Escherichia coli chimicamente competenti mediante shock termico. Stendere le cellule su una piastra lb con 35 microgrammi per millilitro cloramfenicolo.Quindi incubare il piatto a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo 16-18 ore, estraere il piatto dall'incubatrice e lasciarlo a quattro gradi Celsius per circa cinque ore per lasciare che la proteina fluorescente verde supercartella o sfGFP si sviluppi per un colore verde più intenso. Per schermare la piastra, posizionarla su un transilluminatore a luce ultravioletta o blu.La sfGFP contenente colonie si fluoresce sotto la luce UV. Le colonie verdi sono negative perché contengono la parte non tagliata plasmide. Le colonie bianche sono probabilmente positive.La clonazione ha esito positivo se ci sono colonie bianche dal 30 al 100%. Assemblare un vettore intermedio con il connettore sinistro, l'abbandono sfGFP, il connettore destro, un marcatore di selezione del lievito, un'origine di replicazione del lievito e il plasmide della parte con un mRFP1, un'origine E.coli e il gene resistente all'ampicillina. Eseguire la reazione di clonazione come descritto nel manoscritto testuale.Trasformare l'intero mix di reazione nel ceppo alfa DH5, quindi stendere le cellule su una piastra lb con 50 microgrammi per millilitro carbenicillina o ampicillina. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo 16-18 ore, estrae il piatto dall'incubatrice.Il piatto conterrà colonie sia di colore rosso pallido che verde pallido. Mantienilo a quattro gradi Celsius per circa cinque ore per far maturare mRFP1 e sfGFP. Utilizzare un transilluminatore a luce UV o blu per identificare le colonie verdi che contengono il vettore intermedio potenzialmente corretto.Striati le colonie verdi su una piastra di carbenicillina lb e incuba a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, strisciarli di nuovo su una piastra di cloramfenicolo e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Le colonie che crescono su placche di cloramfenicolo contengono plasmidi malassemblati.Una volta che il vettore intermedio è stato assemblato con successo, procedere con l'assemblaggio delle unità di trascrizione. Questo assieme di quattro pezzi contiene il vettore intermedio, un promotore, un CDS e un determinatore. Purificare i plasmidi, registrare le loro concentrazioni e diluire ogni plasmide a 20 femtomoli di DNA per microlitro.Dopo aver eseguito la reazione di clonazione, trasformare l'intero mix di reazione di clonazione nelle cellule competenti DH5 alpha o E.coli equivalenti e placcarle sulla carbenicillina LBN. Quindi incubare il piatto a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo 16-18 ore, estraere il piatto dall'incubatore e tenerlo a quattro gradi Celsius per circa cinque ore per far maturare la sfGFP.Utilizzare un uv o un transilluminatore a luce blu per identificare le colonie bianche non fluorescenti che contengono le unità di trascrizione potenzialmente corrette. Assemblare un vettore intermedio per i plasmidi multi-genico come descritto nel manoscritto testuale. Quindi trasformare l'intero mix di reazione di clonazione in cellule alfa DH5 e placcarle su lb con 50 microgrammi per millilitro kanamicina.Incubare il piatto a 37 gradi Celsius durante la notte. Eseguire lo screening a base di colore rosso e verde, quindi striare e far crescere le colonie verdi su una piastra di kanamicina lb per lo schermo per gli scompirti come precedentemente dimostrato. Successivamente, assemblare il plasmide multi-gene impostando una reazione di clonazione come descritto nel manoscritto testuale.Trasforma l'intero mix di reazione di clonazione in cellule alfa DH5 e placcale sulla kanamicina lb. Incubare il piatto a 37 gradi Celsius durante la notte. Quindi eseguire lo screening verde e bianco come descritto in precedenza.Questo protocollo è stato utilizzato per costruire un plasmide multi-gene integrativo per interrompere il locus ADE2. Sono stati assemblati quattro plasmidi replicativi e uno integrativo multi-gene. Il rapporto tra colonie potenzialmente corrette per la clonazione vettoriale intermedia era dell'1,83%Una volta clonato il plasmide intermedio, il tasso di successo nell'assemblaggio di plasmidi multi-genici dall'intermedio era del 93,77%Il numero trascurabile di colonie bianche positive dimostra un assemblaggio non ottimale di plasmidi multi-genici.Dopo essersi trasformato in lievito, le colonie che producono beta-carotene e licopene sono cresciute il terzo giorno. Quattro colonie da ogni piatto sono state striate su piatti freschi e coltivate per altri due giorni. I carotenoidi sono stati estratti e quantificati dalla spettrofotometria UV-Vis.BTS1/ERG20 porta a una produzione di beta-carotene 35 volte superiore rispetto al ceppo con erg20 da solo. Allo stesso modo, la produzione di licopene è circa 16,5 volte superiore nella tensione con BTS1/ERG20 rispetto alla sola ERG20. Il plasmide integrativo multi-gene è stato utilizzato per l'interruzione del locus ADE2, sia con un gRNA che senza DNA di supporto o con gRNA e un plasmide integrativo multi-gene come DNA aiutante.Dopo tre o quattro giorni, le colonie rosse furono osservate sulla piastra YPD con Nourseothricin, indicando che l'ADE2 era stato interrotto con successo. Durante il tentativo di questo metodo, la cosa più importante da ricordare è misurare accuratamente le concentrazioni di DNA e pipettare con attenzione durante l'impostazione di questo mix di reazioni. Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo dell'ingegneria metabolica del lievito di rilevamento di un gran numero di geni e promotori per massimizzare la resa del prodotto.

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