Name: utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes
Uploaded: 2020-11-09T15:45:00
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1. 효모 총 추출물 준비
<ol><li>TAP태그9에 융합된 접합인자 중 하나를 발현하는 효모 세포를 성장시키는 데 적합한 아미노산 또는 핵염기와 함께 L YNB-glu 미디어(효모 질소 기준 2%m/v 포도당으로 보충됨), 이 경우 아데닌(20 μg/mL), 류신(30 μg/mL), 트립토판(30 μg/mL), OD600 = 1.0까지.</li>
	<li>1L 배양으로부터 100mL 원심분리기 병 3개에서 17,000x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분?...

<ol>
	<li>Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., L&#252;hrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+nuclear+pre-mRNA+splicing+in+higher+eukaryotes.">Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).</li><li>Yan, C., Wan, R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+pre-mRNA+splicing+through+structural+biology+of+the+spliceosome.">Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).</li><li>Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+regulation+of+spliceosomal+RNA+helicases.">Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).</li><li>Kastner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GraFix:+sample+preparation+for+single-particle+electron+cryomicroscopy.">GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy.</a> Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).</li><li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafix:+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM.">Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).</li><li>Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+yeast+activated+spliceosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 353 (6302), 895-904 (2016).</li><li>Ohi, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+revelas+stable+multiprotein+complexes+in+both+fission+and+budding+yeasts+containing+Myb-related+Cdc5p/Cef1p,+novel+pre-mRNA+splicing+factors,+and+snRNAs.">Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).</li><li>Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+yeast+mutant+RNA+exosome+complexes.">Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterizatioin+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).</li><li>Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+yeast+splicing+extract.">Preparation and fractionation of yeast splicing extract.</a> Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).</li><li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3'+splice+site+selection.">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes &amp; Development. 9, 855-868 (1995).</li><li>Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+yeast+whole+cell+splicing+extract.">Preparation of yeast whole cell splicing extract.</a> Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).</li><li>Hill, H. D., Straka, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+using+bicinchoninic+acid+in+the+presence+of+sulfhydryl+reagents.">Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents.</a> Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).</li><li>Cepeda, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+assembly+factor+Nop53+controls+association+of+the+RNA+exosome+with+pre-60S+particles+in+yeast.">The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).</li><li>Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mRNA+splicing+in+vitro.">Yeast mRNA splicing in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).</li></ol>

단백질 단백질 및 리보핵산 단백질 상호 작용은 교차 연결제를 사용하여 안정화될 수 있다. 결과 복합체는 글리세롤 그라데이션에 대한 초원심분리를 견딜 수 있는 안정성이 있는 것이 중요합니다. 또한 버퍼 조건은 상호 작용을 허용해야하지만 비특정 바인딩을 피할 수 있을 만큼 엄격해야 합니다. 여기에 표시된 실험에서, 우리는 이미 시험관 내 접합 반응(15)에대해 확립 된 ?...

접합은 조정된 방식으로 다양한 요인의 바인딩 및 방출이 필요한 매우 역동적인 프로세스입니다. 이러한 접합 요인은 RNA 결합 단백질, ATPases, 헬리케이스, 단백질 키나아제 및 인산염, 유비퀴틴 리개세, 그 외1,2,3을포함한다. 그리고 분자 재배열이 일어날 수 있도록, 이러한 요인 중 일부는 매우 일시적인 이 RNP 중간 복합체의 격리 및 식별을 매우 어렵게 만듭니다.
여기서, 그라픽스 법4,5는 B액트 복합체 6과 효모 접합인자 Cwc24의 상호작용을 안정화하고, 유비퀴틴 리구아제 Prp19가 19(NTC)의 결합 또는 방출에 어떤 역할을 하는지 여부를 결정하기 위해B액트 복합체6을 사용하였다. 장소. 글리세롤 그라데이션을 따라 크로스링커의 농도가 증가하는 거시분자를 노출시키는 장점은 복합간 교차링크4,5,따라서 골재형성을 피한다는 것이다.
이 방법은 단백질 면역 침전 및 풀다운 분석에 대한 보완으로 사용되었으며, 이는 큰 복합체의 분리를 허용함에도 불구하고 큰 동적복합체7,8내에서 과도 상호 작용을 유지하는 데 신뢰할 수 없을 수 있다. 글리세롤 그라데이션에서 고정 시약을 사용하면 이러한 요인의 결합을 안정화시켜 접합 서브콤플렉스와 특정 단백질의 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 선택된 크로스링커는 화학적으로 돌이킬 수 없기 때문에, 회수된 분획에 존재하는 단백질은 그라데이션 원심분리 후 점블롯에 의해 분석되었다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-Rabbit IgG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EconoSystem</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1-800-424-6723</td>
			<td>Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Recovery System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>270-331580</td>
			<td>Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Master Model 107ip</td>
			<td>Biocomp</td>
			<td>107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 200</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>207460001</td>
			<td>Ball Mill device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor F12-6x500Lex</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>096-062375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinging Bucket Rotor P40ST</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge CP 80 NX</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>901069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes

pre-mRNA 접합은 복잡한 성분의 조립, RNA 처리 및 방출 중에 화려한 하위 복합체의 많은 분자 재배열을 포함하는 매우 역동적인 과정입니다. 글리세롤 그라데이션 원심분리는 기능적 및 구조적 연구를 위해 단백질 또는 RNP(RiboNucleoProtein) 복합체의 분리를 위해 사용되어 왔다. 여기서는 단일 입자 저온 전자 현미경 검사법을 위한 거대 분자 복합체를 정화하고 안정화하기 위해 처음 개발된 Grafix(그라픽스(Gradient Fixation)의 활용을 설명하며, 이는 스플렉션 컴플렉스에 일시적으로 결합되는 접합 인자 간의 상호 작용을 식별합니다. 이 방법은 시료의 원심분리를 복합체안정화를 위한 고정 시약의 농도증가로 기초한다. 글리세롤 그라데이션에 적재된 효모 총 추출물의 원심분리 후, 회수된 분획은 점블롯에 의해 분석되어 개별 접합 인자의 존재의 현물 및 의결을 위해.

Cwc24-TAP의 퇴적 프로파일을 분석하고 Grafix 방법이 서브콤플렉스를 접합하는 데 결합을 안정화시키는 데 효과적인지 여부를 결정하기 위해, 우리는 글리세롤 그라데이션에 원심분리를 통해 Cwc24-TAP를 표현하는 세포의 총 효모 추출물을 분리하여 교차 연결제로 글루타랄데히드의 존재 또는 부재에 있다. 24μL 분획의 샘플은 TAP 태그의 CBP 부분에 대한 항체를 가진 슬롯 블롯에 의해 분석되었다. 결과?...

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Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

여기서는 크로스링커가 있는 글리세롤 그라데이션 원심분리인 그라픽스(Gradient Fixation)의 활용을 설명하여 쌍향적인 복합체에 일시적으로 결합하는 접합 요인 간의 상호 작용을 식별합니다.

사카로미세스 세레비시아스 스플리케소터 서브콤플렉스의 과도성 행위자 검출을 위한 그라픽스의 활용

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

연구

생화학

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

차에서 파생된 새로 설립된 세포 현탁액 배양에서 6개의 전신 살충제의 물질대사에 관한 연구(동백나무시넨시스 L.) 잎

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

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베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

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대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

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냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

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신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

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내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

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S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...