Name: utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes
Uploaded: 2020-11-09T15:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة FAPESP (15/06477-9).

1. الخميرة إعداد استخراج مجموع
<ol><li>تنمو خلايا الخميرة التعبير عن واحدة من عوامل الربط تنصهر على علامة TAP9 في 1 L YNB-غلو وسائل الإعلام (الخميرة النيتروجين الأساس تكملها 2٪ م / v الجلوكوز) مع الأحماض الأمينية المناسبة أو القواعد النووية, في هذه الحالة، أدينين (20 ميكروغرام/ مل)، ليوست...

<ol>
	<li>Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., L&#252;hrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+nuclear+pre-mRNA+splicing+in+higher+eukaryotes.">Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).</li><li>Yan, C., Wan, R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+pre-mRNA+splicing+through+structural+biology+of+the+spliceosome.">Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).</li><li>Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+regulation+of+spliceosomal+RNA+helicases.">Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).</li><li>Kastner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GraFix:+sample+preparation+for+single-particle+electron+cryomicroscopy.">GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy.</a> Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).</li><li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafix:+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM.">Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).</li><li>Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+yeast+activated+spliceosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 353 (6302), 895-904 (2016).</li><li>Ohi, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+revelas+stable+multiprotein+complexes+in+both+fission+and+budding+yeasts+containing+Myb-related+Cdc5p/Cef1p,+novel+pre-mRNA+splicing+factors,+and+snRNAs.">Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).</li><li>Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+yeast+mutant+RNA+exosome+complexes.">Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterizatioin+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+yeast+splicing+extract.">Preparation and fractionation of yeast splicing extract.</a> Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).</li><li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3'+splice+site+selection.">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes &amp; Development. 9, 855-868 (1995).</li><li>Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+yeast+whole+cell+splicing+extract.">Preparation of yeast whole cell splicing extract.</a> Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).</li><li>Hill, H. D., Straka, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+using+bicinchoninic+acid+in+the+presence+of+sulfhydryl+reagents.">Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents.</a> Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).</li><li>Cepeda, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+assembly+factor+Nop53+controls+association+of+the+RNA+exosome+with+pre-60S+particles+in+yeast.">The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).</li><li>Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mRNA+splicing+in+vitro.">Yeast mRNA splicing in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).</li></ol>

البروتين البروتين والريبونوكليك الأحماض البروتين التفاعلات يمكن استقرت باستخدام عوامل الربط المتبادل. من المهم أن يكون المركب الناتج مستقرا لتحمل الطرد المركزي الفائق على تدرج الجلسرين. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تسمح شروط المخزن المؤقت التفاعل ولكن تكون صارمة بما يكفي لتجنب الربط غير مح...

الربط هو عملية ديناميكية للغاية تتطلب ربط وإطلاق العديد من العوامل بطريقة منسقة. وتشمل هذه العوامل الربط البروتينات ملزمة الجيش الملكي النيبالي, ATPases, هيليكيس, كيناس البروتين وفوسفاتاسيس, ليغاسي في كل مكان, من بين أمور أخرى1,2,3; وللسماح لإعادة ترتيب الجزيئية أن يحدث، بعض هذه العوامل ربط عابر جدا إلى الربط الفرعي، مما يجعل عزل وتحديد هذه المجمعات المتوسطة RNP صعبة للغاية.
هنا، استخدمنا طريقة Grafix4،5 لتحقيق الاستقرار في التفاعل بين عامل الربط الخميرة Cwc24 معB act complex6 للسماح بتحديد العوامل الأخرى المرتبطة بيكوبليكس وتحديد ما إذا كان وpp19 ubiquitin ligase يلعب أي دور في ربط أو الافراج عن Cwc24 إلى تسعة عشر (NTC) المعقدة و إلى نهاية 5 'من intron قبل التنشيط وأول رد فعل عبر الترانس يأخذ مكان. ميزة تعريض الجزيئات الكلية لتركيز متزايد من crosslinker على طول التدرج الجلسرين هو أنه يتجنب الوصلات المتقاطعة بين المجمعات4،5، وبالتالي ، تشكيل المجاميع.
وقد استخدمت هذه الطريقة كتكميل للبروتين coimmunoprecipitation والانسحاب إلى أسفل المقايسات، والتي، على الرغم من السماح لعزل المجمعات الكبيرة، قد لا تكون موثوقة للحفاظ على التفاعلات العابرة داخل المجمعات الديناميكية الكبيرة7،8. استخدام الكواشف التثبيت في التدرج الجلسرين يستقر الربط من هذه العوامل، مما يسمح لتأكيد التفاعلات من بروتينات محددة مع الربط subcomplexes. ولأن الوصلة المتقاطعة المختارة لا رجعة فيها كيميائيا، فقد تم تحليل البروتينات الموجودة في الكسور المستردة بواسطة لطخة نقطة بعد الطرد المركزي المتدرجة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-Rabbit IgG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EconoSystem</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1-800-424-6723</td>
			<td>Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Recovery System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>270-331580</td>
			<td>Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Master Model 107ip</td>
			<td>Biocomp</td>
			<td>107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>207460001</td>
			<td>Ball Mill device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor F12-6x500Lex</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>096-062375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor P40ST</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge CP 80 NX</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>901069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes

الربط قبل مرنا هي عملية ديناميكية للغاية التي تنطوي على العديد من الإعادة ترتيب الجزيئية من الربط الفرعي اللصقات أثناء التجميع، وتجهيز الحمض النووي الريبي، والإفراج عن المكونات المعقدة. وقد استخدم الطرد المركزي التدرج الجلسرين لفصل البروتين أو RNP (ريبونوكليوبروتين) مجمعات للدراسات الوظيفية والهيكلية. هنا ، ونحن نصف استخدام Grafix (تثبيت التدرج) ، والتي وضعت لأول مرة لتنقية واستقرار المجمعات الجزيئية الكلية للجسيم واحد المجهر الكريكترون المبرد ، لتحديد التفاعلات بين عوامل الربط التي تربط عابرة لمجمع الربط. وتستند هذه الطريقة إلى الطرد المركزي للعينات في تركيز متزايد من كاشف التثبيت لتحقيق الاستقرار في المجمعات. بعد الطرد المركزي من خلاصات الخميرة الإجمالية المحملة على تدرجات الجلسرين ، يتم تحليل الكسور المستردة بواسطة نقطة لطخة لتحديد المجمعات الفرعية اللصق وتحديد وجود عوامل الربط الفردية.

لتحليل الملف الشخصي للترسيب Cwc24-TAP وتحديد ما إذا كانت طريقة Grafix فعالة لتحقيق الاستقرار في ربطها بالربط subcomplexes ، فصلنا إجمالي مستخلصات الخميرة من الخلايا التي تعبر عن Cwc24-TAP من خلال الطرد المركزي على تدرجات الجلسرين ، في وجود أو عدم وجود glutaraldehyde كعامل ربط متقاطع. ثم تم تحليل عينات من أربعة وع?...

Watch this Scientific Journal Video about Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes at JoVE.com

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

هنا، ونحن نصف استخدام Grafix (تثبيت التدرج)، والطرد المركزي التدرج الجلسرين في وجود crosslinker، لتحديد التفاعلات بين عوامل الربط التي تربط عابرا إلى مجمع اللصق.

استخدام Grafix للكشف عن المتفاعلات العابرة من Saccharomyces cerevisiae التشبيكليسومات الفرعية

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

دراسة التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتين كيناز المنشط الجيش الملكي النيبالي خلال دورة الخلية الثديية

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

دراسة عن الأيض من المبيدات الحشرية النظامية الستة في ثقافة تعليق الخلية المنشأة حديثا المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) يترك

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

وضع العلامات والتصور لمنتجات التعبير الجينوم الميتوكوندريا في خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

تحليل توليف الدهون المحايدة في Saccharomyces cerevisiae بواسطة وضع العلامات الأيضية وكروماتوغرافيا طبقة رقيقة

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

إعداد و Cryo-FIB micromachining من Saccharomyces cerevisiae للتصوير المقطعي كريو إلكترون

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

تنقية القنوات المحتملة لمستقبلات ذبابة الفاكهة العابرة الذاتية المنشأ

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

حركية الجزيئات المفردة ومجموعات الكينيسين-5 Cin8 ثنائية الاتجاه المنقاة من خلايا S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...