Name: utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes
Uploaded: 2020-11-09T15:45:00
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इस काम को एफएपीईपी ग्रांट (15/06477-9) ने सपोर्ट किया ।

1. खमीर कुल निकालने की तैयारी
<ol><li>खमीर कोशिकाओं को 1 एल YNB-ग्लू मीडिया में टैप टैग9 में शामिल करने वाले स्प्लिसिंग कारकों में से एक को व्यक्त करें (खमीर नाइट्रोजन आधार 2% मीटर/वी ग्लूकोज के साथ पूरक) ?...

<ol>
	<li>Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., L&#252;hrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+nuclear+pre-mRNA+splicing+in+higher+eukaryotes.">Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).</li><li>Yan, C., Wan, R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+pre-mRNA+splicing+through+structural+biology+of+the+spliceosome.">Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).</li><li>Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+regulation+of+spliceosomal+RNA+helicases.">Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).</li><li>Kastner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GraFix:+sample+preparation+for+single-particle+electron+cryomicroscopy.">GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy.</a> Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).</li><li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafix:+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM.">Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).</li><li>Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+yeast+activated+spliceosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 353 (6302), 895-904 (2016).</li><li>Ohi, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+revelas+stable+multiprotein+complexes+in+both+fission+and+budding+yeasts+containing+Myb-related+Cdc5p/Cef1p,+novel+pre-mRNA+splicing+factors,+and+snRNAs.">Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).</li><li>Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+yeast+mutant+RNA+exosome+complexes.">Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterizatioin+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+yeast+splicing+extract.">Preparation and fractionation of yeast splicing extract.</a> Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).</li><li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3'+splice+site+selection.">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes &amp; Development. 9, 855-868 (1995).</li><li>Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+yeast+whole+cell+splicing+extract.">Preparation of yeast whole cell splicing extract.</a> Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).</li><li>Hill, H. D., Straka, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+using+bicinchoninic+acid+in+the+presence+of+sulfhydryl+reagents.">Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents.</a> Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).</li><li>Cepeda, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+assembly+factor+Nop53+controls+association+of+the+RNA+exosome+with+pre-60S+particles+in+yeast.">The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).</li><li>Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mRNA+splicing+in+vitro.">Yeast mRNA splicing in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).</li></ol>

प्रोटीन-प्रोटीन और राइबोन्यूक्लिक एसिड-प्रोटीन इंटरैक्शन को क्रॉसलिंकिंग एजेंटों का उपयोग करके स्थिर किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि परिणामी परिसर ग्लिसरोल ढाल पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन का स?...

स्प्लिसिंग एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है जिसके लिए समन्वित तरीके से कई कारकों को बाध्यकारी और जारी करने की आवश्यकता होती है। इन स्प्लिसिंग कारकों में आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन, एटीपीस, हेलीकेस, प्रोटीन किनासेस और फॉस्फेट, सर्वव्यापी लिगास शामिल हैं, अन्य1,2,3; और आणविक पुनर्व्यवस्थाओं को लेने की अनुमति देने के लिए, इनमें से कुछ कारक स्प्लिकोसोम सबकॉम्टेक्स के लिए बहुत क्षणिक रूप से बांधते हैं, जिससे इन आरएनपी मध्यवर्ती परिसरों का अलगाव और पहचान बहुत चुनौतीपूर्ण हो जाती है।
यहाँ, हमने बीएक्ट कॉम्प्लेक्स6के साथ खमीर स्प्लिसिंग फैक्टर Cwc24 की बातचीत को स्थिर करने के लिए ग्रेफिक्स विधि 4,5 का उपयोग किया ताकि उस सबकॉम्प्लेक्स के साथ-साथ अन्य कारकों की पहचान की अनुमति दी जा सके और यह निर्धारित किया जा सके कि क्या यह निर्धारित किया गया है कि क्या सर्वव्यापी ligase Prp19 उन्नीस (एनटीसी) परिसर के लिए Cwc24 के बाध्यकारी या रिहाई में किसी भी भूमिका निभाता है और सक्रियण से पहले intron के 5 ' अंत करने के लिए और पहली ट्रांसेस्टरिफिकेशन प्रतिक्रिया लेता है स्थान। ग्लिसरॉल ढाल के साथ क्रॉसलिंकर की बढ़ती एकाग्रता के लिए मैक्रोमॉलिक्यूल्स को उजागर करने का लाभ यह है कि यह इंटर-कॉम्प्लेक्स क्रॉसलिंक4, 5से बचाता है, और इसलिए, समुच्चय कागठन।
इस विधि का उपयोग प्रोटीन कोइमानोप्रिपिcipitेशन और पुल-डाउन परख के पूरक के रूप में किया जाता था, जो बड़े परिसरों के अलगाव की अनुमति देने के बावजूद, बड़े गतिशील परिसरों7,8के भीतर क्षणिक बातचीत को बनाए रखने के लिए विश्वसनीय नहीं हो सकता है। ग्लिसरोल ढाल में फिक्सेशन रिएजेंट्स का उपयोग ऐसे कारकों के बाध्यकारी को स्थिर करता है, जिससे सबकॉम्टेक्स के साथ विशिष्ट प्रोटीन की बातचीत की पुष्टि होती है। क्योंकि चुना क्रॉसलिंकर रासायनिक रूप से अपरिवर्तनीय था, बरामद अंशों में मौजूद प्रोटीन ढाल अपकेंद्रित्र के बाद डॉट दाग द्वारा विश्लेषण किया गया ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-Rabbit IgG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EconoSystem</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1-800-424-6723</td>
			<td>Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Recovery System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>270-331580</td>
			<td>Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Master Model 107ip</td>
			<td>Biocomp</td>
			<td>107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>207460001</td>
			<td>Ball Mill device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor F12-6x500Lex</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>096-062375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor P40ST</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge CP 80 NX</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>901069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes

प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग एक बहुत ही गतिशील प्रक्रिया है जिसमें असेंबली, आरएनए प्रसंस्करण और जटिल घटकों की रिहाई के दौरान स्प्लिकोसोम सबकॉम्टेक्स के कई आणविक पुनर्व्यवस्था शामिल हैं। कार्यात्मक और संरचनात्मक अध्ययनों के लिए प्रोटीन या आरएनपी (रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन) परिसरों को अलग करने के लिए ग्लाइस्रोल ग्रेडिएंट अपकेंद्रित्र का उपयोग किया गया है। यहां, हम ग्रेफिक्स (ग्रेडिएंट फिक्सेशन) के उपयोग का वर्णन करते हैं, जिसे पहले एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए मैक्रोमॉलिकुलर परिसरों को शुद्ध और स्थिर करने के लिए विकसित किया गया था, जो स्प्लिसिंग कारकों के बीच बातचीत की पहचान करने के लिए है जो स्प्लिकोसोम कॉम्प्लेक्स में क्षणिक रूप से बांधते हैं। यह विधि परिसरों को स्थिर करने के लिए एक निर्धारण अभिवाचित की बढ़ती एकाग्रता में नमूनों के अपकेंद्रण पर आधारित है। ग्लाइसरोल ग्रेडिएंट्स पर लोड किए गए खमीर कुल अर्क के अपकेंद्रित्र होने के बाद, बरामद अंशों का विश्लेषण स्लिसियोसोम उप-परिसरों की पहचान और व्यक्तिगत स्प्लिसिंग कारकों की उपस्थिति के निर्धारण के लिए डॉट दाग द्वारा किया जाता है।

Cwc24-TAP के तलछट प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करने और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ग्रेफिक्स विधि सबकॉम्टेक्स को स्प्लिस करने के लिए अपने बाध्यकारी को स्थिर करने के लिए प्रभावी थी, हमने एक क्रॉसलिंकिंग एजेंट ...

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Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

यहां, हम एक क्रॉसलिंकर की उपस्थिति में ग्लाइस्रोल ग्रेडिएंट अपकेंद्रित्र, ग्रेफिक्स (ग्रेडिएंट फिक्सेशन) के उपयोग का वर्णन करते हैं, जो स्प्लिकोसोम कॉम्प्लेक्स में क्षणिक रूप से बांधने वाले स्प्लिसिंग कारकों के बीच बातचीत की पहचान करता है।

सैकरोमाइसेस सेर्विसियाई स्पलिसिओसोम सबकॉम्प्लेक्स के क्षणिक इंटरप् इंटरेक्टर्स का पता लगाने के लिए ग्रेफिक्स का उपयोग

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

स्तनधारी कोशिका चक्र के दौरान सक्रिय प्रोटीन काइनेज आरएनए के आरएनए इंटरएक्टर्स का अध्ययन

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

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चाय से व्युत्पन्न एक नव स्थापित सेल निलंबन संस्कृति में छह प्रणालीगत कीटनाशक के चयापचय पर अध्ययन(कैमेलिया Sinensis एल.) पत्ते

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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सचारोमाइसेस सेरेविसी के सेलुलर लिपिडोम का मात्रात्मक विश्लेषण टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

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बेकर के खमीर सैचरोमाइसेस सेरेविसिया में माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम अभिव्यक्ति उत्पादों की लेबलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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सैकरोमाइसेस सेरेविसिया के मात्रात्मक मेटाबोलोमिक्स ने मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

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मेटाबोलिक लेबलिंग और पतली परत क्रोमेटोग्राफी द्वारा सैकरोमाइसेस सेर्विसिया में तटस्थ लिपिड संश्लेषण का विश्लेषण

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

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क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सैकरोमाइसेस सेर्विसिया की तैयारी और क्रायो-एफआईबी माइक्रोमशीनिंग

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

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नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiae में Submitochondrial प्रोटीन स्थानीयकरण का आकलन

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

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अंतर्जात ड्रोसोफिला क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनलों की शुद्धि

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

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एकल अणुओं की गतिशीलता और द्वि-दिशात्मक किनेसिन -5 Cin8 के समूहों को एस सेरेविसिया कोशिकाओं से शुद्ध किया गया

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...