Name: rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning at JoVE.com

Эта работа финансировалась Научно-исследовательским фондом Для Государственного университета Нью-йорка (Награда No: 71272) и IMPACT Премии Университета в Буффало (Награда No: 000077).

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол иерархического клонирования, предлагаемый в этом наборе инструментов, можно разделить на три основных этапа: 1. Плазмиды части клонирования; 2. единицы транскрипции клонирования (TUs); 3. Клонирование много генных плазмидов(рисунок 1). Этот протокол нач?...

Комплект клонирования на основе MoClo, разработанный Lee et al., обеспечивает отличный ресурс для быстрой сборки от одного до пяти единиц транскрипции в много генную плазмиду либо для репликации, либо для интеграции в геном дрожжей. Использование этого комплекта устраняет трудоемкое узкое м?...

Синтетическая биология направлена на создание биологических систем с новыми функциональными возможностями, полезными для фармацевтической, сельскохозяйственной и химической промышленности. Сборка большого количества фрагментов ДНК с высокой пропускной способностью является основополагающим методом в синтетической биологии. Такой сложный процесс может разбиться на несколько уровней с уменьшением сложности, концепция заимствована из фундаментальных инженерныхнаук 1,2. В синтетической биологии фрагменты ДНК обычно собираются иерархически на основе функциональности: i) уровень части: "части" относятся к фрагментам ДНК с определенной функцией, такой как промоутер, последовательность кодирования, терминатор, происхождение репликации; ii) уровень транскрипционных единиц (ТУ): ТУ состоит из промоутера, последовательности кодирования и терминатора, способного транскрибировать один ген; iii) Много генный уровень: много генная плазмида содержит несколько ТУ, часто состоящих из всего метаболического пути. Эта иерархическая сборка, впервые разработанная сообществом BioBrick, является основополагающим понятием для сборки больших наборов ДНК в синтетической биологии3.
В последнее десятилетие4,5,6,7, Золотые Ворота клонирования техника значительно облегчила иерархической сборкиДНК 2. Многие другие многочастные методы клонирования, такие как Гибсонклонирования 8, лигация независимогоклонирования(SLIC) 9 , uracil иссечение основе клонирования (USER)10, лигазы велосипедной реакции (LCR)11, и виво рекомбинации(ДНКсборщик) 12,13, также были разработаны до сих пор. Но клонирование Золотых Ворот является идеальным методом сборки ДНК, потому что он не зависит от генно-специфических последовательностей, что позволяет без шрамов, направленной и модульной сборки в реакции одного горшка. Клонирование Золотых Ворот использует ферменты ограничения типа IIS, которые распознают не палиндромную последовательность для создания ступенчатых свесов за пределами сайтараспознавания 2. Затем лигаза присоединяется к анналированным фрагментам ДНК, чтобы получить многочастивую сборку. Применение этой стратегии клонирования к модульной системе клонирования (MoClo) позволило собрать до 10 фрагментов ДНК с более чем 90% трансформантами, экранированными, содержащими правильно собраннуюконструкцию 4.
Система MoClo предлагает огромные преимущества, которые ускорили цикл проектирования-сборки-теста синтетической биологии. Во-первых, сменные части позволяют комбинатору быстро тестировать большое пространство параметров. Например, оптимизация метаболического пути обычно требует езды на велосипеде через множество промоутеров для каждого гена, чтобы сбалансировать поток пути. Система MoClo может легко справиться с такими сложными задачами клонирования. Во-вторых, нужно секвенировать часть плазмидной, но, как правило, не ТУ или много генных плазмидов. В большинстве случаев скрининг по колониям ПЦР или пищеварения ограничения достаточен для проверки на уровне ТУ и много генной плазмиды. Это потому, что клонирование плазмиды части является единственным шагом, требующим ПЦР, который часто вводит мутации. В-третьих, система MoClo идеально подходит для построения много генных сложных метаболических путей. Наконец, из-за универсальных свесов, часть плазмиды могут быть повторно использованы и совместно со всем сообществом биоинженерии. В настоящее время комплекты MoCloдоступны для растений 14,15,5,16,17,грибов6,18,19,20,21,22,бактерий 7,23,24,25,26,27,иживотных 28,29. Многосемейная платформа MoClo также была введена недавно30.
Для Saccharomyces cerevisiae, Ли и др.6 разработали универсальный инструментарий MoClo, отличный ресурс для дрожжей синтетической биологии сообщества. Этот комплект поставляется в удобном формате 96-колодец и определяет восемь типов сменных частей ДНК с разнообразной коллекцией хорошо охарактеризованных промоутеров, флуоресцентных белков, терминаторов, пептидных тегов, маркеров отбора, происхождения репликации и инструментов редактирования генома. Этот набор инструментов позволяет сборку до пяти единиц транскрипции в много генную плазмиду. Эти особенности являются ценными для дрожжей метаболической инженерии, в которой частичные или целые пути чрезмерно выражены для производства целевых химических веществ. Используя этот комплект, исследователи оптимизировали производство гераниола, линалула31,пенициллина32, слизистойкислоты 33, индиго34и беталена35 в дрожжах.
Здесь мы предоставляем подробный, шаг за шагом протокол для руководства использованием инструментария MoClo для создания многогенных путей для эписомальной или геномной экспрессии. Благодаря обширному использованию этого комплекта, мы обнаружили, что точное измерение концентраций ДНК является ключом к обеспечению равномерного распределения каждой части в реакции Золотых Ворот. Мы также рекомендуем T4 ДНК лигазы над T7 ДНК лигазы, потому что первый работает лучше с большим количеством свесов36. Наконец, любые сайты внутреннего распознавания BsmBI и BsaI должны быть удалены или одомашнены до сборки. Кроме того, можно рассмотреть вопрос об синтезе частей для удаления нескольких внутренних сайтов и для достижения одновременной оптимизации кодона. Мы демонстрируем, как использовать этот инструментарий, выражая пятигенный путь для производства β-каротина и ликопина в S. cerevisiae. Мы также показываем, как выбить локус ADE2 с помощью инструментов для редактирования генома из этого комплекта. Эти цветовые эксперименты были выбраны для легкой визуализации. Мы также демонстрируем, как генерировать синтез белков и создавать аминокислотные мутации с помощью клонирования Золотых Ворот.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass beads</td>
			<td>RPI research products</td>
			<td>9831</td>
			<td>For lysing yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD&#38; Company</td>
			<td>211677</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI-HFv2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3733S</td>
			<td>a highly efficient version of BsaI restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>4800-94-6</td>
			<td>Antibiotic for screening at the transcription unit level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td>Antibiotic for screening at the entry vector level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His</td>
			<td>Sunrise Sciences</td>
			<td>1006-010</td>
			<td>Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>291940</td>
			<td>Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTPs for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esp3I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0734S</td>
			<td>a highly efficient isoschizomer of BsmBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T2001</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>For carotenoid extraction from yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>Antibiotic for screening at the multigene plasmid level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Lysogenic agar medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopene</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>NC1142173</td>
			<td>For lycopene quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoClo YTK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1000000061</td>
			<td>Depositing Lab: John Deuber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>For plasmid purification from E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000c</td>
			<td>For measuring accurate DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin Sulphate</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-100</td>
			<td>Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF reaction Buffer (5X)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td>Buffer for PCR using Phusion polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>High fidelity polymerase for all the PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLM494</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100539</td>
			<td>Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvette</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>10050801</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>Ligase for Golden Gate cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851148</td>
			<td>For performing all the PCR and cloning reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Model: BBX24</td>
			<td>For homogenization of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Genesys 150</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-carotene</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAH6010603</td>
			<td>For &#946;-carotene quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning

Метод клонирования Золотых Ворот обеспечивает быструю сборку нескольких генов в любом пользовательском механизме. Он использует ферменты ограничения IIS типа, которые вырезают за пределами их сайтов распознавания и создают короткий свес. Эта модульная система клонирования (MoClo) использует иерархический рабочий процесс, в котором различные части ДНК, такие как промоутеры, последовательности кодирования (CDS) и терминаторы, сначала клонируются в вектор входа. Затем несколько векторов входа собираются в единицы транскрипции. Затем несколько единиц транскрипции соединяются с много генной плазмидой. Стратегия клонирования Золотых Ворот имеет огромное преимущество, поскольку позволяет без шрамов, направленной и модульной сборке в одной реакции. Иерархический рабочий процесс обычно позволяет легко клонировать большое разнообразие много генных конструкций без необходимости секвенирования за пределами векторов входа. Использование флуоресцентных белковых отсева обеспечивает легкий визуальный скрининг. Эта работа обеспечивает подробный, шаг за шагом протокол для сборки много генных плазмидов с использованием дрожжевой модульного клонирования (MoClo) комплект. Мы показываем оптимальные и неоптимальные результаты много генной плазмидной сборки и предоставляем руководство по скринингу для колоний. Эта стратегия клонирования в значительной степени применима для инженерии метаболизма дрожжей и других ситуаций, в которых требуется много генная плазмидная клонирование.

Здесь результаты четырех репликационные многогенные плазмиды для β (желтый) и ликопин (красный) производства. Была построена одна интегративная многогенерная плазмида для нарушения локуса ADE2, колонии которой красные.
Клониро...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning at JoVE.com

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

Целью этого протокола является предоставление подробного, пошагового руководства по сборке много генных конструкций с использованием модульной системы клонирования на основе клонирования Золотых Ворот. Он также дает рекомендации по важнейшим шагам для обеспечения оптимальной сборки на основе нашего опыта.

Быстрая сборка многофункциональных конструкций с использованием модульного клонирования Золотых Ворот

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Это подробный протокол для сборки много генных плазмидов с использованием комплекта Дрожжевой MoClo. Этот метод позволяет удобно клонировать различных много генных одноклассников. Он идеально подходит для создания большой библиотеки связанных частей.Начните с создания смеси реакции Золотые Ворота. Добавьте 20 фемтомолов каждого продукта PCR и вектор входа, один микролитр буфера 10X T4 Ligase, 0,5 микролитров Esp3I и 0,5 микролитров T4 лигазы. Добавьте двойную дистиллированную воду, чтобы довести общий объем до 10 микролитров.Затем запустите реакцию клонирования. Превратите всю смесь реакции в штамм DH5 альфа или эквивалент Escherichia coli химически компетентных клеток теплового удара. Распространение клеток на пластине фунта с 35 микрограммов на миллилитр хлорамфеникол.Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в одночасье. После 16 до 18 часов, возьмите пластину из инкубатора и оставить его при четырех градусах по Цельсию в течение примерно пяти часов, чтобы суперфолдер зеленый флуоресцентный белок или sfGFP развиваться для более интенсивного зеленого цвета. Чтобы экран пластины, поместите его на ультрафиолетовый или синий свет трансиллюминатора.SFGFP, содержащий колонии, будет флуоресцеть под ультрафиолетовым светом. Зеленые колонии являются отрицательными, потому что они содержат необрезанные части плазмиды. Белые колонии, вероятно, положительные.Клонирование успешно, если есть от 30 до 100% белых колоний. Соберите промежуточный вектор с левым разъемом, отсева SFGFP, правый разъем, маркер выбора дрожжей, дрожжевой происхождения репликации, и часть плазмид с mRFP1, E.coli происхождения, и ампициллин устойчивый ген. Выполните реакцию клонирования, описанную в текстовой рукописи.Преобразуйте всю смесь реакции в штамм DH5 альфа затем распространение клеток на пластине фунта с 50 микрограммов на миллилитр карбенициллин или ампициллин. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию за одну ночь. Через 16-18 часов вывехив тарелку из инкубатора.Пластина будет содержать как бледно-красные, так и бледно-зеленые колонии. Держите его на четыре градуса по Цельсию в течение примерно пяти часов, чтобы mRFP1 и sfGFP созреть. Используйте УФ или синий свет трансиллюминатор для определения зеленых колоний, которые содержат потенциально правильный промежуточный вектор.Streak из зеленых колоний на фунт карбенициллин пластины и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье. На следующий день, полоса их снова на пластине хлорамфеникол и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье. Колонии, растущие на пластинах хлорамфеникол, содержат неправильно собранную плазмиду.После успешной сборки промежуточного вектора приступить к сборке транскрипционных блоков. Эта сборка из четырех частей содержит промежуточный вектор, промоутер, CDS и детерминатор. Очищать плазмиды, записывать их концентрации и разбавлять каждую плазмиду до 20 фемтомолов ДНК на микролитер.После выполнения реакции клонирования, трансформировать всю смесь реакции клонирования в DH5 альфа или эквивалент E.coli компетентных клеток и пластины их на LBN карбенициллин. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в одночасье. После 16 до 18 часов, возьмите пластину из инкубатора и держать его на четыре градуса по Цельсию в течение примерно пяти часов, чтобы SFGFP созреть.Используйте УФ или синий свет трансиллюминатор для выявления нефлуоресцентных белых колоний, которые содержат потенциально правильные единицы транскрипции. Соберите промежуточный вектор много генных плазмидов, описанных в текстовой рукописи. Затем преобразуйте всю смесь реакции клонирования в альфа-клетки DH5 и почините их на фунт 50 микрограммами на миллилитр канамицин.Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в одночасье. Выполните красный и зеленый цвет на основе скрининга, а затем полоса и расти зеленые колонии на фунт kanamycin пластины для экрана для misassemblies, как это было продемонстрировано ранее. Затем соберите много генную плазмиду, установив реакцию клонирования, описанную в текстовой рукописи.Преобразуйте всю смесь реакции клонирования в альфа-клетки DH5 и почините их на lb канамицине. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в одночасье. Затем выполните зеленый и белый скрининг, как описано ранее.Этот протокол был использован для построения одной интегративной многогенерной плазмиды для нарушения локуса ADE2. Было собрано четыре репликационные и одна интегративная много генная плазмида. Соотношение потенциально правильных колоний для клонирования промежуточного вектора составило 1,83%После клонирования промежуточной плазмиды, успешность сборки много генных плазмидов из промежуточных составила 93,77%Незначительное количество положительных белых колоний демонстрируют неоптиманую сборку много генных плазмидов.После превращения в дрожжи, колонии, производящие бета-каротин и ликопин, выросли на третий день. Четыре колонии из каждой тарелки были вылезли на свежие тарелки и росли еще два дня. Каротиноиды были извлечены и количественно УФ-Vis спектрофотометрии.BTS1/ERG20 приводит к 35 раза более высокому производству бета-каротина по сравнению с штаммом только с ERG20. Аналогичным образом, производство ликопина примерно в 16,5 раза выше в штамме с BTS1/ERG20 по сравнению с ERG20 в одиночку. Много генная интегративная плазмида использовалась для нарушения локуса ADE2, либо с гРНК и без ДНК-помощника, либо с гРНК и много генной интегративной плазмидой в качестве помощника ДНК.Через три-четыре дня на пластине YPD наблюдались красные колонии с юрсеодрицином, что указывает на то, что ADE2 был успешно нарушен. При попытке этого метода, самое главное помнить, чтобы измерить концентрации ДНК точно и пипетки тщательно при настройке этой реакции смеси. Этот метод позволяет исследователям в области дрожжевой метаболической инженерии для обследования большого количества генов и промоутеров для максимального урожайности продукта.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

ECM Белковые Нановолокон и наноструктуры Инженерная Использование Поверхность по инициативе Ассамблеи

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Жизнеспособность Bioprinted Сотовые конструктов Использование Три диспенсер декартово принтера

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Строительство модульных гидрогеля листов для Micropatterned Макро-масштабного 3D Cellular архитектуры

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Создаёт Использование Тканеспецифическая гидрогелевых Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Слоистые альгината конструкты: Платформа для совместного культивирования разнотипных клеточных популяций

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

Micropatterning и сборка 3D микрососудов

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Автоматизированных роботов жидкой обработке Ассамблеи устройств модульной ДНК

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Лечение связочных конструкций с помощью сыворотки, обусловленной упражнениями: модель трансляционной тканевой инженерии

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Производство генетически Золотой сирийских хомяков Pronuclear инъекции комплекса ТРИФОСФАТЫ/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Быстрая, масштабируемая Ассамблеи и загрузка биоактивные белков и Иммуностимуляторы в разнообразных синтетических Nanocarriers через флэш-Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...