Name: rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00
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Este trabajo fue financiado por la Research Foundation para la Universidad Estatal de Nueva York (Premio #: 71272) y el Premio IMPACT de la Universidad en Buffalo (Premio #: 000077).

NOTA: El protocolo jerárquico de clonación que se ofrece en este kit de herramientas se puede dividir en tres pasos principales: 1. Clonación de plásmidos de piezas; 2. Clonación de unidades de transcripción (TUs); 3. Clonación de plásmidos multigénicos (Figura 1). Este protocolo parte del diseño de la imprimación y termina con las aplicaciones del plásmido multigénico clonado.
1. Diseño de imprimación para clonar el plásmido de la pieza (pYTK001):</...

El kit de clonación basado en MoClo desarrollado por Lee et al. proporciona un excelente recurso para el montaje rápido de una a cinco unidades de transcripción en un plásmido multigéneros, ya sea para replicación o integración en el genoma de la levadura. El uso de este kit elimina el cuello de botella de clonación que consume mucho tiempo y que con frecuencia existe para expresar múltiples genes en levadura.
Probamos cinco condiciones diferentes para los ciclos de digestión/ligadur...

La biología sintética tiene como objetivo diseñar sistemas biológicos con nuevas funcionalidades útiles para las industrias farmacéutica, agrícola y química. Ensamblar un gran número de fragmentos de ADN de una manera de alto rendimiento es una tecnología fundamental en biología sintética. Un proceso tan complicado puede dividirse en múltiples niveles con una complejidad decreciente, un concepto tomado de las ciencias básicas de la ingeniería1,2. En biología sintética, los fragmentos de ADN suelen ensamblarse jerárquicamente en función de la funcionalidad: (i) Nivel de pieza: "partes" se refiere a fragmentos de ADN con una función específica, como un promotor, una secuencia de codificación, un terminador, un origen de replicación; (ii) Nivel de unidades de transcripción (TU): un TU consiste en un promotor, una secuencia de codificación y un terminador capaz de transcribir un solo gen; (iii) Nivel multigénico: un plásmido multigénico contiene múltiples TUs que con frecuencia se componen de una vía metabólica completa. Este montaje jerárquico pionero por la comunidad BioBrick es el concepto fundamental para el montaje de grandes conjuntos de DNAs en biología sintética3.
En la última década4,5,6,7, la técnica de clonación Golden Gate ha facilitado significativamente el montaje jerárquico de ADN2. Muchos otros métodos de clonación de varias partes, como la clonación gibson8,clonación independiente de ligadura (SLIC)9,clonación basada en la escisión de uracil (USUARIO)10,la reacción de ciclismo de ligasa (LCR)11,y la recombinación in vivo (ensamblador de ADN)12,13,también se han desarrollado hasta ahora. Pero la clonación de Golden Gate es un método de ensamblaje de ADN ideal porque es independiente de secuencias específicas de genes, lo que permite un montaje sin cicatrices, direccional y modular en una reacción de una sola olla. La clonación golden gate aprovecha las enzimas de restricción de tipo IIS que reconocen una secuencia no palindrómica para crear voladizos escalonados fuera del sitio de reconocimiento2. A continuación, un ligase se une a los fragmentos de ADN recocido para obtener un ensamblaje de varias partes. La aplicación de esta estrategia de clonación al sistema de clonación modular (MoClo) ha permitido el montaje de hasta 10 fragmentos de ADN con más del 90% de transformadores proyectados que contienen la construcción correctamente montada4.
El sistema MoClo ofrece enormes ventajas que han acelerado el ciclo de diseño-construcción-prueba de biología sintética. En primer lugar, las piezas intercambiables permiten la clonación combinatoria para probar rápidamente un gran espacio de parámetros. Por ejemplo, la optimización de una vía metabólica generalmente requiere recorrer en bicicleta muchos promotores de cada gen para equilibrar el flujo de la vía. El sistema MoClo puede manejar fácilmente tareas de clonación tan exigentes. En segundo lugar, es necesario secuenciar la parte plásmida, pero normalmente no la TU o los plásmidos multigénicos. En la mayoría de los casos, el cribado por PCR de colonia o la digestión de restricción es suficiente para la verificación a nivel de TU y plásmido multigénico. Esto se debe a que la clonación del plásmido de la pieza es el único paso que requiere PCR, que con frecuencia introduce mutaciones. En tercer lugar, el sistema MoClo es ideal para construir vías metabólicas complejas multigénero. Por último, debido a los voladizos universales, los plásmidos de la parte se pueden reutilizar y compartir con toda la comunidad de bioingeniería. Actualmente, los kits MoClo están disponibles para plantas14,15,5,16,17,hongos6,18,19,20,21,22,bacterias7,23,24,25,26,27y animales28,29. Recientemente también se ha introducido una plataforma MoClo de variosreinos.
Para Saccharomyces cerevisiae,Lee et al.6 han desarrollado un versátil kit de herramientas MoClo, un excelente recurso para la comunidad de biología sintética de levadura. Este kit viene en un formato conveniente de 96 pozos y define ocho tipos de piezas de ADN intercambiables con una colección diversa de promotores bien caracterizados, proteínas fluorescentes, terminadores, etiquetas de péptido, marcadores de selección, origen de replicación y herramientas de edición del genoma. Este kit de herramientas permite el montaje de hasta cinco unidades de transcripción en un plásmido multigénico. Estas características son valiosas para la ingeniería metabólica de levadura, en la que las vías parciales o enteras se expresan en exceso para producir productos químicos dirigidos. Con este kit, los investigadores han optimizado la producción de geraniol, linalool31,penicilina32,ácido muconico33,índigo34y betalain35 en levadura.
Aquí proporcionamos un protocolo detallado paso a paso para guiar el uso del kit de herramientas MoClo para generar vías multigénero para la expresión episomal o genómica. A través del uso extensivo de este kit, hemos encontrado que la medición precisa de las concentraciones de ADN es clave para garantizar la distribución equimolar de cada parte en la reacción de Golden Gate. También recomendamos el ligase de ADN T4 sobre el ligase de ADN T7 porque el primero funciona mejor con un mayor número de voladizos36. Por último, cualquier sitio de reconocimiento interno de BsmBI y BsaI debe ser eliminado o domesticado antes del montaje. Alternativamente, uno puede considerar sintetizar piezas para eliminar varios sitios internos y lograr la optimización simultánea del codón. Demostramos cómo utilizar este kit de herramientas expresando una vía de cinco genes para la producción de β caroteno y licopeno en S. cerevisiae. Además, mostramos cómo noquear el locus ADE2 usando las herramientas de edición del genoma de este kit. Estos experimentos basados en colores fueron seleccionados para facilitar la visualización. También demostramos cómo generar proteínas de fusión y crear mutaciones de aminoácidos usando la clonación golden gate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Glass beads</td>
			<td>RPI research products</td>
			<td>9831</td>
			<td>For lysing yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>214010</td>
			<td>Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD&#38; Company</td>
			<td>211677</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI-HFv2</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3733S</td>
			<td>a highly efficient version of BsaI restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>4800-94-6</td>
			<td>Antibiotic for screening at the transcription unit level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td>Antibiotic for screening at the entry vector level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSM-His</td>
			<td>Sunrise Sciences</td>
			<td>1006-010</td>
			<td>Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td>
			<td>BD &#38; Company</td>
			<td>291940</td>
			<td>Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td>dNTPs for PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esp3I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0734S</td>
			<td>a highly efficient isoschizomer of BsmBI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>T2001</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanes</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>H302-1</td>
			<td>For carotenoid extraction from yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>Antibiotic for screening at the multigene plasmid level</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Lysogenic agar medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>Lysogenic liquid medium for E. coli culturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycopene</td>
			<td>Cayman chemicals</td>
			<td>NC1142173</td>
			<td>For lycopene quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoClo YTK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>1000000061</td>
			<td>Depositing Lab: John Deuber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>T1010L</td>
			<td>For plasmid purification from E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000c</td>
			<td>For measuring accurate DNA concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin Sulphate</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-100</td>
			<td>Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion HF reaction Buffer (5X)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0518S</td>
			<td>Buffer for PCR using Phusion polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>High fidelity polymerase for all the PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLM494</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100539</td>
			<td>Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Cuvette</td>
			<td>Thermo Electron</td>
			<td>10050801</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>Ligase for Golden Gate cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1851148</td>
			<td>For performing all the PCR and cloning reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer</td>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Model: BBX24</td>
			<td>For homogenization of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Genesys 150</td>
			<td>For quantifing carotenoids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-carotene</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAH6010603</td>
			<td>For &#946;-carotene quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid assembly of multi-gene constructs using modular golden gate cloning

El método de clonación Golden Gate permite el montaje rápido de múltiples genes en cualquier disposición definida por el usuario. Utiliza enzimas de restricción de tipo IIS que cortan fuera de sus sitios de reconocimiento y crean un voladizo corto. Este sistema modular de clonación (MoClo) utiliza un flujo de trabajo jerárquico en el que diferentes partes del ADN, como promotores, secuencias de codificación (CDS) y terminadores, se clonan primero en un vector de entrada. A continuación, se ensamblan varios vectores de entrada en unidades de transcripción. Varias unidades de transcripción se conectan a un plásmido multigénico. La estrategia de clonación golden gate es de enorme ventaja porque permite un montaje sin cicatrices, direccional y modular en una reacción de una olla. El flujo de trabajo jerárquico normalmente permite la clonación fácil de una gran variedad de construcciones multigénicas sin necesidad de secuenciar más allá de los vectores de entrada. El uso de deserción de proteínas fluorescentes permite una fácil detección visual. Este trabajo proporciona un protocolo detallado paso a paso para el montaje de plásmidos multigéneros utilizando el kit de clonación modular de levadura (MoClo). Mostramos resultados óptimos y subóptimos del ensamblaje plásmido multigéneo y proporcionamos una guía para la detección de colonias. Esta estrategia de clonación es altamente aplicable para la ingeniería metabólica de levaduras y otras situaciones en las que se requiere clonación de plásmidos multi genes.

Aquí los resultados de cuatro plásmidos multigéneros replicativos para la producción de β caroteno (amarillo) y licopeno (rojo). Se construyó un plásmido multigénico integrador para interrumpir el locus ADE2, las colonias de las cuales son rojas.
Clonación de CDS en el vector de entrada (pYTK001) ERG20 se amplió desde el genoma de la levadura y los tres genes carotenoides crtE,...

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Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada paso a paso para el montaje de construcciones multigénicos utilizando el sistema de clonación modular basado en la clonación Golden Gate. También ofrece recomendaciones sobre pasos críticos para garantizar un montaje óptimo basado en nuestras experiencias.

Montaje rápido de construcciones multigénicas mediante clonación modular Golden Gate

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

Este es un protocolo detallado para el montaje de plásmidos multigéneros utilizando el kit Yeast MoClo. Este método permite la clonación conveniente de una variedad de compañeros de clase multigénicos. Es ideal para generar una gran biblioteca de piezas relacionadas.Comience configurando la mezcla de reacción de Golden Gate. Añadir 20 femtomoles de cada producto PCR y el vector de entrada, un microlitro de 10X T4 Ligase buffer, 0.5 microlitros de Esp3I, y 0.5 microlitros de ligasa T4. Agregue agua de doble destilación para llevar el volumen total a 10 microlitros.A continuación, ejecute la reacción de clonación. Transforme toda la mezcla de reacción en la cepa alfa DH5 o células equivalentes de Escherichia coli químicamente competentes por choque térmico. Esparce las células en una placa lb con 35 microgramos por mililitro cloranfenicol.Luego incubar la placa a 37 grados Celsius durante la noche. Después de 16 a 18 horas, saque el plato de la incubadora y déjelo a cuatro grados centígrados durante unas cinco horas para dejar que la proteína fluorescente verde supercarpeta o sfGFP se desarrolle para un color verde más intenso. Para examinar la placa, colóquela en un transilluminador de luz ultra-violeta o azul.El sfGFP que contiene colonias fluorescencia bajo la luz UV. Las colonias verdes son negativas porque contienen la parte sin cortar plásmido. Las colonias blancas son probablemente positivas.La clonación tiene éxito si hay colonias 30 a 100% blancas. Monte un vector intermedio con el conector izquierdo, la deserción sfGFP, el conector derecho, un marcador de selección de levadura, un origen de levadura de replicación y la pieza plásmida con un mRFP1, un origen E.coli y el gen resistente a la ampicilina. Realice la reacción de clonación como se describe en el manuscrito de texto.Transforme toda la mezcla de reacción en la cepa alfa DH5 y luego extienda las células en una placa lb con 50 microgramos por mililitro de carbenicilina o ampicilina. Incuba a 37 grados centígrados durante la noche. Después de 16 a 18 horas, saque el plato de la incubadora.La placa contendrá colonias de color rojo pálido y verde pálido. Manténgalo en cuatro grados centígrados durante unas cinco horas para que el mRFP1 y el sfGFP maduren. Utilice un transilluminador de luz UV o azul para identificar las colonias verdes que contienen el vector intermedio potencialmente correcto.Sacando las colonias verdes en una placa de carbenicilina lb e incubar a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, vuelva a salir en una placa de cloranfenicol e incubar a 37 grados centígrados durante la noche. Las colonias que crecen en placas de clorafeno contienen plásmidos desensensamblados.Una vez que el vector intermedio se ha montado con éxito, proceda con el montaje de las unidades de transcripción. Este ensamblaje de cuatro piezas contiene el vector intermedio, un promotor, un CDS y un determinante. Purificar los plásmidos, registrar sus concentraciones y diluir cada plásmido a 20 femtomoles de ADN por microlitro.Después de realizar la reacción de clonación, transforme toda la mezcla de reacción de clonación en las células competentes dh5 alfa o equivalente E.coli y colócalos en carbenicilina LBN. Luego incubar la placa a 37 grados Celsius durante la noche. Después de 16 a 18 horas, saque el plato de la incubadora y guárdalo a cuatro grados centígrados durante unas cinco horas para dejar que la sfGFP madure.Utilice un uv o un transilluminador de luz azul para identificar las colonias blancas no fluorescentes que contienen las unidades de transcripción potencialmente correctas. Montar un vector intermedio para los plásmidos multigénicos como se describe en el manuscrito de texto. A continuación, transforme toda la mezcla de reacción de clonación en células alfa DH5 y échalas en lb con 50 microgramos por kanamicina mililitro.Incuba la placa a 37 grados centígrados durante la noche. Realizar cribado a base de color rojo y verde, luego rayar y hacer crecer las colonias verdes en una placa de kanamycin lb para la pantalla de los antisamblies como se demostró anteriormente. A continuación, ensamblar el plásmido multi gen estableciendo una reacción de clonación como se describe en el manuscrito de texto.Transforme toda la mezcla de reacción de clonación en células alfa DH5 y échalas en kanamycina lb. Incuba la placa a 37 grados centígrados durante la noche. A continuación, realice la proyección en verde y blanco como se describió anteriormente.Este protocolo se utilizó para construir un plásmido multigénico integrador para interrumpir el locus ADE2. Se montaron cuatro plásmidos multigénicos replicativos y uno integrador. La proporción de colonias potencialmente correctas para la clonación de vectores intermedios fue del 1,83%Una vez clonado el plásmido intermedio, la tasa de éxito del montaje de plásmidos multigéneros del intermedio fue del 93,77%El número insignificante de colonias blancas positivas demuestra un conjunto subóptimo de plásmidos multigéneros.Después de transformarse en levadura, las colonias productoras de betacaroteno y licopeno crecieron en el tercer día. Cuatro colonias de cada plato fueron rayadas en platos frescos y cultivadas durante dos días más. Los carotenoides fueron extraídos y cuantificados por espectrofotometría UV-Vis.BTS1/ERG20 conduce a una producción 35 veces mayor de betacaroteno en comparación con la cepa solo con ERG20. Asimismo, la producción de licopeno es aproximadamente 16,5 veces mayor en la cepa con BTS1/ERG20 en comparación con ERG20 solamente. El plásmido integrador multigénico se utilizó para la interrupción del locus ADE2, ya sea con un ARN y sin ADN auxiliar o con gRNA y un plásmido integrativo multigénico como ADN auxiliar.Después de tres o cuatro días, se observaron colonias rojas en la placa YPD con Nourseothricin, lo que indica que la ADE2 había sido interrumpida con éxito. Al intentar este método, lo más importante a recordar es medir las concentraciones de ADN con precisión y la pipeta cuidadosamente mientras se configura esta mezcla de reacción. Esta técnica permite a los investigadores en el campo de la ingeniería metabólica de levaduras estudiar un gran número de genes y promotores para maximizar el rendimiento del producto.

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