Name: utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes
Uploaded: 2020-11-09T15:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק FAPESP (15/06477-9).

1. הכנת תמצית שמרים
<ol><li>לגדל את תאי שמרים המביעים את אחד הגורמים splicing התמזגו תג TAP9 ב 1 L YNB-דבק מדיה (שמרי חנקן בסיס בתוספת 2% מ '/v גלוקוז) עם חומצות אמינו מתאימות או בסיסים גרעיניים, במקרה זה, אדנין (20 מיקרוגרם / מ"ל), לאוצין (30 מיקרוגרם / מ"ל), טריפטופן (30 מיקרוגרם / מ"ל), עד OD600 = 1.0.<...

<ol>
	<li>Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., L&#252;hrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+nuclear+pre-mRNA+splicing+in+higher+eukaryotes.">Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).</li><li>Yan, C., Wan, R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+pre-mRNA+splicing+through+structural+biology+of+the+spliceosome.">Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).</li><li>Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+regulation+of+spliceosomal+RNA+helicases.">Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).</li><li>Kastner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GraFix:+sample+preparation+for+single-particle+electron+cryomicroscopy.">GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy.</a> Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).</li><li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafix:+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM.">Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).</li><li>Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+yeast+activated+spliceosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 353 (6302), 895-904 (2016).</li><li>Ohi, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+revelas+stable+multiprotein+complexes+in+both+fission+and+budding+yeasts+containing+Myb-related+Cdc5p/Cef1p,+novel+pre-mRNA+splicing+factors,+and+snRNAs.">Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).</li><li>Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+yeast+mutant+RNA+exosome+complexes.">Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterizatioin+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+yeast+splicing+extract.">Preparation and fractionation of yeast splicing extract.</a> Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).</li><li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3'+splice+site+selection.">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes &amp; Development. 9, 855-868 (1995).</li><li>Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+yeast+whole+cell+splicing+extract.">Preparation of yeast whole cell splicing extract.</a> Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).</li><li>Hill, H. D., Straka, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+using+bicinchoninic+acid+in+the+presence+of+sulfhydryl+reagents.">Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents.</a> Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).</li><li>Cepeda, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+assembly+factor+Nop53+controls+association+of+the+RNA+exosome+with+pre-60S+particles+in+yeast.">The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).</li><li>Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mRNA+splicing+in+vitro.">Yeast mRNA splicing in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).</li></ol>

חלבון-חלבון וחומצות ריבונוקלאיות-חלבון אינטראקציות ניתן לייצב באמצעות חומרים crosslinking. חשוב כי המתחם המתקבל יציב לעמוד ultracentrifugation על מעבר צבע גליצריול. בנוסף, תנאי המאגר אמורים לאפשר את האינטראקציה, אך מחמירים מספיק כדי להימנע מאיגוד לא ספציפי. בניסויים המוצגים כאן, השתמשנו בפתרון חיץ שכבר...

שכפול הוא תהליך דינמי ביותר הדורש כריכה ושחרור של מספר רב של גורמים באופן מתואם. גורמי חוג אלה כוללים חלבונים מחייבים RNA, ATPases, helicases, קינאז חלבון ופוספטסות, רצועות בכל מקום, בין היתר1,2,3; ולאפשר את הסידורים המולקולריים להתקיים, חלק מהגורמים האלה נקשרים באופן ארעי מאוד לתת-קומפלקסים של spliceosome, מה שהופך את הבידוד והזיהוי של מתחמי ביניים אלה RNP מאתגרים מאוד.
כאן, השתמשנו בשיטת Grafix4,5 כדי לייצב את האינטראקציה של גורם חיבור שמרים Cwc24 עם קומפלקסB act 6 כדי לאפשר זיהוי של גורמים אחרים הקשורים במקביל לתת-קומפלקס זה ולקבוע אם ligase Ubiquitin Prp19 ממלא תפקיד כלשהו בכריכה או שחרור של Cwc24 למתחם תשע עשרה (NTC) ולסוף 5 ' של האינטרון לפני ההפעלה ותגובת הטרנססטרציה הראשונה לוקחת מקום. היתרון של חשיפת macromolecules לריכוז הולך וגדל של crosslinker לאורך שיפוע הגליצריול הוא שהוא נמנע בין מתחמים crosslinks4,5, ולכן, היווצרות של אגרגטים.
שיטה זו שימשה כהשלמה לקוימונופרציפיטציה של חלבון ובדיקות משיכה, שלמרות שאפשרו בידוד של מתחמים גדולים, לא יכול להיות אמין לשמירה על אינטראקציות חולפות בתוך מתחמים דינמיים גדולים7,8. השימוש ריאגנטים קיבעון בשיפוע הגליצריול מייצב את הכריכה של גורמים כאלה, ומאפשר אישור של אינטראקציות של חלבונים ספציפיים עם subcomplexes חוג. מכיוון שהקישור הנבחר היה בלתי הפיך מבחינה כימית, חלבונים שנמצאים בשברים שנמצאו נותחו על ידי כתם נקודה לאחר צנטריפוגת ההדרגה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-Rabbit IgG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EconoSystem</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1-800-424-6723</td>
			<td>Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Recovery System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>270-331580</td>
			<td>Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Master Model 107ip</td>
			<td>Biocomp</td>
			<td>107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>207460001</td>
			<td>Ball Mill device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor F12-6x500Lex</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>096-062375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor P40ST</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge CP 80 NX</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>901069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes

שיתוף טרום-mRNA הוא תהליך דינמי מאוד הכולל סידורים מולקולריים רבים של תת-קומפלקסים spliceosome במהלך הרכבה, עיבוד RNA, ושחרור של הרכיבים המורכבים. צנטריפוגציה הדרגתית גליצל שימשה להפרדת חלבונים או מתחמי RNP (RiboNucleoProtein) למחקרים פונקציונליים ומבניים. כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), אשר פותח לראשונה כדי לטהר ולייצב מתחמים macromolecular עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונים חלקיק יחיד, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי חוג שנקשרים ארעית למתחם spliceosome. שיטה זו מבוססת על צנטריפוגה של דגימות לריכוז הולך וגדל של ריאגנט קיבעון לייצוב מתחמים. לאחר צנטריפוגה של שמרים סה"כ תמציות טעון על שיפועים גליצריול, שברים התאושש מנותחים על ידי כתם נקודה לזיהוי של תת-מתחמים spliceosome וקביעה של נוכחות של גורמי splicing בודדים.

כדי לנתח את פרופיל המשקעים של Cwc24-TAP ולקבוע אם שיטת Grafix הייתה יעילה לייצוב האיגוד שלה לשיתוף תת-קומפלקסים, הפרדנו בין תמציות שמרים כוללות של תאים המבטאים Cwc24-TAP באמצעות צנטריפוגציה על שיפועי גליצול, בנוכחות או היעדר גלוטרלדהיד כסוכן קישור צולב. דגימות של עשרים וארבעה שברי μL 500 נותחו לאחר מכן...

Watch this Scientific Journal Video about Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes at JoVE.com

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), צנטריפוגה הדרגתית גליצריול בנוכחות crosslinker, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי שיתוף שנקשרים באופן חולף לקומפלקס spliceosome.

ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (Camellia Sinensis L.) עלים

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

טיהור של תעלות פוטנציאליות של קולטן חולף דרוזופילה אנדוגנית

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של קינסין-5 Cin8 דו-כיווני מטוהרים מתאי S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...